EGCG調(diào)控Nrf2對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的改善作用

左振岐,劉春輝

(1.佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯154000;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯154000)

阿霉素(doxorubicin,Dox)做為臨床常用的化療藥,嚴(yán)重的心臟毒性限制了其臨床上的應(yīng)用。目前普遍認(rèn)DOX引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體損傷等,還有一些研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞鐵死亡與其有著緊密的聯(lián)系[1-2]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是從綠茶中分離出來得到的一種具有抗炎、抗氧化作用最有效的兒茶素類單體[3-4]。研究表明EGCG可有效緩解阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[3],但其具體機(jī)制尚不清楚。本研究在體外建立阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型,觀察細(xì)胞損傷模型中鐵死亡的改變,探討EGCG的保護(hù)作用途徑與NRF2及鐵死亡的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠H9c2心肌細(xì)胞購自于中喬新舟生物科技公司。Dox、EGCG,ML385均購自于美國MCE公司;CCK8細(xì)胞活力檢測試劑盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、血清鐵(Fe2+)試劑盒均購自于南京建成生物有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶細(xì)胞消化液、活性氧(ROS)、線粒體膜電位檢測試劑盒均購自于碧云天公司;,一抗GPX4、NRF2、FPN1、HO-1,GAPDH、二抗山羊抗兔購自于abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

大鼠H9c2心肌細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2天進(jìn)行傳代一次,選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞分為4組:control組、DOX組(5 μmol·L-1DOX)、EGCG+DOX組(10 μmol·L-1的EGCG和5 μmol·L-1的DOX)、EGCG+DOX+ML385組(10 μmol·L-1的EGCG、5 μmol·L-1的DOX和2.5 μmol·L-1的ML385)。

1.3 DCFH-DA探針法檢測ROS

選用對數(shù)生長期H9C2細(xì)胞,按control組、DOX組、DOX+EGCG組、DOX+EGCG+ML385組接種到12孔板中,去掉細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS洗一遍,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。充分混勻去細(xì)胞培養(yǎng)液加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37℃培養(yǎng)箱孵育20 min,離心,用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。用熒光顯微鏡鏡檢測及采圖,選擇紅色熒光的強(qiáng)弱來表示細(xì)胞ROS的含量。

1.4 線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞按照1.3的分組接種到12孔板中,去掉細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS洗一遍,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照試劑盒說明書配制JC-1染色工作液,吸除12孔板中原培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞一次,加入0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液,再加入0.5 ml JC-1工作液,充分混勻。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。染色結(jié)束后,吸除上清,用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,用紅/綠光的平均光密度值來表示線粒體膜電位的高低。

1.5 MDA、SOD、GSH、Fe2+檢測

H9C2細(xì)胞的培養(yǎng)、分組同1.3,取細(xì)胞的上清液,按照試劑盒說明書進(jìn)行配制試劑。根據(jù)公式計算出MDA、SOD、GSH、Fe2+的含量。

1.6 Western blot檢測

按照1.3進(jìn)行細(xì)胞分組,加入RIPA總蛋白裂解液提取各組蛋白,使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。在蛋白樣品中加入適當(dāng)量的蛋白上樣緩沖液,95～100℃沸水浴5 min。然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,室溫封閉1 h后,加入稀釋好的GAPDH(1∶6 000)、GPX4(1∶2 000)、NRF2(1∶5 000)、FPN1(1∶2 000)、HO-1(1∶2 000)一抗4℃下孵育過夜,加入稀釋好的二抗,室溫孵育30 min,暗室顯影,將膠片掃描存檔,IPWIN60軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),兩組以上比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中ROS含量的影響

DOX組與control相比,可以顯著增加細(xì)胞中ROS的含量(P<0.01)。加入EGCG后,與DOX組相比,EGCG+DOX組可以顯著減低細(xì)胞中ROS的含量(P<0.01),表明EGCG可以有效降低細(xì)胞中的ROS。與EGCG+DOX組相比DOX+EGCG+ML385組中ROS的含量增加(P<0.01)。見圖1。

**與control比較P<0.01;##與DOX組比較P<0.01;△△與DOX+EGCG組比較P<0.01

2.2 EGCG對阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

模型組中紅/綠色熒光的平均光密度值 與control相比,顯著減低(P<0.05)。與DOX組相比EGCG+DOX組中紅/綠色熒光的平均光密度值顯著增加(P<0.05)。與EGCG+DOX組相比DOX+EGCG+ML385組中紅/綠色熒光的平均光密度值顯著降低(P<0.05)。見圖2。

**與control組比較P<0.05;##與DOX組比較P<0.05;△△與DOX+EGCG組比較P<0.05

2.3 EGCG對阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞MDA、SOD、GSH、Fe2+的影響

DOX組與control組相比,MDA、Fe2+的含量明顯增加(P<0.01),SOD(P<0.01)、GSH(P<0.05)的含量明顯降低。與DOX組相比,EGCG+DOX組中MDA、Fe2+的含量明顯降低(P<0.01),SOD(P<0.01)、GSH(P<0.05)的含量明顯增加。與EGCG+DOX組相比,EGCG+DOX+ML385組中MDA、Fe2+的含量明顯增加,SOD、GSH的含量明顯降低(P<0.05),差異就有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

*與control組比較P<0.05;#與DOX組比較P<0.01;**與control組比較P<0.01;##與DOX組比較P<0.05;△△與DOX+EGCG組比較P<0.05

2.4 EGCG對阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表達(dá)的影響

DOX組與control組比,GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表達(dá)均發(fā)生顯著的下降(P<0.01)。與DOX組比較,加入EGCG后GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.01)。與DOX+EGCG組比較,加入ML385后GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表達(dá)明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

**與control組比較P<0.01;##與DOX組比較P<0.01;△△與DOX+EGCG組比較P<0.01

3 討論

阿霉素在臨床上是一種有效的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物,但其劑量依賴性心臟毒副作用一直是治療中的焦點(diǎn)[5]。目前臨床上治療和預(yù)防蒽環(huán)類藥物心臟毒性的藥物大都有不同層面的不良反應(yīng)和禁忌癥,所以尋找一種安全有效的輔助藥物來保護(hù)心臟是很有必要的。

EGCG是綠茶中最重要的活性成分,可發(fā)揮抗炎、抗氧化損傷的作用,并且對正常的組織和細(xì)胞無毒害作用[6-7]。張妍淞等[8]建立小鼠體內(nèi)DOX損傷模型發(fā)現(xiàn),EGCG對DOX誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用,同時對線粒體功能的保護(hù)作用顯著。研究發(fā)現(xiàn),EGCG可有效減少鐵離子積累,抑制細(xì)胞內(nèi)過量的ROS產(chǎn)生,從而減輕 Dox 心臟毒性誘導(dǎo)的鐵死亡[9]。該實(shí)驗(yàn)加入EGCG干預(yù)后,可明顯緩解阿霉素對心肌細(xì)胞的損傷。細(xì)胞中ROS、MDA、Fe2+水平明顯降低,而GPX4、SOD、GSH水平顯著升高。線粒體膜電位中可見JC-1紅色熒光顯著增加而綠色熒光顯著減少,說明EGCG可以有效抑制阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

鐵是機(jī)體中重要的成分,與機(jī)體的生理活動有著密切的聯(lián)系,不同的生理環(huán)境和應(yīng)激條件可能會導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[10-11]。鐵死亡是不同于其他細(xì)胞死亡形式的一種新型的細(xì)胞死亡形式[12]。其主要機(jī)制是鐵離子堆積過多導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化[13]。CAO等[14]發(fā)現(xiàn)GSH是鐵死亡中的一個敏感指標(biāo),GSH的合成增加有助于抑制鐵死亡[15]。GPX4在脂質(zhì)過氧化中扮演著守衛(wèi)者的角色,亦可看作是鐵死亡的抑制劑[16]。鐵死亡與很多疾病有著密切的關(guān)系,近年來發(fā)現(xiàn)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性可能也與其有關(guān)[17]。LIU等[18]也證實(shí)了 DOX 相關(guān)性心肌病中鐵離子及ROS的堆積過多誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。說明阿霉素可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鐵死亡。

生理狀態(tài)下,NRF2與Keap1在細(xì)胞質(zhì)中相結(jié)合,然而,由于鐵離子過多機(jī)體氧化應(yīng)激水平提高導(dǎo)致了NRF2的核轉(zhuǎn)位[19]。在鐵死亡相關(guān)基因中,大多都與NRF2有著緊密的聯(lián)系。在頭頸癌細(xì)胞中Nrf2可通過調(diào)節(jié)GPX4的過表達(dá)來抑制鐵死亡[20]。除此之外FPN1和HO-1的表達(dá)也受到NRF2的調(diào)控[21]。研究發(fā)現(xiàn),在缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型中,調(diào)節(jié)NRF2/HO-1信號通路可以抑制鐵死亡[22]。但在阿霉素?fù)p傷模型中尚不可知。本研究中發(fā)現(xiàn),在阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型中,NRF2蛋白表達(dá)減少,其下游因子GPX4、FPN1、HO-1的蛋白表達(dá)也隨同一并下降。EGCG可以明顯升高NRF2、PX4、FPN1、HO-1的蛋白表達(dá)。為了驗(yàn)證EGCG是否通過調(diào)控NRF2來改善心肌細(xì)胞鐵死亡,加入NRF2抑制劑ML385進(jìn)行干預(yù),研究表明,ML385可明顯削弱上述EGCG的作用,由此可發(fā)現(xiàn)EGCG是通過調(diào)控NRF2的表達(dá)發(fā)揮改善心肌細(xì)胞鐵死亡的作用。

綜上所述,EGCG可以有效的保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡,其分子機(jī)制可能是通過調(diào)控NRF2的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞鐵死亡的作用。本研究從鐵死亡的角度探討了EGCG對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,但僅進(jìn)行了體外細(xì)胞的驗(yàn)證,尚有不足,后續(xù)會進(jìn)行小鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。