李大命 楊子萍, 劉燕山 谷先坤 唐晟凱 楊家新

(1 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所,江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210017;2 南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇南京 210023)

洪澤湖(118°10′～118°52′E,33°06′～33°40′N(xiāo))位于江蘇省西部淮河下游,水域面積約1 597 km2,是我國(guó)五大淡水湖之一。洪澤湖具有相對(duì)穩(wěn)定的水位、寬廣的水域和豐富的水生生物資源,為漁業(yè)發(fā)展提供了良好條件,是我國(guó)主要淡水漁業(yè)基地之一[1]。近幾十年來(lái),由于過(guò)度捕撈、水體環(huán)境質(zhì)量下降、水利工程建設(shè)等多重因素影響,洪澤湖魚(yú)類(lèi)物種數(shù)量減少,群落結(jié)構(gòu)趨于單一化,魚(yú)類(lèi)小型化趨勢(shì)嚴(yán)重,大型肉食性魚(yú)類(lèi)如翹嘴鲌等資源衰退嚴(yán)重[1-2]。

翹嘴鲌(Culteralburnus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Culterinae)、鲌屬(Culter),俗稱(chēng)白魚(yú)、翹嘴白絲、大白魚(yú)等,廣泛分布于我國(guó)各個(gè)水系[3]。翹嘴鲌為兇猛肉食性魚(yú)類(lèi),是水域生態(tài)系統(tǒng)中的頂級(jí)消費(fèi)者,能有效控制小型魚(yú)類(lèi)種群數(shù)量,減輕小型魚(yú)類(lèi)對(duì)浮游生物的壓力,在穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用[4-5]。近年來(lái),漁業(yè)主管部門(mén)在洪澤湖開(kāi)展了翹嘴鲌人工放流,對(duì)于恢復(fù)翹嘴鲌資源發(fā)揮了重要作用,但盲目的增殖放流可能會(huì)對(duì)魚(yú)類(lèi)資源遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響[6]。因此,迫切需要了解洪澤湖的翹嘴鲌種質(zhì)資源狀況和遺傳多樣性水平,用于指導(dǎo)洪澤湖翹嘴鲌?jiān)鲋撤帕?、種質(zhì)資源保護(hù)和管理工作。

目前,分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于研究物種群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。由于線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化快、嚴(yán)格的母系遺傳等特點(diǎn),因此成為群體遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的重要分子標(biāo)記[6]。Cytb基因(線粒體細(xì)胞色素b基因)是mtDNA的13個(gè)蛋白編碼基因之一,其結(jié)構(gòu)和功能較為清晰,進(jìn)化速率適中,包含著從種內(nèi)到種間的較強(qiáng)進(jìn)化信號(hào),故被廣泛用于物種多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究[7-9]。王利華等[10]應(yīng)用COⅠ和Cytb基因分析了6種鲌屬魚(yú)類(lèi)(達(dá)氏鲌、海南鲌、尖頭鲌、蒙古鲌、擬尖頭鲌和翹嘴鲌)的遺傳關(guān)系,認(rèn)為線粒體COⅠ和Cytb基因可以作為DNA條形碼鑒定鲌屬魚(yú)類(lèi)。李大命等[11]采用Cytb基因序列研究了滆湖3種鲌屬魚(yú)類(lèi)(翹嘴鲌、蒙古鲌、達(dá)氏鲌)的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)3種鲌魚(yú)的遺傳結(jié)構(gòu)趨于單一化。張桂寧等[12]通過(guò)Cytb基因序列分析發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)江下游4個(gè)翹嘴鲌群體的遺傳多樣性較高。2009年,伊西慶[13]采用線粒體ND2基因序列對(duì)采集的16尾洪澤湖翹嘴鲌進(jìn)行了遺傳分析,檢測(cè)到較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性,但該研究所分析的樣本量較少,其結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確反映洪澤湖翹嘴鲌的遺傳狀況。近十多年,尚未有關(guān)于洪澤湖翹嘴鲌遺傳多樣性的研究報(bào)道。本研究擬采用線粒體Cytb基因序列,對(duì)6個(gè)洪澤湖翹嘴鲌群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,以期了解當(dāng)前洪澤湖翹嘴鲌群體的遺傳多樣性狀況,并為翹嘴鲌?jiān)鲋撤帕鳌⒎N質(zhì)資源保護(hù)及利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和處理

2021年在洪澤湖開(kāi)展?jié)O業(yè)資源監(jiān)測(cè),采用三重刺網(wǎng)在6個(gè)采樣點(diǎn)采集翹嘴鲌210尾,其中洪澤群體(HZ)35尾,高渡群體(GD)34尾,顧勒河群體(GLH)34尾,新開(kāi)河群體(XKH)33尾、臨淮群體(LH)36尾,馬浪崗群體(MLG)38尾。各群體樣品采樣點(diǎn)位置見(jiàn)表1。測(cè)量每尾魚(yú)的體長(zhǎng),稱(chēng)取體質(zhì)量,并剪取尾鰭組織放入無(wú)水乙醇中保存。

表1 洪澤湖翹嘴鲌各群體采樣點(diǎn)位置

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用TaKaRa公司試劑盒提取翹嘴鲌的基因組DNA,將DNA溶于TE溶液,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ铆傊悄z電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。

線粒體Cytb基因擴(kuò)增引物為L(zhǎng)14724(序列為5’-CGTCAGTCCTTTACTTCGCA-3’)和H15915(序列為5’-AGGGCATACTCACGGGGTTG-3’)[14],引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共50 μL,其中包括:2×Premix TaqTM25 μL(TaKaRa Taq 1.25 U/25 μL、0.2 mM dNTP、1.5 mM Mg2+、色素Marker、比重增加物和穩(wěn)定劑)、上、下游引物各2 μL (10 μmol/L)、DNA模板2 μL (40 ng/μL )和ddH2O 19 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)完成后,取4 μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),剩余的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序,測(cè)序引物與擴(kuò)增引物一致。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

使用BioEdit 7.0.9.0軟件[15]讀取序列,并參照測(cè)序圖譜人工校對(duì)序列中可能的錯(cuò)誤。使用CLUSTALX 2.0軟件[16]對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)和排序。使用MEGA 7.0.26軟件[17]統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成、突變位點(diǎn)數(shù)和突變類(lèi)型,計(jì)算群體間的Kimura雙參數(shù)遺傳距離,利用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平應(yīng)用自引導(dǎo)估計(jì),循環(huán)次數(shù)為1 000次。采用Network軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖,用以展示單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。使用DanSP 5軟件[18]計(jì)算群體的單倍型數(shù)量、單倍型多樣性(haplotye diversity,Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity,Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(K)等遺傳多樣性參數(shù)。采用Arlequin 3.5軟件[19]進(jìn)行分子方差分析(AMOVA),計(jì)算群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst),開(kāi)展Tajima’sD及Fu’sFs中性檢驗(yàn)和構(gòu)建核酸錯(cuò)配分布曲線,評(píng)估翹嘴鲌群體的歷史動(dòng)態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 Cyt b基因序列變異及遺傳多樣性

本研究獲得翹嘴鲌的Cytb基因全序列,其長(zhǎng)度為1 141 bp。4種堿基的平均含量分別為A(29.4%)、T(26.6%)、C(29.4%)和G(14.6%),堿基A+T含量(56.0%)大于G+C含量(44.0%),具有明顯的堿基組成偏倚性。210條Cytb序列中共發(fā)現(xiàn)31個(gè)變異位點(diǎn),其中有11個(gè)單突變位點(diǎn),20個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。

6個(gè)群體210尾翹嘴鲌共定義了26個(gè)單倍型,整個(gè)群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.735±0.032和0.001 9±0.000 1,平均核苷酸差異數(shù)為2.118(見(jiàn)表2)。6個(gè)群體中,馬浪崗群體(MLG)的遺傳多樣性最高(Hd為0.788±0.064,Pi為0.0021±0.0002),高渡群體(GD)的遺傳多樣最低(Hd為0.618±0.096,Pi為0.001 5±0.000 3)。洪澤湖翹嘴鲌的遺傳多樣性具有典型的高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性模式。

表2 洪澤湖翹嘴鲌群體遺傳多樣性參數(shù)

2.2 群體單倍型組成及系統(tǒng)發(fā)育

6個(gè)群體定義了26個(gè)單倍型,其中洪澤群體擁有14個(gè)單倍型,高渡群體擁有11個(gè)單倍型,顧勒河和馬浪崗群體各擁有12個(gè)單倍型,新開(kāi)河和臨淮群體各有10個(gè)單倍型。26個(gè)單倍型中,共享單倍型有18個(gè),獨(dú)享單倍型有8個(gè)。其中,共享單倍型Hap3和Hap6為6個(gè)群體共有,個(gè)體數(shù)量分別有17個(gè)和105個(gè),占整個(gè)群體的比例合計(jì)為58.1%;共享單倍型Hap1、Hap2、Hap4、Hap8、Hap11～12、Hap14～17和Hap19～24為部分群體共有,個(gè)體數(shù)量共有80個(gè),占整個(gè)群體的比例合計(jì)為38.1%;獨(dú)享單倍型Hap5、Hap7、Hap9、Hap10、Hap13、Hap18、Hap25和Hap26為各自群體獨(dú)有,個(gè)體數(shù)量均只有1個(gè),占整個(gè)群體的比例合計(jì)為3.8%(見(jiàn)表3)。整體來(lái)看,共享單倍型的個(gè)體數(shù)量多,占群體的比例高,暗示6個(gè)群體間存在廣泛的基因交流。

表3 洪澤湖6個(gè)翹嘴鲌群體單倍型組成

利用紅鰭原鲌(Cultrichthyserythropterus)和蒙古鲌(Cultermongolicus)作為外類(lèi)群,基于鄰接法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖1)。結(jié)果顯示,所有單倍型聚為一個(gè)進(jìn)化分支,分支的置信限水平為100%。單倍型在6個(gè)群體中呈混雜分布模式,沒(méi)有形成與群體地理位置相對(duì)應(yīng)的譜系關(guān)系。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖也得出類(lèi)似結(jié)果(見(jiàn)圖2),說(shuō)明6個(gè)群體間沒(méi)有明顯的遺傳分化。

圖1 洪澤湖翹嘴鲌群體單倍型NJ系統(tǒng)樹(shù)

圖2 洪澤湖翹嘴鲌群體單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

2.3 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

6個(gè)群體間的遺傳距離為0.001 6～0.002 0,遺傳距離均值為0.001 9,表明群體間遺傳差異較小,親緣關(guān)系較近(見(jiàn)表4)。分子方差分析結(jié)果顯示,群體內(nèi)個(gè)體間的分子變異占比為100.33%,群體間遺傳變異占比為-0.33%,遺傳分化指數(shù)Fst值為-0.003 3(P=0.624 6)(見(jiàn)表5),表明整個(gè)翹嘴鲌群體沒(méi)有出現(xiàn)遺傳分化。兩兩群體間的Fst值為-0.017 7～0.018 2,且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著(見(jiàn)表4),顯示群體間沒(méi)有形成顯著的遺傳分化。

表4 洪澤湖翹嘴鲌6個(gè)群體間的遺傳距離(對(duì)角線下)和遺傳分化指數(shù)(對(duì)角線上)

表5 洪澤湖翹嘴鲌群體分子方差分析

2.4 群體歷史動(dòng)態(tài)

采用Tajima’sD、Fu’Fs中性檢驗(yàn)和核苷酸錯(cuò)配分布曲線分析翹嘴鲌群體的歷史動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示,6個(gè)群體的Tajima’sD檢驗(yàn)值統(tǒng)計(jì)均無(wú)顯著性差異(P>0.05),除臨淮群體(LH)外,Fu’Fs檢驗(yàn)值統(tǒng)計(jì)均有顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)表6),且6個(gè)群體的核苷酸錯(cuò)配分布曲線呈現(xiàn)出單峰模式(見(jiàn)圖3),表明6個(gè)群體顯著偏離中性進(jìn)化。從整體來(lái)看,其Tajima’sD和Fu’Fs的檢測(cè)值分別為-1.683 2和-13.532 9,統(tǒng)計(jì)分析具有顯著性差異(P<0.05),且核苷酸分布曲線也具有典型的單峰模式(見(jiàn)圖3),表明翹嘴鲌?jiān)谶M(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了群體擴(kuò)張事件。

圖3 洪澤湖翹嘴鲌群體核苷酸錯(cuò)配分布曲線

表6 洪澤湖翹嘴鲌群體的中性檢驗(yàn)

3 討論

3.1 翹嘴鲌的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ),也是評(píng)價(jià)生物種質(zhì)資源狀況及制定種質(zhì)資源保護(hù)措施的重要依據(jù)。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量群體遺傳多樣性的重要指標(biāo),其數(shù)值越大,表明群體遺傳變異越豐富,遺傳多樣性也越高[20-21]。相比較而言,核苷酸多樣性考慮各種單倍型在群體中所占的比例,能更為精確地反映群體多態(tài)性程度[22]。本研究結(jié)果顯示,洪澤湖翹嘴鲌的平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.735±0.032和0.001 9±0.000 1,6個(gè)群體的單倍型多樣性在(0.618±0.096)～(0.788±0.064),核苷酸多樣性為(0.001 5±0.000 3)～(0.002 1±0.000 2)。Grant等[23]根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性大小,將單倍型多樣性和核苷酸多樣性之間的關(guān)系分為4種類(lèi)型:高Hd高Pi、高Hd低Pi、低Hd高Pi和低Hd低Pi。據(jù)此判定,洪澤湖翹嘴鲌的遺傳多樣性屬于高Hd(Hd≥0.5)低Pi(Pi<0.005)類(lèi)型,這種遺傳多樣性模式暗示翹嘴鲌的遺傳多樣性較低[23]。多年來(lái),受過(guò)度捕撈、環(huán)境污染、非法采砂等不利因素的影響,洪澤湖環(huán)境生態(tài)質(zhì)量下降,翹嘴鲌漁業(yè)資源量明顯減少,其適宜的棲息環(huán)境大幅縮減,個(gè)體小型化和種群低齡化趨勢(shì)加劇,遺傳多樣性喪失。已有研究結(jié)果顯示,我國(guó)許多水體的野生翹嘴鲌資源遺傳多樣性具有高Hd低Pi共存現(xiàn)象[11,13,24-26],表明翹嘴鲌遺傳多樣性較低是一個(gè)普遍現(xiàn)象,需要采取措施恢復(fù)翹嘴鲌資源量及提高其遺傳多樣性。

3.2 翹嘴鲌的歷史動(dòng)態(tài)

魚(yú)類(lèi)群體的遺傳多樣性模式與群體的歷史動(dòng)態(tài)有密切的聯(lián)系。Grant等[23]提出了一個(gè)較簡(jiǎn)單的模式,即利用Hd、Pi來(lái)推測(cè)群體的歷史動(dòng)態(tài):當(dāng)Hd≥0.5、Pi≥0.005時(shí),表示群體穩(wěn)定,具有較悠久的進(jìn)化歷史;當(dāng)Hd≥0.5、Pi<0.005時(shí),表示群體是經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后迅速擴(kuò)張而來(lái)的;當(dāng)Hd<0.5、Pi≥0.005時(shí),表明群體經(jīng)歷了輕微的瓶頸效應(yīng),幾乎沒(méi)有影響到核苷酸變異;當(dāng)Hd<0.5、Pi<0.005時(shí),表明群體近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,翹嘴鲌群體的單倍型多樣性較高(Hd≥0.5),而核苷酸多樣性較低(Pi<0.005),由于積累核苷酸多樣性所需的時(shí)間比積累單倍型所需的時(shí)間漫長(zhǎng),表明洪澤湖翹嘴鲌群體是從一個(gè)有效種群數(shù)量較小的種群經(jīng)快速擴(kuò)張而來(lái)的,但是仍然沒(méi)有達(dá)到積累核苷酸變異所需要的時(shí)間。通常情況下,有2種方法可用于推測(cè)群體的歷史動(dòng)態(tài):(1)核苷酸錯(cuò)配分布曲線。若分布曲線呈單峰分布,表明群體經(jīng)歷了種群擴(kuò)張;若分布曲線呈雙峰分布,表明群體沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)種群擴(kuò)張,較為穩(wěn)定[27-28]。(2)Tajima’sD和Fu’Fs中性檢驗(yàn)。若中性檢驗(yàn)值為負(fù)值且統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果為顯著,表明群體可能經(jīng)歷了種群擴(kuò)張[29-30]。本研究結(jié)果顯示,洪澤湖翹嘴鲌群體的Tajima’sD和Fu’Fs中性檢驗(yàn)值均為負(fù)值,統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異(P<0.05);核苷酸錯(cuò)配分布曲線呈典型的單峰型,均說(shuō)明翹嘴鲌進(jìn)化過(guò)程中偏離了中性選擇,經(jīng)歷了顯著的種群擴(kuò)張,形成了高Hd和低Pi的遺傳多樣性模式,這與已有的研究結(jié)果[11,13]一致。

3.3 翹嘴鲌的遺傳結(jié)構(gòu)

通常采用遺傳分化指數(shù)(Fst)來(lái)評(píng)估群體間的遺傳分化程度。Wright[31]指出,若Fst值為0～0.05,表明群體間不存在分化;若Fst值為0.05～0.15,表明群體間存在中度分化;若Fst值為0.15～0.25,則為高度分化。分子方差分析結(jié)果顯示,遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)個(gè)體間,整個(gè)群體的Fst值為-0.003 3(P=0.624 6),兩兩群體間的Fst值為-0.017 7～0.018 2,P>0.05,均表明翹嘴鲌群體間沒(méi)有出現(xiàn)遺傳分化,群體的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖也支持上述觀點(diǎn)。從群體的單倍型組成來(lái)看,群體間有多個(gè)共享單倍型,且共享單倍型的個(gè)體數(shù)量占比較高,說(shuō)明群體間存在廣泛的基因交流。對(duì)于魚(yú)類(lèi)而言,地理阻隔或同一水域中存在不同的棲息環(huán)境可能會(huì)限制基因交流,從而使群體間產(chǎn)生遺傳分化現(xiàn)象[32]。本研究中的6個(gè)群體雖處于洪澤湖的不同水域,水域生態(tài)環(huán)境也存在一定的差異[33-34],但群體所在的地理位置較近,沒(méi)有形成有效的地理隔離,而翹嘴鲌游泳能力強(qiáng),活動(dòng)范圍廣,也助推了群體間的基因交流。此外,近年來(lái)漁業(yè)主管部門(mén)在洪澤湖開(kāi)展了翹嘴鲌?jiān)鲋撤帕骰顒?dòng),大量人工養(yǎng)殖群體的加入容易導(dǎo)致群體遺傳結(jié)構(gòu)的單一和均質(zhì)化,這一現(xiàn)象在其他水域的增殖放流種類(lèi)中均有發(fā)現(xiàn)[35-37]。根據(jù)翹嘴鲌的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn),應(yīng)將6個(gè)群體作為一個(gè)進(jìn)化單位進(jìn)行管理和保護(hù)。

3.4 翹嘴鲌資源保護(hù)對(duì)策

對(duì)魚(yú)類(lèi)群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究可以為漁業(yè)資源管理措施及物種保護(hù)策略的制定提供重要的數(shù)據(jù)支撐。研究結(jié)果顯示,洪澤湖翹嘴鲌的遺傳多樣性具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性共存現(xiàn)象,表明翹嘴鲌遺傳資源較為貧乏。本研究洪澤湖翹嘴鲌6個(gè)群體間沒(méi)有顯著的遺傳分化,因此可將洪澤湖不同水域的翹嘴鲌群體作為一個(gè)整體進(jìn)行管理和保護(hù)。針對(duì)洪澤湖翹嘴鲌的遺傳多樣性現(xiàn)狀,應(yīng)當(dāng)采取措施,加大對(duì)翹嘴鲌的保護(hù)力度:(1)強(qiáng)化漁業(yè)資源管理,加大執(zhí)法力度,嚴(yán)厲打擊非法捕撈,禁止電、毒、炸等作業(yè)方式;(2)控制環(huán)境污染,開(kāi)展生態(tài)環(huán)境治理,恢復(fù)水生植被,構(gòu)建人工魚(yú)巢,為翹嘴鲌生存和繁殖提供良好的生態(tài)環(huán)境;(3)科學(xué)規(guī)范地進(jìn)行翹嘴鲌?jiān)鲋撤帕?提高翹嘴鲌的成活率,開(kāi)展放流群體和野生群體的遺傳評(píng)估,跟蹤監(jiān)測(cè)翹嘴鲌資源變化,逐步提高翹嘴鲌的遺傳多樣性。