端國超,閻明軍,陳修報(bào),,,姜 濤,劉洪波,侯詒然,楊 健

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院,無錫 214081;2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,漁業(yè)微化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,無錫 214081;3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無錫 214081)

淡水貝類背角無齒蚌(Anodontawoodiana)原產(chǎn)于中國長江和黑龍江流域[10],現(xiàn)已廣泛分布于中國各地區(qū)乃至亞洲、歐洲、北美洲和非洲[11-14],具有食用、藥用和培育珍珠等重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值[11]。此外,因其具有濾水能力強(qiáng)、生長過程無需額外投飼、抗逆性強(qiáng)且對(duì)污染物具有高吸收和低代謝性等特點(diǎn),被認(rèn)為是優(yōu)良的水質(zhì)凈化物種[11-12]。研究表明,背角無齒蚌能夠有效凈化水體中的微藻、懸浮顆粒物和重金屬(如銅、鎘、鋁、鉻)[15-17];對(duì)于氮、磷的凈化效果則受到蚌養(yǎng)殖密度、處理時(shí)間及水體富營養(yǎng)化程度等因素影響變動(dòng)較大[16-18]。例如,陳修報(bào)等[18]和Kim等[19]通過構(gòu)建微型生態(tài)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌對(duì)水體低含量亞硝酸鹽氮(0.001～0.008 mg/L)影響不明顯;李萍[20]研究結(jié)果顯示背角無齒蚌對(duì)水體較高含量亞硝酸鹽氮(0.43±0.04 mg/L)顯示出凈化作用,且去除率可達(dá)到55.8%。然而,背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度、處理時(shí)間與亞硝酸鹽氮凈化效果之間的耦合關(guān)系尚不清楚。

本研究擬通過構(gòu)建亞硝酸鹽氮污染的微型生態(tài)系統(tǒng),探究亞硝酸鹽氮脅迫下背角無齒蚌的濾水率變化,及其不同養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽氮凈化效果的耦合效應(yīng),為養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮生物凈化以及養(yǎng)殖尾水達(dá)標(biāo)排放提供參考。

1 材料與方法

1.1 背角無齒蚌來源

背角無齒蚌來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地,挑選24只同批繁養(yǎng)的規(guī)格相似的個(gè)體,殼長為11.8±0.5 cm,活體質(zhì)量為117.5±29.0 g。其中,6只蚌用于測(cè)定濾水率,試驗(yàn)前在曝氣72 h的自來水中暫養(yǎng)1周;其余18只蚌用于亞硝酸鹽氮凈化效果試驗(yàn),試驗(yàn)前在200目紗絹過濾過的池塘水中暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)期間,水溫控制在25.0±1 ℃;每天投喂一次密度約為106cells/mL小球藻(Chlorellavulgaris),攝食3 h后進(jìn)行全部換水。

1.2 濾水率的測(cè)定

將用于測(cè)定濾水率的6只背角無齒蚌隨機(jī)均分為空白組和亞硝酸鹽氮暴露組。空白組的養(yǎng)殖用水為曝氣72 h的自來水,亞硝酸鹽氮含量未檢出。鑒于江河、湖泊、水庫和池塘等養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮含量一般不超過1.0 mg/L[2],因此,亞硝酸鹽氮暴露組通過向曝氣自來水中加入亞硝酸鈉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制成亞硝酸鹽氮理論質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的溶液。參考Zhang等[21]研究方法并略加改進(jìn),測(cè)定不同組別中背角無齒蚌的濾水率(Clearance rate,CR)。具體步驟如下:在2 L玻璃呼吸室中加入密度約為106cells/mL的小球藻,每個(gè)呼吸室中放入1只背角無齒蚌,攝食時(shí)間精準(zhǔn)控制在1 h,顯微鏡檢攝食前后呼吸室中小球藻密度變化。試驗(yàn)期間的水溫保持在25.0±1 ℃。每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)組。測(cè)定結(jié)束后,將蚌解剖取出軟組織,于80 ℃干燥24 h并稱重。濾水率的計(jì)算公式為[21]:

(1)

式中:V指呼吸室中水體的體積(L);C0指呼吸室中小球藻的初始密度(cells/mL);Ct指試驗(yàn)結(jié)束后呼吸室中小球藻的密度(cells/mL);W指背角無齒蚌軟組織干重(g);T指試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間(h)。

1.3 微型生態(tài)系統(tǒng)的建立

在室內(nèi)建立12個(gè)微型生態(tài)系統(tǒng)。向12個(gè)規(guī)格為100 cm × 45 cm × 50 cm(長×寬×高)的玻璃缸分別注入100 L經(jīng)75 μm孔徑紗絹過濾的池塘水(取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地池塘)。池塘水中亞硝酸鹽氮的背景含量為0.006±0.002 mg/L。向各個(gè)玻璃缸中分別加入0.15 g亞硝酸鈉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制成亞硝酸鹽氮理論質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的養(yǎng)殖水體。之后,參考已報(bào)道的背角無齒蚌凈化水質(zhì)的養(yǎng)殖密度[18,20]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置低(放入1只蚌;養(yǎng)殖密度為10只/m3)、中(放入2只蚌;養(yǎng)殖密度為20只/m3)和高(放入3只蚌;養(yǎng)殖密度為30只/m3)密度處理組,并設(shè)置對(duì)照組(不放蚌;養(yǎng)殖密度為0只/m3)。每個(gè)組別均設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)組。此外,依據(jù)魏小飛等[16]研究結(jié)果表明背角無齒蚌在短時(shí)間內(nèi)(48 h)可有效凈化水體中的總氮,設(shè)定試驗(yàn)周期為96 h。試驗(yàn)過程中不投飼,不增氧,水溫控制在25±1 ℃。試驗(yàn)期間無蚌死亡現(xiàn)象。

1.4 養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮含量的測(cè)定

在凈水試驗(yàn)起始點(diǎn)(0 h)及開始后的24、48、72和96 h,分別于微型生態(tài)系統(tǒng)的中央位置虹吸50 mL養(yǎng)殖水體,儲(chǔ)存在聚丙烯采樣瓶中。之后,用去離子水補(bǔ)齊微型生態(tài)系統(tǒng)中的養(yǎng)殖水體至100 L。然后,使用DR6000型多參數(shù)水質(zhì)分析儀(美國,哈希公司),應(yīng)用重氮化方法,測(cè)定養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量。

1.5 去除率和凈化效率的計(jì)算方法

鑒于微型生態(tài)系統(tǒng)中亞硝酸鹽氮受到環(huán)境因素和背角無齒蚌作用的共同影響,因此,應(yīng)用去除率(Removal efficiency,RE)[22]分析背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的凈化程度:

(2)

式中:CB是各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L);CT是各時(shí)間點(diǎn)不同養(yǎng)殖密度蚌處理組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L)。RE>0表示蚌能夠?qū)喯跛猁}氮起到去除作用,而RE<0表示亞硝酸鹽氮含量不降反升。

進(jìn)而,應(yīng)用凈化效率(Purification efficiency,PE)[23]分析背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的凈化能力:

(3)

式中:CB是各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L);CT是各時(shí)間點(diǎn)不同養(yǎng)殖密度蚌處理組養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的含量(mg/L);V是指微型生態(tài)系統(tǒng)中水體積(L);t是指處理時(shí)間(h);W指蚌軟組織干重(g)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),比較空白組和亞硝酸鹽氮暴露組中背角無齒蚌的濾水率;用單因素方差分析(one-way ANOVA),比較微型生態(tài)系統(tǒng)的對(duì)照組和不同養(yǎng)殖密度蚌處理組中養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮含量,蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率(RE),以及蚌對(duì)亞硝酸鹽氮凈化效率(PE)之間的差異;用雙因素方差分析(two-way ANOVA),檢測(cè)RE、PE與蚌養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間之間的關(guān)聯(lián)性。P<0.05表示差異水平顯著。此外,用Design-Expert 10.0統(tǒng)計(jì)軟件的最小二乘法擬合RE、PE與蚌養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間之間的回歸關(guān)系,并用響應(yīng)面分析法(response surface methodology)驗(yàn)證RE和PE。

2 結(jié)果

2.1 背角無齒蚌濾水率變化

空白組中背角無齒蚌的濾水率為232.1±122.3 L/(h·kg),變化范圍為94.6～328.7 L/(h·kg)。在亞硝酸鹽氮暴露組中,背角無齒蚌的濾水率為69.0±17.7 L/(h·kg),變化范圍為58.0～89.5 L/(h·kg)。雖然亞硝酸鹽氮暴露組中背角無齒蚌的平均濾水率低于空白組,但是兩者并未達(dá)到顯著差異水平(P>0.05)。

2.2 背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的凈化效果

2.2.1 亞硝酸鹽氮含量變化

表1所示,對(duì)照組亞硝酸鹽氮含量在試驗(yàn)期間沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05);低密度處理組(10只/m3)亞硝酸鹽氮含量在72 h和96 h顯著低于24 h和48 h(P<0.05);中密度處理組(20只/m3)亞硝酸鹽氮含量在試驗(yàn)期間亦沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05);而高密度處理組(30只/m3)亞硝酸鹽氮含量在72 h和96 h顯著低于24 h和48 h(P<0.05)。表1所示,24 h后不同組別之間亞硝酸鹽氮含量沒有顯著差異(P>0.05);48 h和72 h后低密度處理組亞硝酸鹽氮含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)和中密度處理組(P<0.05);96 h后低密度處理組亞硝酸鹽氮含量與高密度處理組之間沒有顯著差異(P>0.05),但均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)和中密度處理組(P<0.05)。綜合不同組別和處理時(shí)間可見,低密度組在處理96 h后亞硝酸鹽氮含量最低。

表1 背角無齒蚌對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的凈化效果

2.2.2 去除率變化

表1所示,低密度處理組和高密度處理組對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率隨處理時(shí)間的增加而呈升高趨勢(shì),在96 h的去除率均顯著高于24 h(P<0.05);中密度處理組對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率總體保持不變(P>0.05)。表1所示,24 h后不同組別對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率沒有顯著差別(P>0.05);48 h和72 h后低密度處理組的亞硝酸鹽氮去除率顯著高于中、高密度處理組(P<0.05);96 h后低、高密度處理組的亞硝酸鹽氮去除率顯著高于中密度處理組(P<0.05)。綜合不同組別和處理時(shí)間可見,低密度組在處理96 h后亞硝酸鹽氮去除率最高。

2.2.3 凈化效率變化

表1所示,低、中和高密度處理組在試驗(yàn)期間對(duì)亞硝酸鹽氮的凈化效率均沒有發(fā)生顯著變化(P>0.05);24 h后低和高密度處理組的亞硝酸鹽氮凈化效率顯著高于中密度處理組(P<0.05);48 h、72 h和96 h后低密度處理組的亞硝酸鹽氮凈化效率顯著高于中、高密度處理組(P<0.05)。綜合不同組別和處理時(shí)間可見,低密度組在處理48 h和96 h后亞硝酸鹽氮凈化效率最高。

2.3 響應(yīng)面分析法對(duì)去除率和凈化效率的驗(yàn)證

應(yīng)用響應(yīng)面分析法建立亞硝酸鹽氮去除率(RE)、凈化效率(PE)與背角無齒蚌養(yǎng)殖密度(d)和處理時(shí)間(t)之間的回歸模型(圖1)。

圖1 背角無齒蚌對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的去除率

該模型P<0.05,表明其能夠有效耦合RE、PE與d和t之間的響應(yīng)關(guān)系。相應(yīng)的回歸方程為:

RE=166.671 17-168.944d-1.207 12t-0.037 058dt+40.830 5d2+0.016 07t2(R2=0.772 8)

PE=232.615 83-223.582 5d+0.493 82t-0.068 729dt+48.691 25d2-0.000 84t2(R2=0.956 0)

據(jù)此得出d和t的配比為10只/m3和96 h時(shí),RE和PE達(dá)到最大值,分別為67.215 7%和90.746 6 mg/(h·kg)。這與微型生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.4 影響凈化效果的因子分析

由表2可見,背角無齒蚌對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮含量的影響與養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間顯著相關(guān)(P<0.05),而與兩者的交互作用關(guān)系不顯著(P>0.05)。對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率與養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間顯著相關(guān)(P<0.05),而與其交互作用關(guān)系不顯著(P>0.05)。亞硝酸鹽氮的凈化效率與養(yǎng)殖密度顯著相關(guān)(P<0.05),而與處理時(shí)間及養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間的交互作用相關(guān)性不顯著(P>0.05)。

表2 背角無齒蚌的養(yǎng)殖數(shù)量和處理時(shí)間對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮凈化效果的影響

3 討論

3.1 背角無齒蚌濾水率的變化特征

背角無齒蚌具有強(qiáng)大的濾水能力。本研究中空白組背角無齒蚌的濾水率為232.1±122.3 L/(h·kg),與Zhou等[23]報(bào)道的背角無齒蚌平均濾水率為260 L/(h·kg)基本一致。此外,背角無齒蚌的濾水率顯著高于其他淡水貝類如三角帆蚌(Hyriopsiscuming)[24]。通過濾水作用,背角無齒蚌等水生動(dòng)物能夠直接吸收水體中的溶解態(tài)污染物[2,5],也可以通過濾食藻類等間接吸收水環(huán)境中顆粒態(tài)/結(jié)合態(tài)污染物。因此,背角無齒蚌可以通過強(qiáng)大的濾水率發(fā)揮水質(zhì)凈化作用。值得注意的是,背角無齒蚌的濾水率會(huì)受到環(huán)境因素(如水溫、污染脅迫)的影響[23-24]。本研究顯示背角無齒蚌受到亞硝酸鹽氮暴露后濾水率呈下降趨勢(shì),這可能與亞硝酸鹽氮產(chǎn)生毒性作用致使背角無齒蚌啟動(dòng)閉殼保護(hù)有關(guān)。盡管如此,可引起大部分養(yǎng)殖動(dòng)物死亡的1.0 mg/L亞硝酸鹽氮[3],并未顯著降低背角無齒蚌的濾水率,說明背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮具有高耐受性。Soucek等[25]研究發(fā)現(xiàn)淡水貝類對(duì)亞硝酸鹽氮普遍具有高耐受性,如亞硝酸鹽氮對(duì)淡水麗蚌Lampsilissiliquoidea的96 h-LC50高達(dá)176.5 mg/L。背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的耐受程度及其耐受機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的凈化效果

本研究中所有微型生態(tài)系統(tǒng)處于相同的時(shí)空環(huán)境中,試驗(yàn)期間水體亞硝酸鹽氮含量表現(xiàn)出的差異應(yīng)歸因于背角無齒蚌養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間的不同。其中,亞硝酸鹽氮的最高含量(0.66±0.12 mg/L)出現(xiàn)在中密度組處理48 h后,盡管如此,與對(duì)照組亞硝酸鹽氮含量沒有顯著差異。而最低含量(0.20±0.06 mg/L)出現(xiàn)在低密度組處理96 h后,顯著低于對(duì)照組亞硝酸鹽氮含量,相應(yīng)的去除率和凈化效率分別為(64.99±10.32)%和90.16±13.54 mg/(h·kg)。響應(yīng)面分析法驗(yàn)證了背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮去除率和凈化效率的可靠性。表明背角無齒蚌能夠?qū)︷B(yǎng)殖水體較高的亞硝酸鹽氮起到凈化作用,這支持李萍[20]的研究結(jié)論。李萍[20]在背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度為10只/m3、處理時(shí)間為43 d和58 d后,水體中的亞硝酸鹽氮含量顯著降低,且去除率可達(dá)到55.8%。值得注意的是,當(dāng)養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮含量較低時(shí)(如0.001～0.008 mg/L),背角無齒蚌難以對(duì)亞硝酸鹽氮發(fā)揮凈化作用甚至還會(huì)引起亞硝酸鹽氮含量略微升高[18-19]。這應(yīng)該是由于淡水貝類對(duì)水體中亞硝酸鹽氮等物質(zhì)循環(huán)是吸收、轉(zhuǎn)化和排泄的動(dòng)態(tài)過程[26],當(dāng)水體中亞硝酸鹽氮含量低于背角無齒蚌的正常代謝時(shí),代謝產(chǎn)物如氨氮經(jīng)氨氧化細(xì)菌硝化反應(yīng)成亞硝酸鹽氮釋放到水體中導(dǎo)致的。在背角無齒蚌對(duì)水體總磷的凈化中也存在類似的現(xiàn)象。吳中奎等[17]就發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌對(duì)清水態(tài)水體中總磷難以起到凈化作用,但是能夠顯著降低富營養(yǎng)化水體中總磷含量。

在實(shí)際應(yīng)用中,魚蚌混養(yǎng)能夠促進(jìn)養(yǎng)殖循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益“雙贏”[8-9]。例如,陳家長等[8]在循環(huán)水養(yǎng)魚池塘中吊養(yǎng)三角帆蚌,在收獲魚和蚌的同時(shí),還將養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮含量降低16.95%～45.45%。因此,利用背角無齒蚌凈化養(yǎng)殖水體/尾水中亞硝酸鹽氮是可行的。

3.3 影響背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮凈化效果的因素

基于模擬現(xiàn)實(shí)中受亞硝酸鹽氮污染的養(yǎng)殖水體,本研究顯示背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮含量與去除率均受到養(yǎng)殖密度和處理時(shí)間的顯著影響,而凈化效率僅受到養(yǎng)殖密度的顯著影響,說明蚌養(yǎng)殖密度在養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮凈化效果中起到更為關(guān)鍵的作用。Geng等[27]研究結(jié)果也顯示養(yǎng)殖密度是三角帆蚌凈化水體氨氮和總磷的關(guān)鍵因素。目前,尚未見關(guān)于不同養(yǎng)殖密度背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮污染水體凈化效果的比較研究。李萍[20]將背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度設(shè)置為10只/m3能夠?qū)⑺w亞硝酸鹽氮去除55.8%。而本研究比較了低(10只/m3)、中(20只/m3)和高(30只/m3)養(yǎng)殖密度的背角無齒蚌及其不同處理時(shí)間對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮的凈化效果,證實(shí)了低養(yǎng)殖密度對(duì)亞硝酸鹽氮的凈化效果最佳。需要注意的是,過高的養(yǎng)殖密度[28]及亞硝酸鹽氮產(chǎn)生的毒性作用[29],一方面可降低淡水貝類的濾水率[29],另一方面會(huì)增加淡水貝類的氮(包括氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮)排出率[30];氨氮和硝酸鹽氮可分別經(jīng)硝化反應(yīng)和還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮[2];從而造成養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的吸收率甚至低于生成率的情形。因此,在利用背角無齒蚌凈化養(yǎng)殖水體/尾水亞硝酸鹽氮的過程中,要根據(jù)亞硝酸鹽氮含量的實(shí)際情況設(shè)定適宜的蚌養(yǎng)殖密度。綜合李萍[20]和本研究結(jié)果,建議將背角無齒蚌的養(yǎng)殖密度設(shè)定為10只/m3以凈化養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽氮。此外,本研究顯示背角無齒蚌在10只/m3的養(yǎng)殖密度下,對(duì)亞硝酸鹽氮凈化效果隨著處理時(shí)間的延長而逐步增強(qiáng),提示延長處理時(shí)間應(yīng)該會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的凈化效果。

4 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建呼吸室和微型生態(tài)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮具有高耐受性,并能起到有效凈化作用。背角無齒蚌對(duì)亞硝酸鹽氮的去除率和凈化效率分別可高達(dá)(64.99±10.32)%和90.16±13.54 mg/(h·kg)。在利用背角無齒蚌進(jìn)行養(yǎng)殖水體/尾水的亞硝酸鹽氮的凈化過程中,建議將蚌養(yǎng)殖密度設(shè)定為10只/m3。