響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助乙醇提取桑葚花青素工藝及穩(wěn)定性分析

邱菊,陳昌琳,陳冰藝,何貴萍,張佳琪,呂遠(yuǎn)平*

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610065;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所,成都 610300)

桑葚(MorusalbaL.)又名桑果、烏葚、桑椹等,為?？?Moraceae)植物桑樹的果穗[1]?；A(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸等,在桑葚中含量較高,日常食用桑葚對人體有祛濕、補(bǔ)血、清熱、補(bǔ)腎等好處[2]?；ㄇ嗨刈鳛橐环N高價值的活性物質(zhì),在植物王國中的存在感很強(qiáng),更被稱作“天然色素”,具有賦予植物顏色的功能,桑葚果實中也因含有大量花青素而呈現(xiàn)深紫色[3-4]。其生理活性包括抗氧化活性、清除自由基、抗誘變活性和抑菌活性等[5—6]。

桑葚中富含花青素等活性成分而對健康有益,選擇合適的提取方法非常重要,不同的提取方法會直接影響其研究及利用[7]。目前超聲波法、微波法、有機(jī)溶劑法、酶輔助法等是最常用于花青素提取的方法[8]。使用溶劑法提取需要大量的時間,而得率卻不高。使用酶法時,酶和色素經(jīng)常會難以分離?；ㄇ嗨氐葻崦粜曰衔锏慕Y(jié)構(gòu)在微波的高溫下容易遭到破壞。超聲波法借助超聲波產(chǎn)生的空化現(xiàn)象增強(qiáng)提取效應(yīng),達(dá)到提高提取率的目的,此法效率高、時間短、成本低[9]。在本試驗中,選擇桑葚果干作為試驗對象,采用超聲波乙醇萃取從桑葚中提取花青素,響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取條件,獲得最佳提取工藝,有利于花青素的高效利用和保存,考察花青素在不同光照和溫度下的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚果干(品種:黑桑):攀鄉(xiāng)食品有限公司。

矢車菊素-3-葡萄糖苷(純度≥98%):成都麥德生科技有限公司;乙醇:重慶川東化工有限公司;鹽酸:四川西隴科學(xué)有限公司;所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-6000PC紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司;SMF01磨粉機(jī) 蘇泊爾有限公司;KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;H1850高速離心機(jī) 湖南湘儀集團(tuán);PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葚粉末的制備

將桑葚果干粉碎過20目標(biāo)準(zhǔn)篩,于干燥皿中密封避光備用。

1.2.2 桑葚花青素的提取

將1.000 0 g桑葚粉末置于150 mL錐形瓶中,以固定濃度的乙醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取,離心10 min(6 000 r/min),上清液即為花青素提取液。

1.2.3 桑葚花青素的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品計算桑葚中花青素的含量,該標(biāo)準(zhǔn)品與桑葚花青素強(qiáng)吸收峰一致[10]。在波長530 nm處,測定用pH值3.00的超純水稀釋的不同濃度標(biāo)品溶液的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程:y=0.033x-0.006 9,R2=0.999 6。

1.2.3.2 樣品花青素的測定

測定稀釋一定倍數(shù)的1 mL待測液在波長530 nm處的吸光度[11]?；ㄇ嗨氐寐室姽?1):

(1)

式中:k為桑葚提取液的稀釋倍數(shù);c為桑葚提取液的濃度,μg/mL;m為原料量,g;V為桑葚提取液的體積,mL。

1.2.4 單因素試驗

選擇乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、75%、80%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,g/mL)、提取時間(10,15,20,25,30 min)、提取溫度(30,40,50,60,70 ℃)、超聲功率(120,140,160,180,200 W)、溶劑pH(1.00,1.50,2.00,2.50,3.00,4.00,5.00)6個因素進(jìn)行試驗。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇4個試驗因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,即乙醇濃度、提取時間、超聲功率、提取溫度,固定料液比為1∶20(g/mL),溶劑pH值為2.00。響應(yīng)面試驗因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.6 花青素提取液的穩(wěn)定性

1.2.6.1 桑葚花青素提取液熱穩(wěn)定性的影響

將花青素提取液分別置于4,25,40,60,80,100 ℃ 6個不同溫度下避光保存,每隔2 h取出提取液進(jìn)行測定,共測定10 h內(nèi)花青素含量的變化?；ㄇ嗨亟到庾裱患墑恿W(xué)模型[12],按公式(2)、公式(3)計算:

Ct=C0e-kt。

(2)

t1/2=ln(2)/k。

(3)

式中:C0為反應(yīng)起始的含量,mg/g;Ct為一定溫度下處理tmin后的含量,mg/g;k為動力學(xué)常量;t1/2為降解反應(yīng)的半衰期,h。

1.2.6.2 桑葚花青素提取液光穩(wěn)定性的影響

在室溫條件下,分別于避光和室內(nèi)光照的環(huán)境下放置花青素提取液進(jìn)行保存,每隔1 d取出提取液進(jìn)行測定,共測定花青素在4 d內(nèi)含量的動態(tài)變化。花青素保留率按公式(4)計算:

(4)

式中:A1為放置后花青素的吸光度;A0為放置前花青素的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均取平行試驗3次后的平均值,采用Excel軟件處理數(shù)據(jù),Design Expert 12軟件設(shè)計Box-Behnken試驗,Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對桑葚花青素得率的影響

花青素為帶有糖基或羥基的極性化合物,根據(jù)相似相溶原理以及考慮到桑葚為食品原料,選擇乙醇作為提取溶劑,具有無毒無害、成本較低的優(yōu)點。由圖1可知,提取溶劑中的乙醇濃度從40%逐漸提高到70%時,花青素得率快速提升,濃度為40%時花青素得率為3.81 mg/g,而70%時得率為6.25 mg/g,達(dá)到最大值。乙醇能夠穿透桑葚內(nèi)部,斷裂其中與花青素相連的氫鍵,使花青素更好地溶解[13]。當(dāng)濃度超過70%時得率呈現(xiàn)下降趨勢,在80%時花青素得率降至3.65 mg/g。因為乙醇濃度會影響提取溶劑的極性,濃度過大導(dǎo)致極性偏離花青素的極性,并且溶出桑葚果實中的醇溶物質(zhì),奪取有助于花青素溶解的乙醇-水分子結(jié)構(gòu)[14]。因此,選擇乙醇濃度70%的溶劑為宜。

圖1 乙醇濃度對桑葚花青素得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yeild of anthocyanins from mulberry

2.1.2 料液比對桑葚花青素得率的影響

由圖2可知,當(dāng)料液比從1∶5增加到1∶20時,桑葚花青素得率從2.73 mg/g升高到6.84 mg/g,這是由于低料液比時,桑葚粉末在乙醇溶劑中溶解不完全,因而提取不充分,當(dāng)料液比增大時,原料和溶劑中濃度差加大,接觸面積也增大,使得提取更充分,因而得率和料液比呈正相關(guān)[15]。繼續(xù)提高料液比得率沒有明顯變化,說明花青素已提取充分,繼續(xù)增大料液比無法進(jìn)一步促進(jìn)花青素溶出,增加成本且為后續(xù)試驗帶來不便。因此,選擇料液比1∶20為宜。

圖2 料液比對桑葚花青素得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanins from mulberry

2.1.3 提取時間對桑葚花青素得率的影響

由圖3可知,提取時間為10 min時花青素得率為6.4 mg/g,隨著時間的延長,在25 min時有最大得率7.29 mg/g,桑葚的內(nèi)部結(jié)構(gòu)在超聲作用下被破壞,提取的有效位點在時間的作用下增多,所以花青素溶出較快,得率升高[16]。當(dāng)時間繼續(xù)增加時,花青素物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,因而含量降低[17]。因此,選擇提取時間25 min為宜。

圖3 提取時間對桑葚花青素得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of anthocyanins from mulberry

2.1.4 超聲功率對桑葚花青素得率的影響

由圖4可知,當(dāng)超聲功率為120,140 W時花青素得率分別為6.50,6.80 mg/g,在180 W時得率增加到7.38 mg/g。超聲波產(chǎn)生的空化、振動等系列現(xiàn)象增強(qiáng)了提取效應(yīng),使得桑葚原料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞,使花青素易于溶出,達(dá)到提高提取率的目的[18]。功率超過180 W時,因功率過高改變了花青素的穩(wěn)定性,得率降低,200 W時得率降至6.98 mg/g。因此,選擇超聲功率180 W為宜。

圖4 超聲功率對桑葚花青素得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of anthocyanins from mulberry

2.1.5 提取溫度對桑葚花青素得率的影響

由圖5可知,提取溫度為30～50 ℃時,花青素得率升高,在溫度為30,40 ℃時,花青素得率分別為5.36,5.73 mg/g,當(dāng)溫度為50 ℃時,花青素得率升高至7.25 mg/g。升溫加速了花青素分子的熱運動,使得溶解速率提升,溶解度也隨之增大[19]。后續(xù)試驗中,溫度升高到60,70 ℃時,花青素得率沒有明顯變化,但因過高的溫度會破壞花青素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,導(dǎo)致化合物的降解反應(yīng)。因此,提取溫度選擇50 ℃為宜[20]。

圖5 提取溫度對桑葚花青素得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield ofanthocyanins from mulberry

2.1.6 溶劑pH對桑葚花青素得率的影響

由圖6可知,花青素在酸性溶劑中得率較高,試驗結(jié)果主要是花青素結(jié)構(gòu)隨pH變化導(dǎo)致的[21]。桑葚果實的顏色呈現(xiàn)主要受花青素的影響,而pH影響花青素的顏色呈現(xiàn)。在酸性介質(zhì)中花青素主要以紅色黃烊鹽正離子為主導(dǎo),該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好且易溶于水并呈現(xiàn)鮮艷的紅色,pH超過3.00時,以黃烊鹽正離子結(jié)構(gòu)為主的花青素,逐漸變成趨向無色的甲醇假堿或查爾酮假堿結(jié)構(gòu),因而化合物的顏色變淺[22]。溶劑pH為3.00時花青素得率僅為4.05 mg/g,pH降低為2.00時,花青素得率顯著升高,為7.35 mg/g,但當(dāng)酸性過強(qiáng)時花青素中的糖苷鍵和羥基等會被轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致桑葚花青素的天然結(jié)構(gòu)被破壞[23]。因此,溶劑pH選擇2.00為宜。

圖6 溶劑pH對桑葚花青素得率的影響Fig.6 Effect of solvent pH on the yield ofanthocyanins from mulberry

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

桑葚果干花青素提取的響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表2試驗數(shù)據(jù)擬合得到回歸方程:Y=-113.100 67-1.571 95A+1.275 83B+0.510 783C+0.270 667D-0.004 25AB+0.000 375AC+0.003AD+0.003 125BC-0.002 85BD-0.000 487CD-0.012 709A2-0.027 337B2-0.001 637C2-0.003 297D2。

由表3可知,回歸模型的P值小于0.000 1,失擬項的P值為0.276 6,說明模型擬合與實際情況誤差很小。相關(guān)系數(shù)R2=0.993 5,RAdj2=0.986 9,這兩個值比較高且相差小于0.2,說明該次模擬能夠代替實際試驗,對桑葚果干花青素提取的預(yù)測結(jié)果可信。試驗中,一次項A、B、D的P值均小于0.05,說明在桑葚花青素的提取過程中,改變?nèi)軇┑囊掖紳舛纫约疤崛∵^程中的溫度和時間,均能顯著影響花青素的得率。4個二次項A2、B2、C2、D2和4個交互項AB、AD、BC均為極顯著水平,交互項BD為顯著水平,簡單的線性關(guān)系不能直接說明4個因素對花青素提取的影響。方差分析中FA=936.51,FB=25.16,FC=1.02,FD=6.49,由F值可知,4個因素的影響次序為乙醇濃度>提取時間>提取溫度>超聲功率?；貧w方程中A的系數(shù)為負(fù)值,表明溶劑提取時,較低的乙醇濃度能夠使桑葚花青素提取率更高,與之相比,B、C、D的系數(shù)為正值,說明更高的提取時間、超聲功率和提取溫度可以提高花青素得率。

2.2.2 響應(yīng)曲面和等高線圖分析

響應(yīng)曲面圖和等高線圖見圖7～圖10。

圖7 乙醇濃度和提取時間對桑葚花青素得率的影響Fig.7 Effects of ethanol concentration and extraction time on the yield of anthocyanins from mulberry

圖8 乙醇濃度和提取溫度對桑葚花青素得率的影響Fig.8 Effects of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of anthocyanins from mulberry

圖9 提取時間和超聲功率對桑葚花青素得率的影響Fig.9 Effects of extraction time and ultrasonic power on the yield of anthocyanins from mulberry

圖10 提取時間和提取溫度對桑葚花青素得率的影響Fig.10 Effects of extraction time and extraction temperature on the yield of anthocyanins from mulberry

2.2.3 最佳工藝確定及驗證試驗

由軟件分析得出,花青素最佳提取工藝為乙醇濃度65.588%、提取時間26.222 min、超聲功率181.730 W、提取溫度46.125 ℃,此條件下花青素理論得率為7.824 mg/g。將試驗條件定為乙醇濃度65%、提取時間25 min、超聲功率180 W、提取溫度45 ℃,用于實際驗證模型的準(zhǔn)確性,得出花青素得率為7.815 mg/g,與模型預(yù)測的7.824 mg/g相差無幾,說明模型具有真實性。

2.3 桑葚花青素提取物的穩(wěn)定性

2.3.1 不同光照處理對花青素穩(wěn)定性的影響

室內(nèi)光照和避光處理影響花青素的保留率,結(jié)果見圖11。

圖11 桑葚花青素的光穩(wěn)定性Fig.11 Light stability of anthocyanins from mulberry

由圖11可知,兩種放置方式處理下,花青素含量均降低,光照條件下降低速度快于避光條件,在室溫放置1 d后,花青素在避光條件下的保留率為96%,在室內(nèi)光照條件下為93%,而在4 d后,保留率分別降至84%和80%。這是由于花青素因光照、放置時間等發(fā)生反應(yīng),降解生成其他物質(zhì)[24]。

2.3.2 溫度對花青素穩(wěn)定性的影響

由圖12和表4可知,花青素在4 ℃冷藏時t1/2為44.4 d,在室溫25 ℃儲藏時t1/2為25.1 d,降解速率k分別為0.07×10-2和0.12×10-2,因此在長期儲存時為保證花青素的有效保存,建議冷藏。而當(dāng)儲藏溫度在60 ℃以上時,t1/2迅速降至2.5 d,降解速率k>1.15×10-2,且花青素顏色逐漸由紫紅色變?yōu)槌壬?表明高溫使得花青素加速降解和流失[25]。

3 結(jié)論

本試驗以桑葚果干作為試驗原料,用響應(yīng)面設(shè)計分析超聲輔助乙醇提取桑葚中花青素的主要影響因素,提高工藝的花青素得率,以及不同光照和溫度條件下桑葚花青素的穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明,乙醇濃度、提取時間、提取溫度及超聲功率4個因素影響顯著,次序為乙醇濃度>提取時間>提取溫度>超聲功率。最佳提取條件為乙醇濃度65%、提取時間25 min、超聲功率180 W、提取溫度45 ℃,經(jīng)驗證,花青素提取實際值為7.815 mg/g,與預(yù)測值基本相符。穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示,避光條件下花青素?fù)碛懈叩姆€(wěn)定性,60 ℃以下的溫度有利于花青素的保存,溫度升高則花青素降解加速。本研究能為擴(kuò)大花青素的利用提供參考依據(jù)。