4 種水產(chǎn)副產(chǎn)品納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性比較

周更輝，耿銘陽，馬思沅，王婷，王震宇，孫黎明*

（1 大連工業(yè)大學食品學院 遼寧大連116034 2 國家海洋食品工程技術研究中心 遼寧大連 116034）

連續(xù)20 年，我國穩(wěn)居水產(chǎn)品產(chǎn)量世界首位，2020 年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量達到6 549.02 萬t。隨著我國水產(chǎn)品加工技術和水產(chǎn)品加工比例的不斷提高，隨之產(chǎn)生了數(shù)量龐大的下腳料等副產(chǎn)品，對其綜合利用已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖和加工產(chǎn)業(yè)的主要問題之一。這一問題也同樣困擾亞洲其它水產(chǎn)養(yǎng)殖大國以及北歐水產(chǎn)捕撈和加工業(yè)發(fā)達的幾個國家[1]。隨著對水產(chǎn)副產(chǎn)物中所含各類營養(yǎng)和功能組分研究的深入，采用各種技術從中提取和分離營養(yǎng)和活性組分，并開發(fā)營養(yǎng)保健食品，已經(jīng)成為水產(chǎn)副產(chǎn)物綜合利用的主要思路和手段[2-4]。除了直接提取分離法，微生物發(fā)酵法也是水產(chǎn)品加工[5-7]，水產(chǎn)副產(chǎn)物、廢棄物綜合利用并開發(fā)酶制劑和降膽固醇、抗氧化等功能產(chǎn)品[8-12]的另一大類有效方法。

納豆枯草芽孢桿菌（簡稱納豆菌，Bacillus subtilis natto）因抗擬性強、安全、可產(chǎn)生多種生物活性組分而知名[13]。納豆菌分泌產(chǎn)生的納豆激酶經(jīng)腸道吸收，具有抗血栓、降壓、降血脂、抗炎等作用，在心血管疾病的預防和輔助治療方面功效明確[14]，甚至有研究報道其具有潛在預防和治療老年癡呆和腫瘤的功能[15-16]。納豆菌能夠產(chǎn)生包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、凝乳酶等在內(nèi)的多種高活性胞外酶，其發(fā)酵底物也具有較強的寬泛性。此外，納豆菌還具有腸道菌群和腸道功能的調(diào)節(jié)作用，為可以廣泛而深入使用的優(yōu)良菌種。在水產(chǎn)加工及其副產(chǎn)物綜合利用方面，國內(nèi)外已有一些納豆菌發(fā)酵的報道。例如：高潔等[17]及陳應運等[18]優(yōu)化篩選出高產(chǎn)蛋白酶的納豆菌種，并用于發(fā)酵扇貝裙邊和蛤蜊，制備高活性的ACE 抑制肽[19-22]。Song等[23]報道納豆菌發(fā)酵蛤蜊所得多肽具有降壓作用。此外，納豆菌發(fā)酵還用于氨基酸口服液[24]、海鮮調(diào)味料[25]、脂肽[26]的制備等。

截止目前，納豆菌用于水產(chǎn)副產(chǎn)物綜合利用的研究相對較少，更鮮有與納豆菌的傳統(tǒng)底物大豆進行對比的研究報道。本研究選取鮑魚生殖腺、扇貝裙邊、羅非魚皮和海參卵4 種常見且蛋白含量高的水產(chǎn)副產(chǎn)品為原料進行納豆菌發(fā)酵，并以大豆為對照，對比其發(fā)酵產(chǎn)物的纖溶酶活性、抗凝血及ACE 抑制活性，來評價這些水產(chǎn)副產(chǎn)物是否適宜利用納豆菌發(fā)酵開發(fā)多肽等功能食品，從而探討水產(chǎn)副產(chǎn)品綜合利用的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生黃豆粉，市售；冷凍新鮮仿刺參卵和冷凍鹽漬扇貝裙邊，山東省煙臺市售；冷凍羅非魚皮，廣西百洋冷凍產(chǎn)品股份有限公司；鮑魚生殖腺凍干粉，大連獐子島漁業(yè)集團股份有限公司；納豆菌（Bacillus natto），實驗室保存菌種；ACE，實驗室常規(guī)從豬肺中提取；纖維蛋白原（74 mg/支）、凝血酶（150 BP/支）、蚓激酶（12 600 U/支），中國藥品生物制品檢定所；98%馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hippuryl-His-Leu-OH，HHL）、98%馬尿酸（Hippuric acid，HA）、乙腈（色譜純），美國Sigma 公司；鹽酸、氯化鈉等其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。APTT、TT、PT 試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 儀器與設備

M200 型酶標定量測定儀，瑞士Tecan Infinite公司；UV-5200 紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；KDN-103F 凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；E2695 高效液相色譜儀，美國Waters 公司；FE28pH 計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CF16RXII 高速冷凍離心機，日立HITACHI 公司；SCIENTZ-III 數(shù)控層析冷柜，寧波新芝生物科技有限公司；YXQ-LS-50SII 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司；SW-CJ-2FD 雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；YXQ-LS-50SII 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 鹽漬扇貝裙邊于自來水中浸泡5 h，每隔1 h 換水，凍干并研磨成粉；海參卵凍干后打粉；將冷凍羅非魚皮解凍后去鱗，凍干后打碎成粉。鮑魚生殖腺凍干粉和黃豆粉直接使用，上述原料于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總蛋白含量的測定 本試驗采用凱氏定氮法測定發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的含量。

1.3.3 納豆菌發(fā)酵 將上述底物以30 mg/mL（以蛋白量計）的質(zhì)量濃度置于三角瓶中，并加入最終濃度為1%的葡萄糖，調(diào)節(jié)pH 值至7.5，115 ℃高壓15 min 后冷卻至室溫；于瓶中接種體積分數(shù)為3%的納豆菌（終濃度為107CFU/mL），37 ℃培養(yǎng)72 h，間隔12 h 取樣。將發(fā)酵產(chǎn)物在7 000 r/min、4℃低溫離心20 min，收集上清液部分，以測定纖溶酶活性等指標。

1.3.4 纖溶酶活性的測定 參考Lee等[27]的方法測定發(fā)酵產(chǎn)物中的纖溶酶活性。將蚓激酶配制成0，1，2，4，6，8 FU/μL 的系列質(zhì)量濃度溶液，按照同樣方法測定纖溶酶活性，繪制標準曲線。

1.3.5 可溶性蛋白含量的測定 采用Folin-酚法測定發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量。

1.3.6 三氯乙酸可溶性寡肽（TCASOP）含量的測定 采用TCA 沉淀法與Folin-酚法測定發(fā)酵液中TCA 可溶性寡肽的含量。將發(fā)酵液與20% TCA等比例混勻，靜置20 min 后，16 500 g 離心15 min，采用Folin-酚法測蛋白，并計算TCA 可溶性寡肽含量。

1.3.7 抗凝血活性的測定 按照試劑盒說明書，取0.9 mL 正常人混合血漿，加入0.1 mL 發(fā)酵產(chǎn)物，用全自動血液檢測儀測定發(fā)酵產(chǎn)物對血漿活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）的影響。陽性對照為1 μg/mL 肝素鈉，空白對照為生理鹽水。

1.3.8 ACE 抑制活性的測定 參考石曉梅等[28]的方法。取25 μL 發(fā)酵液，加入同體積的ACE 溶液，漩渦振蕩2 min，37 ℃反應5 min。加入50 μL HHL，37 ℃反應1 h 后加入20 μL HCl（0.2 mol/L）。以蒸餾水代替樣品作為空白對照組。反應液過0.45 μm 膜后，用高效液相色譜（Waters）檢測HA含量。色譜柱為Ghall 12S05-2546 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。色譜條件為：進樣體積10 μL，流動相為乙腈∶水（25∶75，含0.05% TFA），洗脫流速0.5 mL/min，紫外檢測波長228 nm。ACE 抑制率（%）=（A0-A1）/A0×100，A0為空白對照組中HA 峰面積，A1為加入抑制劑組中HA 峰面積。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所有試驗均進行3 次重復，測定數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，使用SPSS 軟件采用單因素方差分析（ANOVA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以P＜0.05 為顯著性檢驗標準。采用Originpro 2019b 作圖。同一原料的不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 底物中的粗蛋白含量

利用凱氏定氮儀測定樣品中的蛋白含量，經(jīng)測定，黃豆粉、海參卵、鮑魚生殖腺、扇貝裙邊和羅非魚皮蛋白含量分別為39.17%，60.43%，49.35%，74.72%和95.91%。上述4 種水產(chǎn)副產(chǎn)品中的蛋白含量均較高，是利用納豆菌分泌的納豆激酶生產(chǎn)活性多肽的良好原料。

2.2 纖溶酶活性

圖1 顯示，隨著發(fā)酵時間的延長，5 種底物的纖溶酶活性呈先升高后降低的趨勢，黃豆粉和鮑魚生殖腺分別在發(fā)酵48，60 h 達到纖溶酶活性峰值，而羅非魚皮、海參卵和扇貝裙邊均在36 h 達到最大值。黃豆粉和羅非魚皮的纖溶酶活性峰值相近且相對最高，約在5 760 FU/mL 左右，扇貝裙邊的峰值活性最低。羅飛魚皮峰值過后，活力下降較慢且相對能夠維持較長時間相對穩(wěn)定。王婷等[29]以海參卵為底物，經(jīng)過條件優(yōu)化，納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物的纖溶酶活力在36 h 可達到6 723 U/mL 的峰值活性。底物種類的不同很可能是造成纖溶酶峰值時間和活力差異的主要原因，羅非魚皮和鮑魚生殖腺都是良好的用于納豆激酶生產(chǎn)的底物原料。

圖1 納豆菌發(fā)酵過程中纖溶酶活性變化（n=3）Fig.1 Change of thrombolysis activity during fermented by Bacillus natto（n=3）

2.3 可溶性蛋白含量（SPC）

圖2 顯示，在發(fā)酵0 h，即5 種原料粉經(jīng)高壓滅菌后，上清中SPC 的基數(shù)不同，黃豆粉和羅非魚皮的初始SPC 相對最高，海參卵的SPC 最低。對于蛋白質(zhì)特性不同的底物，納豆菌發(fā)酵液中SPC呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。發(fā)酵過程中，黃豆粉、羅非魚皮和扇貝裙邊發(fā)酵產(chǎn)物中的SPC 呈先增加后降低的趨勢，分別在36，36，48～60 h 達到峰值，而鮑魚生殖腺和海參卵發(fā)酵產(chǎn)物中SPC 則在觀察的72 h 內(nèi)持續(xù)上升。與0 h 比，黃豆粉、羅非魚皮、鮑魚生殖腺、扇貝裙邊、海參卵SPC 峰值分別上升了2.68，1.79，4.31，6.06 和8.63 mg/mL；而發(fā)酵72 h后上清中SPC 則分別上升了-0.66，-1.07，4.31，5.73，8.61 mg/mL。由此可見，發(fā)酵過程中，納豆菌通過分泌納豆激酶（絲氨酸蛋白酶）促進底物中不可溶蛋白向可溶性蛋白轉(zhuǎn)化，同時又有可能將SPC 進一步水解作為菌體自身新陳代謝所用，導致SPC 總量下降。以黃豆和羅非魚皮為底物時，呈現(xiàn)典型的二段式變化，展示了SPC 生成和被利用的二階段變化情況；而以海參卵、扇貝裙邊、鮑魚生殖腺為底物時，SPC 的生成量始終大于被菌體利用的量。

圖2 納豆菌發(fā)酵過程中SPC 含量的變化（n=3）Fig.2 Change of SPC during fermented by Bacillus natto（n=3）

2.4 三氯乙酸可溶性寡肽（TCASOP）

圖3 顯示，5 種底物發(fā)酵0 h 的TCASOP 含量均低于1 mg/mL。納豆菌發(fā)酵過程中，羅非魚皮發(fā)酵產(chǎn)物中的TCASOP 含量上升最快，于12 h 就升至5.26 mg/mL，24 h 就升至峰值，是5 種底物中最快到達峰值的且峰值最高。黃豆粉、扇貝裙邊、海參卵發(fā)酵產(chǎn)物中TCASOP 于24 h 快速上升，均在60 h 到達峰值，之后下降。鮑魚生殖腺最為特別，發(fā)酵過程中TCASOP 始終持續(xù)上升，發(fā)酵60～72 h 后TCASOP 還呈現(xiàn)快速上升狀態(tài)。與0 h 比，黃豆粉、羅非魚皮、鮑魚生殖腺、扇貝裙邊和海參卵發(fā)酵產(chǎn)物中TCASOP 峰值分別上升6.62，7.33，5.24，6.42，4.44 mg/mL，這提示羅非魚皮、扇貝裙邊都是適于通過納豆菌發(fā)酵制備活性肽的良好原料。

2.5 凝血酶時間（TT）

圖4 顯示，與空白對照組比較，鮑魚生殖腺在0 h 顯示出極強的TT 延長作用，遠遠超過陽性對照肝素鈉，但隨著發(fā)酵時間的延長，對TT 的延長作用減弱，很可能是鮑魚生殖腺中抗凝活性組分被納豆菌分泌的納豆激酶降解所致。60 h 后TT 的延長作用雖然明顯下降，但仍與1 μg/mL 肝素鈉持平，提示還有其它蛋白酶不能降解的組分發(fā)揮抗凝作用。羅非魚皮發(fā)酵產(chǎn)物對TT 的延長作用隨發(fā)酵時間持續(xù)增強，60 h 后接近1 μg/mL 肝素鈉的抗凝作用；海參卵的發(fā)酵產(chǎn)物也能延長TT，但無明顯變化規(guī)律。

圖4 納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物對TT 的影響（n=3）Fig.4 Effects of fermentation products by Bacillus natto on TT（n=3）

凝血酶時間（TT）是受檢血漿中加入標準化的凝血酶后，血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白所需的時間[30]，健康人TT 為14.0～21.0 s。TT 反映的是血漿中凝血酶活性及纖維蛋白原含量的變化。由此推測，鮑魚生殖腺、羅非魚皮和海參卵中均有能夠直接抑制凝血酶的抗凝組分，而羅非魚皮中的凝血酶抑制組分能夠隨著納豆菌發(fā)酵而活性增強或數(shù)量增多。

2.6 凝血酶原時間（PT）

圖5 顯示，鮑魚生殖腺本身具有凝血酶原時間PT 延長作用，但隨著發(fā)酵的進行活性逐漸降低。海參卵發(fā)酵產(chǎn)物對PT 的延長作用先增強后降低。黃豆粉、羅非魚皮和陜北裙邊的發(fā)酵產(chǎn)物均不能延長PT。PT 反映了血漿中外源性凝血途徑所涉及的凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的活性以及凝血酶活性是否受到抑制[30]，健康人的PT 在9.5～15.5 s。由此推測，鮑魚生殖腺自身和海參卵發(fā)酵產(chǎn)物很可能含有能夠抑制上述凝血因子或凝血酶的活性組分。

圖5 納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物對PT 的影響（n=3）Fig.5 Effects of fermentation products by Bacillus natto on PT（n=3）

2.7 活化部分凝血活酶時間（APTT）

圖6 顯示，鮑魚生殖腺對APTT 的延長作用很強，且隨著在發(fā)酵36 h 以內(nèi)保持穩(wěn)定，但之后活性顯著下降。海參卵對APTT 的延長作用先增強后降低，但總體較為穩(wěn)定；羅非魚皮和黃豆粉在發(fā)酵0 h 顯示出微弱的APTT 延長作用，但隨著發(fā)酵的進行該活性很快消失。扇貝裙邊及其發(fā)酵產(chǎn)物對APTT 無影響。APTT 一般用于評價人體內(nèi)源性凝血途徑所涉及的凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ以及凝血酶是否出現(xiàn)障礙[30]，健康人APTT 為23.0～43.0 s。

圖6 納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物對APTT 的影響（n=3）Fig.6 Effects of fermentation products by Bacillus natto on APTT（n=3）

4 種底物中，鮑魚性腺、海參卵、羅非魚皮熱水提取液自身顯示了一定的抗凝活性。其中，鮑魚性腺的抗凝活性最強。早在1990 年，國內(nèi)就有鮑魚提取物抗凝活性的報道[31]。此后，徐美玲等[32]、Li等[33]、Suleria等[34-36]、Zhao等[37]報道了 鮑魚生殖腺或內(nèi)臟提取物具有抗凝血活性，Li等[38]在鮑魚腹足中發(fā)現(xiàn)了抗凝血活性組分，上述研究都把抗凝血活性組分指向（硫酸）多糖類物質(zhì)。但本研究顯示納豆菌發(fā)酵會顯著降低鮑魚性腺水浸液的抗凝活性，提示發(fā)揮抗凝作用的很可能不只是多糖，本文作者利用中性蛋白酶處理鮑魚性腺水提取液也發(fā)現(xiàn)抗凝活性顯著下降，這提示蛋白也很可能發(fā)揮抗凝作用。

對纖溶酶（即納豆激酶）以及納豆菌其他代謝產(chǎn)品的抗凝活性報道不一。Kurosawa等[39]給志愿者單次口服納豆激酶2 000 FU 后，TT、PT、APTT數(shù)值仍在正常范圍內(nèi)，但血液中D-二聚體含量上升、凝血因子VIII 活性下降、抗凝血酶活性上升。Jang等[40]報道納豆激酶能夠通過抑制血小板聚集而延長凝血時間。Sumi等[41]報道納豆菌中的吡啶二甲酸與納豆菌的血小板抑制作用有關。圖4～圖6 顯示，黃豆的納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物沒有抗凝活性，說明本研究所用菌種產(chǎn)生的纖溶酶以及納豆菌自身代謝產(chǎn)物并不能延長TT、PT、APTT。由此推測羅非魚皮發(fā)酵產(chǎn)物對TT 的延長作用，也很可能是其自身蛋白的水解所致。對于羅非魚皮膠原蛋白、明膠以及明膠肽，并未見有抗凝血活性報道。但聶毅磊等[42]發(fā)現(xiàn)牛皮明膠的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物具有凝血酶抑制活性，作者推測明膠在被胰蛋白酶作用前，其抗凝因子的活性中心被包埋，因而不表現(xiàn)抗凝活性，而被胰蛋白酶作用后，其活性中心得以暴露，形成與抗凝血酶Ⅲ的活性中心序列片段（AGRSLNP）相似的多肽片段（AGRDGNP），抗凝活性得以表現(xiàn)。另外，Suojaranta等[43]報道了明膠對心血管術后病人抗凝血的抑制作用。由此，可以推測，羅非魚皮經(jīng)加熱滅菌后，膠原蛋白降解成明膠以及少量小分子明膠肽，有微弱延長TT 作用，但在納豆激酶水解作用下，進一步產(chǎn)生了具有抗凝作用的明膠肽，因此隨著納豆菌發(fā)酵的進行，羅非魚皮發(fā)酵產(chǎn)物對TT 的延長作用持續(xù)增強（圖4）。

2.8 ACE 抑制活性

如圖7 所示，5 種底物在納豆菌發(fā)酵過程中均顯示出一定的ACE 抑制活性。發(fā)酵36～60 h 期間，黃豆粉的ACE 抑制活性略微升高，且一直高于其它樣品。其次是扇貝裙邊，但其60 h 發(fā)酵產(chǎn)物的活性（94.66%）已經(jīng)超過黃豆粉的活性（91.7%）。鮑魚生殖腺和羅非魚皮發(fā)酵產(chǎn)物的ACE 抑制活性相對最低。有研究認為水產(chǎn)品中的降壓肽相比于其它食品蛋白源的降壓肽效果更好[44]。目前，ACE 抑制肽的研究大多數(shù)都是基于蛋白酶酶解的制備方法，而采用納豆菌發(fā)酵不但能夠生成具有降壓作用的ACE 抑制肽，還伴隨有其它溶栓等作用的纖溶酶等活性分子。陳應運等[19-20]利用納豆菌發(fā)酵蛤蜊（菲律賓蛤仔）制備ACE 抑制肽，所得多肽的ACE 抑制率為80.49%。王婷等[29]利用納豆菌發(fā)酵海參卵，獲得了ACE 抑制率高達90%的發(fā)酵產(chǎn)物。高潔等[17]利用納豆菌發(fā)酵扇貝裙邊制備ACE 抑制肽，抑制率達到83.7%。Gao等[21]對扇貝裙邊納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物中的多肽進行了分離純化并利用大鼠高血壓模型驗證了多肽的降壓作用。由此可見，采用納豆菌發(fā)酵的方法能夠用于降壓肽的開發(fā)。對于羅非魚皮和鮑魚生殖腺，納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物的ACE 抑制活性較低，尚需進一步優(yōu)化和確認是否適于進行納豆菌發(fā)酵制備ACE抑制肽。

圖7 納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物對ACE 抑制率的影響（n=3）Fig.7 Effect of fermentation products on inhibition rate of ACE at different time（n=3）

3 結論

對羅非魚皮、鮑魚生殖腺、扇貝裙邊和海參卵4 種水產(chǎn)品加工副產(chǎn)品進行納豆菌液體發(fā)酵，并與納豆菌發(fā)酵的傳統(tǒng)底物黃豆做對照，對比發(fā)酵產(chǎn)物中SPC 和TCASOP 的含量、纖溶酶活力、抗凝血活性以及ACE 抑制活性的變化。納豆菌均能利用4 種副產(chǎn)品合成纖溶酶，其中以羅非魚皮和鮑魚性腺為底物合成的酶活力最高；納豆菌均可將4 種副產(chǎn)品中的未/不溶解蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白及多肽。鮑魚性腺提取液自身就具有很強抗凝血活性，但發(fā)酵過程中活性明顯下降。羅非魚皮和海參卵發(fā)酵產(chǎn)物也具有一定抗凝活性，但活性較弱。4 種副產(chǎn)品的發(fā)酵產(chǎn)物均有ACE 抑制活性，扇貝裙邊活性最強?？傊? 種副產(chǎn)品自身及其納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物均在溶血栓、抗凝血、降壓這三方面各具特點，對其提取物和納豆菌發(fā)酵產(chǎn)物進行組合應用，有望開發(fā)出用于血栓性疾病、凝血傾向和高血壓輔助預防和治療的功能食品，下一步需要將上述功能利用動物實驗進行驗證和進一步研究。