王鵬遠 趙帥 李飛雨 杜春影 遲永洲 沈照鵬 王鵬

(1 中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003; 2 青島市生物藥肥工程研究中心,山東青島 266717)

隨著我國農業(yè)生產的發(fā)展,過度施用化肥帶來的土壤板結退化、肥料利用率低和作物質量下降等問題逐漸凸顯,嚴重制約著我國綠色農業(yè)和高質量農業(yè)的發(fā)展。探尋減肥提質的方法已成為當前趨勢,環(huán)境友好型生物刺激劑已成為新的熱點[1],其中海藻源生物刺激劑約占全球生物刺激劑市場份額的三分之一[2],受到廣泛關注。褐藻是商業(yè)生產海藻提取物最常用的原料,包括海帶、泡葉藻、馬尾藻、巨藻等,其中海帶在我國藻類養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位,2020年我國海帶總產量為165萬t,占我國藻類總產量的63%[3],因此,是生物刺激劑的理想來源。對海帶的高值化應用的研究表明,海帶提取物的活性物質種類豐富,包括多糖、蛋白質、酚類化合物、植物激素等,這些物質通過單獨或協(xié)同作用影響植物的生理生化反應,如促進植物生長和養(yǎng)分吸收,增強植物的抗脅迫能力,刺激葉綠素和植物激素的生物合成[4],還可以重塑根系微生物群落結構、提高土壤的保水能力[5]。多糖是海帶中最重要的成分之一,約占海帶提取物干質量的10%～30%[6]。多糖能夠促進植物生長,有研究表明,在黃瓜幼苗葉片噴施褐藻寡糖可有效促進幼苗的光合作用,提高其抗氧化酶的活力,進而提高黃瓜產量[7]。

目前,在工業(yè)上廣泛應用的海帶提取物的制備工藝有化學酸解法和生物酶解法。不同制備方法會影響提取物的成分和其生物刺激效果[8]。化學酸解法工藝簡單,反應較徹底;生物酶解法工藝要求高,但產物活性高,二者各有優(yōu)勢[9]。本研究采用化學酸解法(簡稱酸法)和生物酶解法(簡稱酶法)分別制備海帶提取物,分析其成分與結構表征,并比較和評價不同制備工藝的海帶提取物對黃瓜幼苗生長參數(shù)和生化指標的影響,以期為海藻源生物刺激劑的開發(fā)和生產提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

干海帶購自山東尋山集團有限公司;黃瓜種子購自江蘇南京金豐種苗有限公司;無水乙醇、磷酸氫二鈉、氫氧化鉀、苯酚、葡萄糖、氯化鉀、濃硫酸等化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純;褐藻膠裂解酶(1×104U/g)由中國海洋大學食品科學與工程學院應用微生物實驗室提供;酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 海帶提取物的制備

酸解海帶提取物(ALE):將干海帶磨碎,稱取150 g海帶粉添加到1 L硫酸溶液(體積分數(shù)為2%)中,室溫下在5 L發(fā)酵罐中攪拌20 min,然后迅速升溫至121 ℃,在121 ℃、0.12 MPa條件下持續(xù)反應30 min,4 000 r/min離心10 min,用KOH將所得上清液的pH調至7.0,即獲得酸解海帶提取液[10]。

酶解海帶提取物(ELE):將干海帶磨碎,稱取150 g海帶粉溶于2.25 L超純水中,緩慢加入緩沖溶液(檸檬酸-磷酸氫二鈉)將pH調至6.0,加入0.03 g褐藻膠裂解酶(1×104U/g),在30 ℃條件下在5 L發(fā)酵罐中保溫酶解3 h,4 000 r/min離心10 min后取上清液,即獲得酶解海帶提取液[11]。

根據(jù)不同倍數(shù)梯度稀釋的預試驗結果的規(guī)律性和典型性,最終確定將兩種海帶提取物稀釋至可溶性固形物含量分別為0.08、0.12、0.24 g/L(即低、中、高濃度),用于后續(xù)試驗。

1.2.2 酸解和酶解海帶提取物的組分分析

將樣品在馬弗爐中550 °C下煅燒6 h,根據(jù)AOAC法測定灰分含量[12]。以葡萄糖和牛血清白蛋白為標準品,分別用苯酚-硫酸法和福林酚法測定總糖和總蛋白質含量[13]。采用福林酚法測定總多酚含量[14]。采用間羥基聯(lián)苯法測定海藻酸含量[15]。根據(jù)Chi等[12]的方法,使用TSK-GEL G4000 PWxl色譜柱(7.8 mm×30 cm,Tosoh,Shiba,Tokyo,JP)測定樣品中多糖的分子量及其分布。

1.2.3 植物培養(yǎng)

將7組(每組21粒)黃瓜種子在25 ℃無菌水中萌發(fā)2 d后,將其移入裝有土壤的21孔穴盤中,并在光周期16∶8(即光照時長16 h,黑暗時長8 h)、溫度為25 ℃、相對濕度為60%、照度為400 μmol/(m2·s)的環(huán)境中培養(yǎng)。8 d后,對照組(CK)用1 L蒸餾水進行灌根處理。試驗組中,3組分別用0.08 g/L(L-ALE)、0.12 g/L(M-ALE)、0.24 g/L(H-ALE)的酸解海帶提取液各1 L進行灌根處理;另外3組分別用0.08 g/L(L-ELE)、0.12 g/L(M-ELE)、0.24 g/L(H-ELE)的酶解海帶提取液各1 L進行灌根處理。培養(yǎng)16 d后(黃瓜幼苗展開第3功能葉),收集樣品,用于評價指標的測定。

1.2.4 黃瓜幼苗生長參數(shù)的測定

測量每組黃瓜幼苗的表觀生長參數(shù),包括株高、根長、地上部分鮮質量和根部鮮質量。

1.2.5 葉綠素含量的測定

根據(jù)Liu等[8]的方法提取并測定葉綠素,取0.3 g葉片在5 mL 95%乙醇中勻漿,然后在室溫下以4 000 r/min離心10 min,上清液用95%乙醇定容至25 mL,并測量649 nm和665 nm處的吸光度。葉綠素a和葉綠素b含量的計算公式如下:

葉綠素a含量=12.71A665-2.59A649

(1)

葉綠素b含量=22.88A649-4.67A665

(2)

式(1)～(2)中:A649表示樣品在649 nm處的吸光值,A665表示樣品在665 nm處的吸光值。

1.2.6 可溶性糖含量的測定

根據(jù)Zou等[16]的方法提取葉片中的可溶性糖。取0.3 g葉片在5 mL蒸餾水中勻漿,然后在100 ℃下加熱30 min,過濾后的濾液用蒸餾水定容至25 mL,通過苯酚-硫酸法測定可溶性糖含量[13]。

1.2.7 可溶性蛋白含量的測定

按照He等[17]的方法提取葉片中的可溶性蛋白質。取0.3 g葉片在5 mL水中勻漿,然后在室溫下以4 000 r/min離心10 min,所得上清液用磷酸鹽緩沖液定容至10 mL。以牛血清白蛋白為標準,用考馬斯藍在595 nm處測定上清液中的可溶性蛋白質含量[13]。

1.2.8 植物激素含量的測定

取0.1 g幼苗第3功能葉,在0.9 mL提取液(pH為7.4)中勻漿。在4 ℃下以12 000×g離心15 min后,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒測定上清液中的吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的水平,相應的檢測范圍為2～48 pmol/L和20～480 ng/L[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Minitab 19軟件進行數(shù)據(jù)分析處理,采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)對處理組與對照組的數(shù)據(jù)進行顯著性分析,設顯著性水平為0.05。采用GraphPad 8.0.1軟件進行繪圖制作。

2 結果

2.1 海帶提取物組分分析

酸解海帶提取物(ALE)和酶解海帶提取物(ELE)的化學組分見表1。兩種工藝獲得的海帶提取液中,以海藻酸為代表的多糖含量較高,不同工藝在有效物質的提取率方面有顯著性差異,ALE的海藻酸、總蛋白質、多酚和甘露醇的含量均顯著高于ELE(P<0.05)。在多糖分子量方面,通過標準曲線計算得出,ALE中多糖的重均分子量為4 209 Da,ELE中多糖重均分子量為2 420 Da(見圖1)。

表1 酸解海帶提取物(ALE)和酶解海帶提取物(ELE)的組分分析

圖1 多糖分子量標準曲線以及ALE和ELE中多糖分子量分布

2.2 不同工藝海帶提取物對黃瓜幼苗生長指標的影響

由表2可見,與對照組相比,中、高劑量的ALE和ELE對黃瓜幼苗的株高均有顯著增效(P<0.05),分別提高了35.0%、32.5%、15.0%和32.5%,其中,高劑量ALE(H-ALE組)作用效果最好;中劑量ALE和ELE對根系生長均有顯著促進作用(P<0.05);在鮮質量方面,中劑量ALE和低劑量ELE處理的黃瓜幼苗地上部分鮮質量顯著增加,分別增加了66.6%和36.8%,低、中劑量ALE對根部鮮質量有顯著促進作用(P<0.05)。

表2 ALE和ELE對黃瓜幼苗表觀生長指標的影響

2.3 不同工藝海帶提取物對黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可見,與對照組相比,不同ALE和ELE處理組黃瓜幼苗的葉片葉綠素a和葉綠素b含量均顯著增加(P<0.05)。其中ALE 3個處理組黃瓜幼苗的葉綠素a含量分別提高了20.3%、9.5%、22.5%,葉綠素b含量分別提高了49.1%、31.5%、44.3%。

注:相同系列數(shù)據(jù)上標字母不同表示組間差異顯著(P<0.05),上標字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同工藝海帶提取物對黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響

由圖3可見,與對照組(CK)相比,中、高劑量ALE和ELE組可溶性糖的含量均有顯著提高(P<0.05),其中,中劑量ALE處理組的可溶性糖含量最高,與對照組相比提高了83.7%。

注:數(shù)據(jù)上標字母不同表示有顯著差異(P<0.05),上標字母相同表示沒有顯著差異(P>0.05)。

2.5 不同工藝海帶提取物對黃瓜幼苗可溶性蛋白質含量的影響

由圖4可見,與對照組相比,ALE和ELE均顯著提高了黃瓜幼苗中的可溶性蛋白質含量(P<0.05),其中,低劑量ALE的效果最好,可溶性蛋白質含量提高了74.2%。中、高劑量的ELE比同劑量的ALE作用效果更為明顯(P<0.05)。

2.6 不同工藝海帶提取物對黃瓜幼苗植物激素含量的影響

由圖5可見,與對照組相比,各ELE處理組顯著提升了黃瓜幼苗GA和IAA的含量(P<0.05),且作用效果均隨著劑量的增大而減弱。低劑量ELE處理組對黃瓜幼苗IAA和GA含量的提升效果最佳,分別提升了69.6%和75.8%。

注:數(shù)據(jù)上標字母不同表示有顯著差異(P<0.05),上標字母相同表示沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論

ALE中降解多糖的分子量分布較寬,這可能是由于在酸解時糖苷鍵會隨機斷裂,共軛酸質子作用于環(huán)糖苷鍵,使碳氧離子鍵斷裂并形成非還原基端,因此獲得不均勻的多糖碎片[9]。ELE中降解多糖的分子量呈現(xiàn)正態(tài)分布,所用的褐藻膠裂解酶能通過β消除作用于海帶中褐藻膠的β-1,4-糖苷鍵,并在產物非還原端C4和C5之間形成不飽和雙鍵[19],采用這種專一性酶解方式能夠獲得較為均一的多糖降解片段。

整體來看,ALE對黃瓜幼苗的促生長作用更為明顯,這可能與褐藻多酚的作用有關。相關研究證明,將海藻多酚物質應用于玉米葉片的表面和根系,可顯著改善玉米的生長指標參數(shù),同時促進植株根、莖、葉的生長,增大葉片面積并提高葉片數(shù)及生物量[20]。本試驗中,ALE中的多酚含量顯著高于ELE,說明ALE的作用效果更優(yōu)。

葉綠素在光能吸收、轉移和光化學電荷分離等方面發(fā)揮作用,葉綠素a和葉綠素b的含量、比例、分布可調控葉片的光合作用[21]。其中,ALE的作用效果優(yōu)于ELE,這可能與ALE中海藻酸和多酚含量更高有關。海藻酸和褐藻多酚已被證實對光合色素合成有積極影響。經(jīng)海藻酸和多酚處理的煙草和甘藍葉具有較高的葉綠素以及其他色素含量,為捕光色素蛋白復合物(LHCS)和光系統(tǒng)Ⅱ反應中心(PSⅡRC)的合成提供了原料[22]。

可溶性糖在植物體內可以作為能量物質提供植物生長所需的能量,可以作為信號分子調節(jié)內源酶的表達。糖信號與激素信號轉導有一定的相互作用,是植物生長評價的重要指標[23]。研究發(fā)現(xiàn),海藻酸通過上調部分光合作用的基因,增強作物光合作用或刺激酶合成等途徑,促進了可溶性糖的積累[23-24]。據(jù)報道,植物光系統(tǒng)PSⅡ反應中心只有葉綠素a的存在,因而光合作用與葉綠素a含量關系非常密切,但過量的葉綠素積累會引起光氧化損傷[25-27]。本試驗中,黃瓜幼苗中的葉綠素含量與可溶性糖含量有一定的相關性,ALE和ELE通過提升葉綠素含量促進了可溶性糖的積累,這種效應已在櫻桃、葡萄、番茄、玉米等多種作物中得到證實[20]。

可溶性蛋白質是植物中氮的主要形式,它在植物的生長發(fā)育中起著重要作用,是反映植物整體代謝狀態(tài)的多種酶的重要組成部分[28]。已有研究表明,海藻提取物能夠提高甜玉米對氮素的利用率,促進可溶性蛋白質積累,提高玉米產量[29]。據(jù)報道,海藻寡糖可提高植物體內硝酸還原酶、谷氨酸脫氫酶的活性,使更多的NH4+轉化成有機氮進入氮代謝循環(huán),有利于蛋白質的積累[10]。

GA和IAA是調控植物生長發(fā)育的重要激素,對細胞的分裂、伸長和分化都有一定的作用,同時,IAA有誘導調控維管束分化、調控根的分化形成、促進果實發(fā)育等功能[30]。褐藻提取物已經(jīng)被證明用于植物中可以調節(jié)參與細胞分裂素、脫落酸和赤霉素生物合成的基因的表達,通過調節(jié)植物激素活性影響植物生長[31]。相關研究發(fā)現(xiàn),富含分子量為1.8 kDa和2.7 kDa多糖的褐藻提取物能夠提高黃瓜幼苗葉片中GA和IAA等植物激素的水平[10]。本試驗中,ELE中多糖分子量為2 420 Da,對植物激素合成有更好的促進作用。有研究表明,當GA質量濃度在0～200 mg/L時,隨著濃度的增加,GA對黃瓜幼苗生長的促進作用增強,但當GA質量濃度在200～350 mg/L時,隨著濃度的增加,GA對黃瓜幼苗生長的抑制作用增強;IAA的作用同樣具有兩重性[32]。本試驗中,ELE更有利于植物激素合成,但ALE對黃瓜幼苗的促生長作用更優(yōu),原因可能是高濃度的植物激素對黃瓜幼苗的生長會起到抑制作用。

4 結論

不同工藝制備的海帶提取液對黃瓜幼苗均有促生長作用,在不同指標方面的表現(xiàn)各異。在表觀生長指標方面,ALE表現(xiàn)出更好的促進作用,且中劑量ALE作用效果最佳。這可能與相關激素的兩重性有關。在生化指標方面,ALE對葉綠素含量的促進作用優(yōu)于同劑量的ELE,兩種提取液均能提高可溶性蛋白質和可溶性糖的含量。ELE組能顯著提高黃瓜幼苗的GA和IAA含量,且低劑量的ELE生物刺激效果最佳,較對照組分別提升了69.6%和75.8%。在實際的海帶源生物刺激劑的開發(fā)和生產過程中,建議根據(jù)產品的不同用途選擇合適的生產方式。