歐陽輝，林星瑾，王金英，沈龍彬，王成棟

1 暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630；

2 暨南大學，廣東 廣州 510620

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種由多因素引起的以軟骨侵蝕、滑膜炎癥、軟骨下骨增厚及骨贅形成為病理改變，涉及關節(jié)及關節(jié)周圍組織結構病變的全關節(jié)疾病。危險因素包括年齡、性別、肥胖、創(chuàng)傷和代謝等［1-3］。KOA 在我國的致殘率約為53%，是第三大致殘疾病［4］。其發(fā)病主要涉及關節(jié)軟骨的合成和分解代謝的失衡，細胞因子的啟動與其密切相關。研究顯示，骨關節(jié)炎病理改變涉及軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞、滑膜中的成纖維細胞和單核細胞等多種細胞類型［5］。關節(jié)軟骨損傷后白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）高表達，其中IL-1β 和TNF-α 是促進炎癥發(fā)展及誘導軟骨下骨破壞的關鍵細胞因子，其出現(xiàn)于KOA 的多條致病信號通路中，調控KOA 的細胞內(nèi)活動，在軟骨細胞破壞、細胞外基質減少、軟骨重塑異常、軟骨下骨化和滑膜炎癥等病理過程中扮演重要的角色［5-6］。目前臨床不斷尋求藥物或非藥物治療方法來調控軟骨代謝或阻斷促炎因子的表達，以期促進軟骨修復或抑制軟骨破壞［7-8］。國內(nèi)外指南均提倡針對KOA 以非藥物治療為首選，包括患者教育、運動治療及物理治療等［9-10］。超聲治療作為一種無創(chuàng)安全的物理治療手段，在KOA 的治療上已經(jīng)有60多年的歷史［11］，研究較多且療效較好的強度為0.02～1 W/cm2、頻率為1～3 MHz 的低強度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）。LIPUS 作用于KOA 具有減輕關節(jié)炎癥、緩解疼痛、促進軟骨再生和保護軟骨的作用［12-13］。通過對LIPUS 作用于KOA 炎癥相關信號通路的研究進展進行綜述，可以為LIPUS的臨床應用尋找最佳干預方案。

1 LIPUS的作用機制

LIPUS 是一種機械波，其聲能可通過介質傳播到組織間和細胞內(nèi)，在組織細胞內(nèi)產(chǎn)生微氣泡和微射流，引起分子間的振動和碰撞，產(chǎn)生非熱效應和熱效應，從而使組織細胞產(chǎn)生一系列生物效應。其中非熱效應主要包括空化效應、聲流和機械刺激等［14］。而關節(jié)組織對機械刺激非常敏感，適度的機械刺激可調節(jié)關節(jié)的穩(wěn)態(tài)，維持軟骨的正常代謝［15］。既往研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 通過非熱效應在治療骨折和骨不連等方面具有良好的療效［16-17］，另外LIPUS在控制炎癥和促進軟組織修復等方面也具有良好作用［18-19］。與其他強度的治療性超聲相比，LIPUS 具有最小的熱效應，且能將聲能定向傳遞到靶組織中，在生物信號傳遞上具有優(yōu)越性［14］。利用LIPUS這一特性，可以調控膝骨關節(jié)中細胞的信號通路，改變細胞的理化性質，促進細胞新陳代謝，控制膝骨關節(jié)的炎癥。

2 LIPUS對膝骨關節(jié)炎作用的信號通路研究

近年來LIPUS 已廣泛應用于KOA 的臨床治療，LIPUS 與藥物或其他治療方法聯(lián)合應用對KOA 的疼痛、膝關節(jié)功能改善、炎癥控制和關節(jié)軟骨修復等方面具有明顯的治療優(yōu)勢。高明霞等［20］應用LIPUS 聯(lián)合藥物干預KOA 患者6 周后，與單獨應用藥物組對比，在視覺模擬評分（visual analogue scale，VAS）、西安大略和麥克馬斯特大學骨關節(jié)炎指數(shù)（Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index，WOMAC）及Lysholm 膝關節(jié)評分（Lysholm knee score scale，LKSS）方面改善更明顯，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。亦有針對KOA 患者的臨床研究將口服藥物與LIPUS 聯(lián)合使用，相較單獨口服雙氯芬酸鈉組患者血清組織金屬蛋白酶抑制因子-2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP-2）的生成增加而關節(jié)軟骨基質金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）的表達減少更顯著，顯示LIPUS 對軟骨修復有積極作用［21］。除了運用量表與血清學檢測作為評估療效的手段外，通過影像學MRI 檢測，也能觀察到超聲聯(lián)合藥物對關節(jié)軟骨的修復作用，從不同角度揭示了藥物聯(lián)合超聲治療KOA 的機制［22］。此外，非藥物聯(lián)合治療的臨床應用也逐漸興起，如王廣等［23］運用本體感覺聯(lián)合LIPUS 與單純本體感覺訓練治療KOA 患者12周，通過比較其VAS、WOMAC 及跌倒效能量表評分（modified fall efficacy scale，MFES），結果顯示前者改善更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明LIPUS 在各類聯(lián)合治療中對KOA 的抗炎作用。KOA 的發(fā)病和治療機制并不依賴于單個細胞因子，相同的信號通路可以被不同的細胞因子激活。在LIPUS 對KOA 炎癥相關信號通路作用機制的研究中，基礎研究主要包括對滑膜細胞、軟骨細胞和間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的作用等方面，其成果值得臨床研究借鑒，以期針對KOA的不同發(fā)病機制選擇適合的治療參數(shù)和作用靶點，并聯(lián)合不同藥物，最終提高臨床療效。

2.1 LIPUS對滑膜細胞作用

隨著人體衰老，膝關節(jié)軟骨中裂解的細胞外基質片段（如多糖和蛋白聚糖）被釋放到關節(jié)腔中，激活滑膜細胞（主要包括巨噬細胞、成纖維細胞、樹突樣滑膜細胞和內(nèi)皮細胞等［24］）上的Toll樣受體（Tolllike receptors，TLRs）、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE），以及滑膜細胞內(nèi)的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor and pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎癥小體，進一步級聯(lián)激活以核因子活化B 細胞κ輕鏈增強子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路為主要途徑的細胞內(nèi)途徑，產(chǎn)生炎性介質如IL-1β、IL-6 和TNF-α 并釋放入滑液中［25］，介導滑膜無菌性炎癥的產(chǎn)生。目前研究發(fā)現(xiàn)，LIPUS 具有抗炎的作用，LIPUS 可能通過干預滑膜細胞上的NLRP3 炎癥小體通路及自噬通路發(fā)揮抗炎作用［26-27］。2020 年的1 項研究應用脂多糖-三磷酸腺苷處理滑膜巨噬細胞，促使巨噬細胞分泌的IL-1β 顯著增加，模擬膝骨關節(jié)炎的炎癥過程［28］，然后進行LIPUS 的治療，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞膜中釋放出的NLRP3 炎癥小體信號通路中的關鍵酶——半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase 1）裂解受到抑制，進一步抑制前體IL-1β 的加工［29］，從而使成熟IL-1β減少。除了抑制NLRP3 炎癥小體信號通路中Caspase 1 外，這項研究還發(fā)現(xiàn)LIPUS 可以通過促進丙酮酸激酶（pyruvate kinase muscle，PKM）的自噬來抑制滑膜組織中IL-1β，或通過增強PKM 和螯合體1的結合，進而促進溶酶體等自噬小體降解PKM，抑制成熟IL-1β的產(chǎn)生，最終發(fā)揮抗炎作用［28］。見圖1。另一方面，IL-1β 等炎癥因子的刺激同時也導致成纖維細胞的增生和滑膜的纖維化。LIAO 等［30］發(fā)現(xiàn)LIPUS 可通過抑制從OA 患者滑膜中分離出的成纖維細胞上的經(jīng)典無翅型MMTV 整合位點家族蛋白（wingless-type MMTV integration site family，Wnt）/β-連環(huán)蛋白信號通路，從而抑制成纖維細胞的增殖及減少滑膜纖維化。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路作為典型的Wnt 信號通路，是KOA 的炎癥相關通路，存在于關節(jié)的滑膜和軟骨中，參與KOA 的病理過程［31］。此研究表明，LIPUS 可通過經(jīng)典Wnt 信號通路來抑制成纖維細胞增殖。以上研究闡述了LIPUS可能通過NLRP3 炎癥小體通路、自噬通路和經(jīng)典Wnt 信號通路，來分別影響滑膜中巨噬細胞和成纖維細胞的細胞活動，達到控制炎癥的效果。見圖2。

圖1 LIPUS通過干預滑膜細胞上的NLRP3炎癥小體通路及自噬通路發(fā)揮抗炎作用Figure 1 LIPUS exerts anti-inflammatory effects by interfering with the NLRP3 inflammatory vesicle pathway and autophagic pathway on synovial cells

圖2 LIPUS對滑膜細胞的作用Figure 2 Action of LIPUS on synovial cells

2.2 LIPUS對軟骨細胞作用

隨著KOA 的進展，大量炎癥因子進入滑液后刺激軟骨細胞，通過NF-κB 及MAPKs 等多種信號通路，產(chǎn)生如基質金屬蛋白酶和聚集蛋白聚糖酶等軟骨降解產(chǎn)物，介導軟骨細胞的破壞［31-33］。LIPUS 通過抑制NF-κB 通路而阻斷軟骨細胞的破壞過程。UDDIN等［34］發(fā)現(xiàn)，LIPUS的機械刺激作用可以激活人軟骨細胞上的整合素及牽張活化通道，使得IL-1β誘導的細胞質內(nèi)NF-κB 的蛋白質磷酸化被抑制，通過抑制核轉錄，降低了細胞中MMP-13 和聚集蛋白聚糖酶-5 mRNA的表達，從而減少軟骨細胞MMP-13和聚集蛋白聚糖酶-5 的生成，使Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅱ，Col Ⅱ）降解減緩，同時增加細胞外基質的合成，抑制軟骨分解代謝，刺激軟骨分化，最終起到保護軟骨的作用。除此之外，LIPUS 還可作用于軟骨中的MAPK 通路。MAPK 是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPK中與KOA發(fā)病相關的酶主要有細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和Jun 氨基末端激酶［17］。有學者提出LIPUS 可能是通過促進細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流來產(chǎn)生上述作用，LIPUS 產(chǎn)生的機械刺激激活瞬時受體電位香草素受體4 型通道蛋白（TRPV4），這種通過機械應力激活的鈣通道，使Ca2+向細胞內(nèi)流，進一步激活p38 MAPK通路及ERK1/2通路［35］。以上2種信號通路共同促進CCN 家族蛋白2/結締組織生長因子（CCN family 2/connective tissue growth factor，CCN2/CTGF）的產(chǎn)生。CCN2 是LIPUS 作用于軟骨細胞產(chǎn)生效應所需要的物質［36］，可促進軟骨細胞中Col Ⅱa1 和Acan 基因的表達（產(chǎn)物為Col Ⅱ和聚集蛋白聚糖），起到增加細胞外基質的作用。SEKINO等［37］也發(fā)現(xiàn)LIPUS 可以使小鼠軟骨細胞內(nèi)ERK1/2的活性和聚集蛋白聚糖的合成增加，MMP-13 的表達降低，增強軟骨細胞分化和細胞外基質合成，最終促進軟骨的合成。沈士浩等［38］則從不同角度揭示了LIPUS 對軟骨細胞的作用，該團隊提出LIPUS可能通過激活兔軟骨細胞中整合素-黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）-MAPK 通路來減輕KOA 對軟骨的破壞。在LIPUS 機械刺激的作用下，整合素被激活，進一步激活FAK，調控下游的MAPK水平，使ERK1/2、p38 磷酸化水平下降，最終促進Col Ⅱ的合成及減少MMP-13 的產(chǎn)生來保護軟骨。這些結果說明LIPUS的機械刺激通過直接作用于軟骨細胞上不同的靶點，對軟骨細胞中2 種主要信號通路產(chǎn)生不同的作用，來抑制軟骨降解產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制軟骨分解，促進軟骨合成，調控軟骨代謝過程，延緩膝骨關節(jié)炎的進展。

2.3 LIPUS誘導MSCs再生軟骨

除以上對滑膜及軟骨的治療機制外，近年來LIPUS 的研究熱點逐漸趨于其對MSCs 的影響［39-40］。LIPUS 還可通過影響MSCs的增殖、分化及遷移來達到修復軟骨的目的。MSCs是多能干細胞，廣泛分布于滑膜、骨髓和骨骼肌等組織中，可增殖分化為多種細胞，如成骨細胞、基質細胞、軟骨細胞等，其遷移到受損軟骨組織中，具有修復軟骨的作用，在治療KOA 方面有巨大的潛力［41］。LING 等［42］和CHEN等［43］研究指出，LIPUS 通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路和ERK1/2信號通路，促進人羊膜間充質干細胞的細胞增殖周期進入周期蛋白合成時期，從而上調細胞周期蛋白的表達，誘導MSCs 的增殖。XIA 等［44］觀察到LIPUS 的機械刺激可使添加了轉化生長因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）的體外培養(yǎng)的大鼠骨髓MSCs 中的Col Ⅱ和聚集蛋白聚糖的基因表達增加而使Col Ⅰ的基因表達降低，促進MSCs分化形成軟骨細胞，修復軟骨。這個過程可能是通過促進骨髓MSCs 中的整合素-雷帕霉素的機制靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路來實現(xiàn)的。1 項大鼠體內(nèi)外研究給出了更加新穎的觀點，即LIPUS 可通過調節(jié)自噬來促進骨髓來源的MSCs外泌體釋放［45］，進一步增加Col Ⅱ等細胞外基質以保護軟骨，此類外泌體也可通過抑制由IL-1β 激活的NF-κB 途徑修復軟骨［46］。因此LIPUS 除了直接抑制軟骨破壞外，還可促進注射至關節(jié)腔的骨髓MSCs 分泌的外泌體修復軟骨。另外，LIPUS 的機械應力可激活MSCs中的自噬通路并使其發(fā)生遷移，且此過程可被自噬抑制劑所抑制，但對自噬通路的激活過程及如何引起MSCs 的遷移并未具體闡明［47］。未來還需更多研究闡述LIPUS 在MSCs 遷移中的作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)LIPUS通過多種經(jīng)典的信號通路，在MSCs 的增殖、分化、遷移及其生物活性物質的產(chǎn)生、作用等方面產(chǎn)生效應，介導膝關節(jié)軟骨代謝的調控，減緩KOA的發(fā)展。見圖3。

圖3 LIPUS對軟骨的作用Figure 3 Effect of LIPUS on cartilage

3 討 論

綜上所述，LIPUS 主要通過影響自噬、Wnt/β-連環(huán)蛋白、MAPKs、NF-κB、PI3K-Akt 和整聯(lián)蛋白-mTOR 等信號通路對膝關節(jié)中的滑膜細胞、軟骨細胞及骨髓間充質干細胞的細胞活動起積極作用。LIPUS 可通過增強巨噬細胞的自噬途徑及抑制NLRP3 炎癥小體通路使巨噬細胞產(chǎn)生的IL-1β 減少，減輕炎癥反應。也可通過機械刺激抑制IL-1β誘導的NF-κB 途徑及激活MAPK 通路，來調節(jié)軟骨的分泌代謝，促進軟骨細胞生成細胞外基質，保護軟骨。在骨髓間充質干細胞方面，LIPUS 激活ERK1/2 和PI3K-Akt 信號通路促進MSCs 增殖分化，也通過整聯(lián)蛋白-mTOR 信號通路來促進MSCs產(chǎn)生TGF-β1，促進軟骨形成。另一方面，LIPUS 還可促進MSCs分泌外泌體，通過抑制IL-1β 誘導的NF-κB 途徑改變軟骨代謝，間接保護軟骨。最近研究也發(fā)現(xiàn)LIPUS通過激活自噬來促進MSCs 的遷移。通過對LIPUS在KOA 炎癥相關信號通路上不同作用途徑的探索，有利于實現(xiàn)LIPUS 更精準的治療。此外，干細胞新技術治療骨關節(jié)炎疾病的臨床試驗已陸續(xù)開始在國內(nèi)開展［10］，未來應進一步尋找LIPUS 對膝關節(jié)內(nèi)其他細胞或物質的影響通路，或進一步探究通過LIPUS的物理刺激讓干細胞定向分化為軟骨細胞并誘導其遷移修復受損軟骨的可行性，為臨床研究及聯(lián)合治療方案提供理論依據(jù)。