體外消化對β-胡蘿卜素大豆分離蛋白納米顆粒黏液層滲透及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響機(jī)制

陳 羚，呂 園，徐菲菲，鐘 芳,*

（1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫 214122；3.江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；4.嘉興未來食品研究院，浙江 嘉興 314050）

蛋白質(zhì)納米載體已被證實(shí)能夠有效改善脂溶性營養(yǎng)素（例如β-胡蘿卜素（β-carotene，BC））的生物利用率。然而，由于嚴(yán)苛的胃腸道環(huán)境、腸道黏液層屏障以及小腸上皮的跨膜限制，納米載體的口服遞送效果仍受到質(zhì)疑[1]。大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）基納米顆粒被認(rèn)為是包載BC的理想載體，具有良好的生物相容性和可再生性。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)口吸收過程中，蛋白質(zhì)載體容易受到極端胃腸條件的影響，界面蛋白發(fā)生水解，使得BC的疏水內(nèi)核暴露于水相中；同時，腸液中的膽鹽、磷脂等小分子活性劑會吸附到疏水內(nèi)核表面，對BC進(jìn)行再包埋，形成由蛋白水解肽、膽鹽、磷脂、BC內(nèi)核共同組成的尺寸在100 nm以下的重構(gòu)載體[2]。盡管這類重構(gòu)載體在胃腸道中的穩(wěn)定性較差，但在小鼠血漿中顯示出良好的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收效率[3]。

胃腸道消化過程中的載體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變可能影響載體在小腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和轉(zhuǎn)運(yùn)模式。Ma Yuhua等報(bào)道，在消化過程中與膽鹽相互作用的脂質(zhì)納米粒與消化前的微粒相比，可以將水飛薊賓的生物利用度顯著提高7～8 倍[4]。Akbari等研究了從油菜籽中提取的蛋白質(zhì)所制備姜黃素納米顆粒在消化前后內(nèi)吞形式的變化，發(fā)現(xiàn)消化前細(xì)胞攝取納米顆粒的主要形式是網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，消化后細(xì)胞攝取納米顆粒的主要形式是小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用[5]。也有文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)膽鹽修飾的納米顆?？梢源龠M(jìn)其在黏液層的滲透性[6]。

本研究構(gòu)建載有BC的SPI納米顆粒，通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、納米粒度儀和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀對納米載體的形貌、粒度以及包封率等基本性質(zhì)進(jìn)行考察。進(jìn)一步地，通過構(gòu)建體外模擬消化模型，獲取消化后的重構(gòu)納米載體，并對其基本結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分析。最后，采用人體結(jié)腸癌細(xì)胞系（Caco2）的分化模型與HT29細(xì)胞系共培養(yǎng)，模擬小腸上皮細(xì)胞的黏液層和緊密細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，以評估消化后重構(gòu)納米載體在黏液層中的滲透性以及在小腸上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和轉(zhuǎn)運(yùn)模式。旨在探討消化過程對蛋白質(zhì)納米載體結(jié)構(gòu)的影響以及重構(gòu)納米載體突破黏液層和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)雙重吸收屏障的能力及可能機(jī)制，以期為進(jìn)一步明確納米載體口服遞送的有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI、磷鎢酸鹽、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二巰基蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、熒光素鈉、阿利新蘭、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4）、無水乙醇（分析純） 中國國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；BC（純度＞97%） 東京化學(xué)工業(yè)有限公司；豬胰蛋白酶（8×USP）、豬膽汁提取物（B8631）美國Sigma-Aldrich公司；人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco2）、人體結(jié)腸腺癌杯狀細(xì)胞（HT29） 美國ATCC細(xì)胞庫；Hank’s緩沖液（Hank’s balanced salt solutions，HBSS）、高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、雙抗、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、非必需氨基酸（100×） 美國GIBCO公司；奧全健腸溶空囊 山西廣生膠囊有限公司；乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙腈、甲基叔丁基醚（色譜級） 上海泰坦科技股份有限公司；超純水 屈臣氏有限公司；總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101S恒溫式加熱磁力攪拌器 鞏義市俞華儀器有限公司；T25型高速分散機(jī) 德國IKA公司；N-EVAP-24氮吹儀 美國Organomatio公司；2695 HPLC儀、2998光電二極管陣列（photo-diode array，PDA）檢測器 美國沃特世科技有限公司；ChemiDoc XRS＋化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；Zetasizer Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀 英國馬爾文公司；Avanti JXN-26高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；Tecnai 12 TEM 美國FEI電子光學(xué)有限公司；Millicell ERS-2細(xì)胞電阻儀 美國Millipore公司；Q700超聲波破碎儀 美國Qsonica Misonix公司；5430高速離心機(jī)、CellXpert C170二氧化碳培養(yǎng)箱 德國Eppendorf公司；M2全波長酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；CKX53倒置顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BC-SPIs的制備及性質(zhì)表征

1.3.1.1 載有BC的SPI納米顆粒的制備

將SPI溶于超純水中配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的SPI溶液，在室溫下攪拌2 h以確保SPI完全水合，隨后在85 ℃水浴中加熱10 min促進(jìn)其自組裝。然后在15 000×g下離心10 min后收集上清液，即為納米顆粒（SPIs）溶液。將BC（溶解后質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL）溶解在乙酸乙酯中，在50 ℃水浴中攪拌20 min，同時加入二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）（每100 mL乙酸乙酯中添加0.1 g）以防止BC氧化分解，得到BC有機(jī)相溶液。使用8 000 r/min的高速分散機(jī)分散SPIs水溶液，同時將BC有機(jī)相溶液逐滴滴加到SPIs溶液中，獲得BC、納米粒子質(zhì)量比為1∶200的納米顆粒溶液并繼續(xù)高速分散4 min。最后使用氮吹儀除去溶液中的乙酸乙酯，得到質(zhì)量濃度為20 mg/mL的BC-SPIs顆粒分散液用于后續(xù)研究。

1.3.1.2 粒徑測定

參考Chen Ling等的方法[7]，使用納米粒度及Zeta電位分析儀測定消化前和消化期間BC-SPIs樣品的平均粒徑和粒徑分布情況。取消化前及消化期間100 μL的樣品，使用10 mL的PBS（0.02 mol/L、pH 7.0）進(jìn)行稀釋。測定時設(shè)定BC-SPIs的相對折射率為1.09，所有的測試在25 ℃下進(jìn)行。

1.3.1.3 Zeta電位測定

采用納米粒度及Zeta電位分析儀測定BC-SPIs消化前和消化期間的Zeta電位。使用PBS（0.005 mol/L、pH 7.0）稀釋樣品100 倍，于室溫下測定其Zeta電位。

1.3.1.4 形貌觀察

使用TEM對BC-SPIs進(jìn)行形貌觀察[8]。利用去離子水將BC-SPIs和SPIs均稀釋到0.1 mg/mL，然后滴在涂有碳的300 目銅格上，靜置5 min后吸去多余液體。用磷鎢酸鹽溶液（10 mg/mL）染色樣品30 s。最后將銅網(wǎng)放置在干燥器中室溫干燥一夜，利用TEM在120 kV下觀察樣品。

1.3.1.5 BC-SPIs中BC的包封率測定

BC-SPIs中BC的包封率測定參考文獻(xiàn)[9]。取1 mL BC-SPIs顆粒分散液樣品，15 000 r/min離心20 min，除去游離的BC。轉(zhuǎn)移0.5 mL上清液到玻璃試管中，加入2 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，確保兩相充分混合后在5 000×g下離心5 min。隨后，將含有BC的有機(jī)層轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中。上述操作重復(fù)多次直至上層清液無色，再在容量瓶中加入乙酸乙酯定容至10 mL。

使用配備有2998 PDA檢測器的HPLC系統(tǒng)對樣品中的BC質(zhì)量濃度進(jìn)行定量分析。色譜柱為COSMOSIL C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配備有預(yù)柱。HPLC條件如下：流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：450 nm；分析時間：28 min；流動相：A相為V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（超純水）＝84∶14∶2，B相為二氯甲烷；梯度洗脫程序：0～15 min，80% A、20% B線性變化到45% A、55% B；15～20 min，45% A、55% B；20～25 min，45% A、55% B線性變化到80% A、20% B；25～28 min，80% A、20% B。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算BC質(zhì)量濃度，按公式（1）計(jì)算BC-SPIs對BC的包封率。

1.3.2 模擬消化模型構(gòu)建及性質(zhì)測定

1.3.2.1 模擬小腸消化模型構(gòu)建

參照Chen Ling等的方法構(gòu)建模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）消化體系[2]，并對BC-SPIs在SIF中的消化行為進(jìn)行探究。

配制20 mL SIF（pH 7.0、0.1 mol/L PBS，含8 mg/mL膽鹽、1 mg/mL胰蛋白酶、5 mmol/L氯化鈣），在37 ℃酶解罐中孵育5 min。將BC-SPIs凍干為粉末，在100 mg的腸溶片空殼中加入400 mg BC-SPIs粉末，在20 mL去離子水中加入2 g BC-SPIs腸溶片，并與20 mL SIF混合，溫度設(shè)置為37 ℃，100 r/min攪拌速率下消化2 h。

對消化過程中BC-SPIs的界面蛋白組成、Zeta電位及其膽鹽吸附情況進(jìn)行測定。

1.3.2.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考文獻(xiàn)[9]，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠和5%的濃縮膠對消化過程中的BC-SPIs進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。將樣品與上樣緩沖液（含14.4 mmol/L的β-巰基乙醇）混合，使蛋白質(zhì)的終質(zhì)量濃度為8 mg/mL。將混合物在沸水中加熱5 min后于12 000×g離心10 min，去除沉淀。在凝膠的每孔中加入10 μL樣品，濃縮電壓和分離電壓設(shè)置為200 V。當(dāng)樣品距離底面約0.5 cm時，停止反應(yīng)。使用0.1 g/100 mL的考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色凝膠60 min，用含體積分?jǐn)?shù)22.5%甲醇和5%醋酸的脫色液對凝膠脫色。使用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描。

1.3.2.3 表面膽鹽吸附測試

參照Naumann等的方法[10]，將2 mL SIF消化液消化2 h后的樣品（1.3.2.1節(jié)制備）轉(zhuǎn)移到透析袋內(nèi)（截留分子質(zhì)量1 000 Da），置于48 mL的PBS（50 mmol/L、pH 7）中。在37 ℃、150 r/min條件下使用振蕩水浴透析24 h。根據(jù)總膽汁酸試劑盒說明書測定透析前消化液和透析外液中的膽鹽質(zhì)量濃度，表面膽鹽吸附率按公式（2）計(jì)算。

1.3.3 消化前后BC-SPIs的細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑分析

1.3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco2）和人體結(jié)腸腺癌杯狀細(xì)胞（HT29）第7～19代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 mL完全培養(yǎng)基（體積分?jǐn)?shù)10% FBS、1%非必需氨基酸和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗）的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為37 ℃，CO2的體積分?jǐn)?shù)為5%。當(dāng)細(xì)胞的匯合程度達(dá)到80%～90%時（＜4 d），使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.3.2 Caco2細(xì)胞模型的建立

將Caco2細(xì)胞培養(yǎng)3～5 代后，根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法，將Caco2細(xì)胞以1×105個/cm2的密度接種到6 孔Transwell膜（直徑15 mm、孔徑0.4 μm）上，每2 d換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)約21 d左右分化形成細(xì)胞單層。

1.3.3.3 Caco2/HT29共培養(yǎng)細(xì)胞模型的建立

根據(jù)Song Hongdong等的方法[12]，將Caco2和HT29以9∶1的密度比按1×105個/cm2的密度接種到6 孔Transwell膜上，每2 d換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)約21 d左右形成含黏液層的細(xì)胞單層。

1.3.3.4 細(xì)胞跨膜電阻的測定

使用電阻儀測定細(xì)胞模型在21 d的培養(yǎng)分化過程中細(xì)胞跨膜電阻的變化[11]，在每次更換培養(yǎng)基后進(jìn)行測定。細(xì)胞跨膜電阻按公式（3）計(jì)算。

式中：RS為Caco2細(xì)胞或Caco2/HT29共培養(yǎng)細(xì)胞單層模型的電阻/Ω；RB為聚碳酸酯多孔膜在培養(yǎng)基中的自身電阻/Ω；A為有效膜面積（4.52 cm2）。

1.3.3.5 熒光素鈉滲透實(shí)驗(yàn)

以DMEM為溶劑制備2 mg/mL的熒光素鈉溶液。使用HBSS清洗Caco2或Caco2/HT29共培養(yǎng)21 d的細(xì)胞模型兩遍，在細(xì)胞培養(yǎng)室頂端（apical，AP）加入1.5 mL 2 mg/mL的熒光素鈉溶液，底端（basolateral，BL）加入2 mL DMEM，在37 ℃下孵育4 h，每隔一段時間吸取適量的BL端溶液，并補(bǔ)充新的DMEM溶液。使用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長440 nm、發(fā)射波長525 nm下測定BL端培養(yǎng)基中熒光素鈉的熒光強(qiáng)度。用DMEM稀釋2 mg/mL的熒光素鈉溶液并測定其熒光強(qiáng)度獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時，以空白聚碳酸酯多孔膜作對照，按公式（4）計(jì)算熒光素鈉透過率，并以此判斷細(xì)胞模分化后的完整性。

1.3.3.6 細(xì)胞膜分化程度的考察

細(xì)胞頂端堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力可以表征Caco2細(xì)胞膜的分化成熟程度[11]。使用ALP試劑盒測定1～21 d內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)室AP和BL培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力，以AP、BL培養(yǎng)基中的ALP活力比值（AP/BL比值）判斷細(xì)胞膜的分化程度。

1.3.3.7 阿利新藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)

阿利新藍(lán)是一種對黏液中的黏蛋白具有特殊染色作用的染色劑，可用于直觀評價黏液細(xì)胞的存在情況[13]。將細(xì)胞以0.8×105個/mL的密度接種于6 孔板中。染色前使用PBS清洗細(xì)胞2 次，然后加入0.5 mL 4%（體積分?jǐn)?shù)）多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，37 ℃孵育30 min后吸出，再使用PBS清洗細(xì)胞2 次，加入含有1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）阿利新蘭的3%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸溶液，37 ℃孵育30 min后，用PBS洗去多余的阿利新藍(lán)。用倒置顯微鏡觀察在7、14 d和21 d的黏液染色情況。

1.3.3.8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法對消化前后的BC-SPIs進(jìn)行細(xì)胞毒性測定[14]。用PBS配制5 mg/mL的MTT溶液。在96 孔板孔中加入100 μL濃度為5.0×105個/mL的細(xì)胞液，37 ℃孵育12 h左右，使每個孔的細(xì)胞匯合程度達(dá)到40%左右進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。先使用PBS簡單清洗細(xì)胞兩遍，然后加入不同稀釋倍數(shù)的樣品（2、5、10、20、40、80 倍和100 倍），37 ℃孵育4 h。移去培養(yǎng)基，再用PBS清洗細(xì)胞，加入100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），于37 ℃孵育2 h。移去培養(yǎng)基，再用PBS清洗細(xì)胞，并加入100 μL二甲基亞砜，振蕩96 孔板5 min，使MTT紫色結(jié)晶完全溶解，使用酶標(biāo)儀檢測每孔細(xì)胞在490 nm波長處的光密度值（OD值），按公式（5）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：空白組為不接種細(xì)胞的空白孔；對照組為不添加BC-SPIs、僅接種細(xì)胞的孔。

1.3.3.9 兩種細(xì)胞模型對BC的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收的考察

使用生長分化21～28 d的Caco2和Caco2/HT29共培養(yǎng)細(xì)胞模型對消化前后BC-SPIs的轉(zhuǎn)運(yùn)與吸收進(jìn)行考察[11]。方法如下：使用DMEM溶液清洗AP端細(xì)胞2 次，再在AP端加入用DMEM稀釋過的樣品1.5 mL（BC質(zhì)量濃度控制在4.4 μg/mL），在BL端加入2 mL DMEM。在37 ℃下孵育，在此期間使用跨膜電阻儀定時測定AP端和BL端之間區(qū)域的電阻，確保在整個孵育過程中細(xì)胞膜能夠保證完整性（不低于250 Ω·cm2）。孵育4 h后，收集AP端DMEM溶液，加入0.5 mL 4 ℃含體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液的PBS終止實(shí)驗(yàn)，分別收集BL端的DMEM溶液和Transwell膜上的單層細(xì)胞。使用HPLC法測定搜集的3 個部分中的BC及其代謝產(chǎn)物的含量。其中，BL端DMEM中BC或其代謝產(chǎn)物的含量是轉(zhuǎn)運(yùn)量；細(xì)胞層中BC或其代謝產(chǎn)物的含量是積累量；求BC及其代謝產(chǎn)物總含量時將其均轉(zhuǎn)化為VA當(dāng)量后再求和，以此表征總積累量，即積累的VA當(dāng)量。

1.3.3.10 BC的代謝產(chǎn)物定量分析

使用細(xì)胞刮棒獲得0.5 mL細(xì)胞懸液。其中，0.4 mL用于定量BC及其代謝產(chǎn)物含量。剩余的0.1 mL用于使用BCA法測定蛋白質(zhì)含量。

BC和視黃醇棕櫚酸酯定量的HPLC方法同1.3.1.5節(jié)。視黃醇和維生素A酸含量采用HPLC法進(jìn)行定量[15]，具體條件如下：色譜柱為COSMOSIL C30柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配備有預(yù)柱；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：450 nm或325 nm；分析時間：36 min；樣品室溫度：4 ℃；流動相：A相（70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈＋10%甲基叔丁基醚＋20%乙酸銨（80 mmol/L、pH 4.5））和B相（76%乙腈＋20%甲基叔丁基醚＋4%乙酸銨水溶液（80 mmol/L、pH 4.5））；梯度洗脫程序：0～3 min，100% A；3～10 min，從100% A、0% B線性變化到25% A、75% B；10～25 min，從25% A、75% B線性變化到0% A、100% B；25～27 min，100% B；27～29 min，從0% A、100% B線性變化到100% A，0% B；29～36 min，保持100% A。

1.3.3.11 黏液層滲透性考察

將細(xì)胞以0.8×105個/mL的密度接種于6 孔板中，使用生長分化14 d的HT29細(xì)胞模型對消化前后BC-SPIs的黏液層滲透率進(jìn)行考察。方法如下：移去DMEM培養(yǎng)基，再向孔中加入用DMEM稀釋過的2 mL樣品（BC質(zhì)量濃度控制在4.4 μg/mL）。在37 ℃下孵育4 h后，移去孔中培養(yǎng)基，使用4 ℃的PBS清洗黏液2 遍。使用0.5 mL 4 ℃含體積分分?jǐn)?shù)10%乙醇的PBS終止實(shí)驗(yàn)，收集單層細(xì)胞。使用HPLC法定量測定細(xì)胞中BC及其代謝產(chǎn)物的含量，求總含量時將其轉(zhuǎn)化為VA當(dāng)量，即為透過黏液層的VA當(dāng)量。

1.3.3.12 BC-SPIs轉(zhuǎn)運(yùn)模式分析

通過將細(xì)胞與特定的內(nèi)吞作用抑制劑預(yù)孵育以探究消化前后BC-SPIs的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)模式[5]。1.5 mL Caco2細(xì)胞以0.8×105個/mL的密度接種在6 孔板孔中，并孵育至完全匯合。去除培養(yǎng)基，然后加入2 mL使用完全DMEM制備的氯丙嗪（20 μg/mL）、槲皮素（20 μg/mL）、吲哚美辛（100 μg/mL）、β-環(huán)糊精（2 mg/mL）和阿米洛利（40 μg/mL）抑制劑溶液，在37 ℃孵育1 h。隨后，將2 mL消化前或消化后的BC-SPIs（以DMEM稀釋，BC質(zhì)量濃度控制在4.4 μg/mL）添加到孔板中，在37 ℃下孵育4 h。同時，為研究BC-SPIs是否以主動轉(zhuǎn)運(yùn)模式吸收，將上述實(shí)驗(yàn)操作過程中的兩次孵育溫度均改成4 ℃。孵育后使用PBS洗滌BC-SPIs和抑制劑，加入1 mL PBS，收集細(xì)胞。使用細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞組織。在細(xì)胞破碎液中按體積比1∶1加入含0.1 g/100 mL BHT的四氫呋喃溶液，渦旋1 min，再加入1 mL乙酸乙酯，繼續(xù)渦旋1 min，于5 000×g離心5 min，收集上層淡黃色有機(jī)相于玻璃試管中，重復(fù)上述萃取過程至少3 次以確保BC及其相關(guān)代謝產(chǎn)物萃取完全。收集的有機(jī)相用氮?dú)獯蹈桑偃苡?00 μL含0.1 g/100 mL BHT的正己烷中。采用HPLC法測定BC及其代謝產(chǎn)物的含量，并將其轉(zhuǎn)化為VA當(dāng)量以計(jì)算BC的相對吸收率，如式（6）所示。

通過改變SIF中膽鹽和胰蛋白酶的添加情況，探究模擬腸消化中不同消化條件因素對BC-SPIs轉(zhuǎn)運(yùn)模式的影響。具體條件如下：1）不消化，直接考察Caco2細(xì)胞對BC-SPIs的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑（消化前組）；2）考察SIF消化對Caco2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)BC-SPIs方式的影響（消化后組）；3）考察腸消化過程中胰蛋白酶對Caco2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)BC-SPIs方式的影響：SIF中不添加膽鹽（胰蛋白酶組）；4）考察腸消化過程中膽鹽對Caco2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)BC-SPIs方式的影響：在SIF中不添加胰蛋白酶（膽鹽組）。

收集上述消化條件下的BC-SPIs，依照1.3.3.12節(jié)的方法對其轉(zhuǎn)運(yùn)模式進(jìn)行考察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS Statistics Version 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）。采用Graphpad 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BC-SPIs結(jié)構(gòu)特性表征

如表1所示，SPIs的多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.39，粒徑分布較為均一，其電位低于－20 mV，表明其顆粒穩(wěn)定性較高。包封BC后，平均粒徑較包封前有所增大，可能是因?yàn)锽C被包埋進(jìn)入到顆粒內(nèi)部，使顆粒膨脹。Chen Feiping等的研究中也觀察到BC-SPIs在與姜黃素絡(luò)合后粒徑增大的現(xiàn)象[16]。BC-SPIs電位的絕對值較包封前有所提高，說明載入BC后納米顆粒整體穩(wěn)定性有了進(jìn)一步提高。BC-SPIs中BC的包封率為40.21%，與其他報(bào)道結(jié)果相比有所提高，李炳章等采用真空冷凍干燥技術(shù)制備出以SPI為載體的姜黃素納米顆粒，包封率僅為33.90%[17]。

表1 BC-SPIs的平均粒度、PDI、Zeta電位和包封率Table 1 Average diameter, polymer dispersity index (PDI), zeta potential and encapsulation efficiency of BC-SPIs

使用TEM進(jìn)一步觀察BC-SPIs的形貌結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。BC-SPIs形態(tài)呈球形顆粒。比較發(fā)現(xiàn)，利用納米粒度及Zeta電位分析儀測得的BC-SPIs平均粒徑比TEM圖像中觀察到的更大，這是因?yàn)門EM觀察的是干燥狀態(tài)下的顆粒形貌，而米粒度及Zeta電位分析測量的是顆粒在溶液中的尺寸[18]。在水溶液中，顆粒的表面存在水化層，在TEM干燥制樣的過程中，水分蒸發(fā)會破壞水化層，使顆粒失水皺縮，導(dǎo)致尺寸變小[19]。

圖1 SPIs（A）及BC-SPIs（B）的TEM圖像Fig. 1 Transmission electron microscopic image of SPIs (A) and BC-SPIs (B) nanoparticles

2.2 BC-SPIs在消化過程中的結(jié)構(gòu)特性變化

2.2.1 消化過程中BC-SPIs的粒徑變化

如圖2所示，在SIF消化的整個過程中，BC-SPIs粒徑逐漸增大，這是因?yàn)镾IF消化液中存在的胰蛋白酶使BC-SPIs界面蛋白上的賴氨酸殘基、精氨酸殘基等被切斷，界面蛋白層被破壞，使疏水基團(tuán)暴露，分子發(fā)生聚集，形成大的聚集體，導(dǎo)致粒徑上升，并在隨后的消化過程中結(jié)構(gòu)繼續(xù)展開，使顆粒不斷聚集，粒徑持續(xù)增大[20]。同時，BC-SPIs在與SIF消化液混合0 min時的粒徑明顯增大，這是因?yàn)橄旱母唠x子濃度造成納米顆粒表面電荷降低，從而發(fā)生了顆粒的部分聚集。

圖2 消化過程中BC-SPIs的平均粒徑變化Fig. 2 Changes in average diameter of BC-SPIs during digestion

2.2.2 消化過程中BC-SPIs的界面蛋白組成、Zeta電位及其膽鹽吸附情況

如圖3A所示，在SIF消化的過程中，BC-SPIs的界面蛋白在消化的前5 min內(nèi)，蛋白條帶密度明顯下降，降解后的條帶主要集中在分子質(zhì)量低于37 kDa的區(qū)域內(nèi)，印證了2.2.1節(jié)中顆粒粒徑的增大。消化后的蛋白水解產(chǎn)物易與膽鹽發(fā)生疏水相互作用，結(jié)合水相中的游離膽鹽[21]，而帶不同負(fù)電的膽鹽在顆粒表面的吸附會改變顆粒的表面電荷[22]。如圖3B所示，經(jīng)過SIF消化后，BC-SPIs的表面Zeta電位絕對值增加，電位變化越大，說明界面蛋白被膽鹽取代的程度越高。通過透析法測定了消化后膽鹽在BC-SPIs表面上的吸附情況，結(jié)果表明消化液中有56.37%的膽鹽吸附于BC-SPIs消化2 h后的顆粒表面。

圖3 消化過程中BC-SPIs的SDS-PAGE（A）以及Zeta電位（B）的變化Fig. 3 Changes in SDS-PAGE (A) and zeta potential (B) of BC-SPIs during digestion

2.3 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透及細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的考察結(jié)果

2.3.1 利用Caco2單層細(xì)胞模轉(zhuǎn)運(yùn)模型考察的結(jié)果

2.3.1.1 細(xì)胞跨膜電阻和熒光素鈉滲透性

細(xì)胞跨膜電阻反映的是細(xì)胞模型在分化時細(xì)胞間連接的緊密程度，可用于表征細(xì)胞膜的完整性，電阻高于250 Ω·cm2代表細(xì)胞膜緊密程度良好。如圖4A所示，Caco2細(xì)胞模型在培養(yǎng)分化21 d后跨膜電阻達(dá)到890.44 Ω·cm2，說明細(xì)胞膜緊密程度高，適用于吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[23]。

圖4 孵育21 d內(nèi)Caco2細(xì)胞跨膜電阻（A）以及熒光素鈉透過率（B）的變化Fig. 4 Changes in trans-epithelial electrical resistance (TEER) (A) and fluorescein sodium transport rate (B) of Caco2 monolayer during 21 days of incubation

熒光素鈉（分子質(zhì)量為376 Da）滲透性可用以表征單層細(xì)胞膜的緊密連接程度。如圖4B所示，在前15 min內(nèi)就已有大量熒光素鈉穿透空白膜（對照），而Caco2細(xì)胞模型在孵育4 h后也僅有2.59%的熒光素鈉通過細(xì)胞膜，說明細(xì)胞膜致密程度良好。

2.3.1.2 細(xì)胞膜的分化程度

除了單層膜的緊密程度和完整性，其頂端功能酶系的發(fā)育程度也是考察單層膜是否適合評價化合物轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的另一項(xiàng)重要指標(biāo)[11]。在孵育分化過程中，Caco2單層細(xì)胞膜AP端酶系會逐漸成熟，直至酶活力不變。盡管平行樣品間酶活力的基礎(chǔ)值有所差異，但由于BL端的酶活力在孵育期間相對穩(wěn)定，故可用AP端與BL端ALP活力的比值（AP/BL比值）來評價單層細(xì)胞膜的分化程度。如圖5所示，在培養(yǎng)分化的過程中，AP/BL比值隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，在19 d時達(dá)到比較穩(wěn)定的狀態(tài)，表明單層細(xì)胞膜頂端酶系的生長已經(jīng)成熟，頂端酶系不再發(fā)生變化。

圖5 孵育21 d內(nèi)Caco2細(xì)胞膜頂端ALP活力的變化Fig. 5 Changes in alkaline phosphatase activity of Caco2 monolayer during 21 days of incubation

2.3.1.3 BC-SPIs細(xì)胞毒性考察

Narain等報(bào)道膽鹽分子在胃腸道中作為陰離子表面活性劑，某些濃度下會表現(xiàn)出細(xì)胞毒性[24]，說明消化液中膽鹽的存在會提高消化產(chǎn)物的細(xì)胞毒性，而本實(shí)驗(yàn)消化后樣品中含有游離的膽鹽分子，因此有必要先進(jìn)行安全實(shí)驗(yàn)再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖6所示，以細(xì)胞存活率不低于75%作為標(biāo)準(zhǔn)，確定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀釋倍數(shù)為5 倍，消化后產(chǎn)物安全的最低稀釋倍數(shù)為10 倍。消化液中BC質(zhì)量濃度經(jīng)HPLC定量為44 μg/mL，根據(jù)消化后產(chǎn)物的安全稀釋倍數(shù)確定Caco2細(xì)胞模型中BC最高添加量為4.4 μg/mL。

圖6 BC-SPIs在消化前（A）、后（B）的Caco2細(xì)胞毒性Fig. 6 Cytotoxicity of BC-SPIs before (A) and after (B) digestion to Caco2 cells

2.3.2 利用Caco2-HT29共培養(yǎng)細(xì)胞模型的考察結(jié)果

2.3.2.1 細(xì)胞跨膜電阻和熒光素鈉滲透性

如圖7A所示，Caco2/HT29共培養(yǎng)的細(xì)胞模型在21 d后細(xì)胞跨膜電阻為720.44 Ω·cm2，低于Caco2細(xì)胞跨膜電阻。這是因?yàn)镃aco2細(xì)胞之間能非常緊密地連接，而HT29細(xì)胞會改變細(xì)胞的連接程度導(dǎo)致跨膜電阻降低[25]。Caco2/HT29細(xì)胞跨膜電阻大于130 Ω·cm2，被認(rèn)為細(xì)胞單層連接較為緊密，能夠形成致密的單層細(xì)胞模型[22]。

如圖7B所示，Caco2/HT29共培養(yǎng)細(xì)胞模型在孵育4 h后，僅有3.38%的熒光素鈉通過細(xì)胞膜，遠(yuǎn)低于空白的聚碳酸酯膜（對照），這說明經(jīng)過Caco2/HT29共培養(yǎng)細(xì)胞模型細(xì)胞膜致密，可用于后續(xù)研究。

2.3.2.2 細(xì)胞膜頂端ALP活力

由圖8可知，在21 d的培養(yǎng)過程中，AP/BL比值在17 d時達(dá)到穩(wěn)定，表明在共培養(yǎng)細(xì)胞模型的頂端酶系已經(jīng)成熟，未受到黏液層的影響。

圖8 孵育21 d內(nèi)Caco2-HT29共培養(yǎng)模型頂端ALP活力的變化Fig. 8 Changes in alkaline phosphatase activity of Caco2-HT29 co-culture during 21 days of incubation

2.3.2.3 黏液層染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了確認(rèn)HT29細(xì)胞在共培養(yǎng)細(xì)胞模型黏液層中的形成，使用阿利新藍(lán)對不同生長階段的單層細(xì)胞表面進(jìn)行染色。如圖9所示，Caco2細(xì)胞中只能檢測到極為少量的黏蛋白。而對于HT29細(xì)胞，無論是單獨(dú)培養(yǎng)還是和Caco2細(xì)胞共培養(yǎng)，都可以分泌大量的黏蛋白。在HT29細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時，培養(yǎng)14 d時黏液的分布就已經(jīng)很均勻，而共培養(yǎng)模型則在21 d時黏液量最多，形成了含有黏液層的小腸上皮細(xì)胞跨膜模型。

圖9 孵育21 d內(nèi)Caco2、HT29以及Caco2-HT29共培養(yǎng)細(xì)胞的黏液分泌情況Fig. 9 Mucus secretion of Caco2, HT29 and Caco2-HT29 co-culture during 21 days of incubation

2.3.2.4 BC-SPIs細(xì)胞毒性考察

如圖10所示，其結(jié)果與Caco2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，以細(xì)胞存活率不低于75%作為標(biāo)準(zhǔn)，確定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀釋倍數(shù)為5，消化后產(chǎn)物安全的最低稀釋倍數(shù)為10。最終確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)時Caco2-HT29共培養(yǎng)模型中的BC添加量統(tǒng)一為4.4 μg/mL。

2.3.3 利用Caco2-HT29共培養(yǎng)細(xì)胞對BC-SPIs的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)效率考察結(jié)果

2.3.3.1 BC-SPIs的細(xì)胞吸收

如表2所示，細(xì)胞內(nèi)BC的代謝產(chǎn)物主要是視黃醇和視黃醇棕櫚酸酯，而維生素A酸和BC只占很少一部分。消化后BC-SPIs在Caco2-HT29共培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的BC及其代謝產(chǎn)物積累量顯著高于消化前顆粒。2.2.2節(jié)中已證實(shí)BC-SPIs在消化后表面上吸附了大量的膽鹽分子。有研究表明膽鹽修飾可以通過降低腸道黏液層的黏度和彈性促進(jìn)顆粒的黏液層滲透性[26]；同時有研究表明，還可通過增強(qiáng)生物膜流動性和通透性、降低細(xì)胞間緊密連接程度、抑制其外排作用等特性促進(jìn)攜帶營養(yǎng)素的納米顆粒在小腸上皮細(xì)胞膜的吸收[27]。

表2 消化前后BC-SPIs中BC及其代謝產(chǎn)物在Caco2-HT29共培養(yǎng)細(xì)胞中的積累量Table 2 Cellular accumulation in Caco2-HT29 co-culture of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.3.2 BC-SPIs的轉(zhuǎn)運(yùn)

表3所示的是消化前后的BC-SPIs在Caco2-HT29共培養(yǎng)模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，整體來看，經(jīng)過細(xì)胞代謝進(jìn)入體循環(huán)的BC及其代謝產(chǎn)物的分布規(guī)律與細(xì)胞中積累的規(guī)律基本一致，代謝產(chǎn)物仍主要為視黃醇和視黃醇棕櫚酸酯。對比未被消化的BC-SPIs，消化后在細(xì)胞中以及BL端檢測到的BC及其代謝產(chǎn)物更多（表2、3）。上述研究結(jié)果表明BC-SPIs在消化過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化改善了轉(zhuǎn)運(yùn)吸收效率，一方面可能是因?yàn)槟扄}在顆粒表面的吸附突破了黏液層屏障，增加了顆粒的黏液層滲透性；另一方面也可能是因顆粒結(jié)構(gòu)改變引起轉(zhuǎn)運(yùn)模式的變化，從而提高了其轉(zhuǎn)運(yùn)效率。為了驗(yàn)證上述假設(shè)，通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步考察。

表3 BC-SPIs中BC及其代謝產(chǎn)物在Caco2-HT29共培養(yǎng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)量Table 3 Cellular transport in Caco2-HT29 co-culture of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.4 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性及轉(zhuǎn)運(yùn)模式的考察結(jié)果

2.3.4.1 消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性

為進(jìn)一步探究消化改善BC-SPIs轉(zhuǎn)運(yùn)吸收特性的機(jī)制，分別對消化前后BC-SPIs的黏液層滲透性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)模式進(jìn)行考察。盡管BC-SPIs在消化后具有更大的粒徑和更多的負(fù)電荷，但能夠穿透細(xì)胞模型黏液層的整體VA當(dāng)量較消化前有所增加（表4）。負(fù)電荷數(shù)量的增加和尺寸的增大會阻礙顆粒在黏液層中的遷移，而膽鹽吸附則能增強(qiáng)顆粒在黏液層的滲透性，綜合來看，表面膽鹽的修飾作用要大于表面電荷和粒徑變化帶來的影響。結(jié)合表3和表4中所述BC及其代謝產(chǎn)物的胞內(nèi)積累量和轉(zhuǎn)運(yùn)量，發(fā)現(xiàn)消化后的BC-SPIs跨越黏液層屏障的能力提高了0.48 倍。

表4 消化前后BC-SPIs的HT29黏液層滲透性Table 4 Permeability through HT29 mucus layer of BC-SPIs before and after digestion

2.3.4.2 消化前后BC-SPIs在Caco2細(xì)胞中的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)效率

從表5可看出，消化后的BC-SPIs除了黏液層滲透性得到了提高，其跨膜吸收量也有所提升。與Caco2/HT29共培養(yǎng)模型對比來看，Caco2細(xì)胞中所積累的BC及其代謝產(chǎn)物含量更高，這可能是由于共培養(yǎng)模型中的黏液層會阻礙了BC-SPIs與Caco2細(xì)胞的接觸，導(dǎo)致BC-SPIs穿透黏膜層進(jìn)入到小腸上皮細(xì)胞中效率變慢，積累量降低。

表5 消化前后BC-SPIs中BC及其代謝產(chǎn)物在Caco2細(xì)胞中的積累量Table 5 Cellular accumulation in Caco2 cells of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

如表6所示，與胞內(nèi)吸收的結(jié)果類似，相比Caco2/HT29共培養(yǎng)模型，Caco2模型中所轉(zhuǎn)運(yùn)的BC及其代謝產(chǎn)物含量更多，代謝規(guī)律趨勢與共培養(yǎng)模型類似。結(jié)合表5和表6中所述胞內(nèi)積累和轉(zhuǎn)運(yùn)BC含量，發(fā)現(xiàn)消化后的BC-SPIs跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量提高了0.56 倍。

表6 消化前后BC-SPIs中BC及其代謝產(chǎn)物在Caco2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)量Table 6 Cellular transport in Caco2 cells of BC from BC-SPIs and its metabolites before and after digestion

2.3.4.3 消化前后BC-SPIs的單層細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)模式

目前的觀點(diǎn)認(rèn)為大部分BC-SPIs是通過內(nèi)吞作用進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。內(nèi)吞作用途徑包括網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用、小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用、非網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用、巨胞飲作用、小窩/脂閥依賴的內(nèi)吞作用，分別可以通過使用內(nèi)吞作用抑制劑（氯丙嗪、吲哚美辛、槲皮素、β-環(huán)糊精和阿米洛利排除特定的內(nèi)吞作用，闡釋轉(zhuǎn)運(yùn)BC-SPIs的內(nèi)吞作用機(jī)制[5]。

如圖11所示，當(dāng)用不同的抑制劑處理細(xì)胞時，細(xì)胞對BC-SPIs的相對吸收率有不同程度的降低。與37 ℃正常溫度的轉(zhuǎn)運(yùn)相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)在4 ℃時受到明顯的抑制。說明BC-SPIs的轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要是需要能量的主動內(nèi)吞作用。使用氯丙嗪和吲哚美辛處理細(xì)胞時，BC-SPIs的相對吸收率減少50%左右，說明網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用和小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用對BC-SPIs的轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用。

而當(dāng)BC-SPIs經(jīng)過消化后轉(zhuǎn)運(yùn)時，不僅是吲哚美辛和氯丙嗪能夠抑制其內(nèi)吞作用，阿米洛利也顯著影響了顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)，說明消化后顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)模式主要為網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用、小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用。

為了進(jìn)一步明確消化后顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)模式發(fā)生變化的原因，對可能的消化條件影響因素進(jìn)行了驗(yàn)證。如圖12所示，在4 種消化模式中，僅添加膽鹽促進(jìn)了小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用，并不會引發(fā)巨胞飲；而僅添加胰蛋白酶則會促進(jìn)巨飽飲作用。產(chǎn)生這種差異的原因，可能在于在不同消化條件影響下，BC-SPIs結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不同程度的變化。據(jù)報(bào)道，當(dāng)BC-SPIs的尺寸為120～150 nm時，顆粒主要通過網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，在200 nm以下的粒子主要是以小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。而巨胞飲則可以將亞微米和更大尺寸的大顆粒內(nèi)化在細(xì)胞中[29]。帶負(fù)電荷的BC-SPIs更有可能利用小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用[29]。在消化前，由于BC-SPIs的粒徑（＜200 nm）以及顆粒帶負(fù)電的原因，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)納米顆粒的主要方式是網(wǎng)格蛋白以及小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用。經(jīng)過消化后，由于胰蛋白酶的作用，顆粒在消化過程中發(fā)生絮凝，導(dǎo)致顆粒的粒徑增加，從而促進(jìn)巨飽飲作用的產(chǎn)生，而膽鹽與顆粒的相互結(jié)合導(dǎo)致顆粒帶有更多的負(fù)電，影響了小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用。而在消化前后溶液中都存在200 nm以下的顆粒，因此對網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用影響不大。

圖12 消化條件因素對 BC-SPIs網(wǎng)格蛋白依賴內(nèi)吞作用（A）、小窩蛋白依賴內(nèi)吞作用（B）和巨胞飲（C）的影響Fig. 12 Effects of digestion conditions on clathrin-mediated endocytosis (A),caveolin-mediated endocytosis (B), and macropinocytosis (C) of BC-SPIs

3 結(jié) 論

BC-SPIs經(jīng)消化后界面蛋白水解、顆粒尺寸增加，且一定量的膽鹽分子吸附于表面。消化后的顆粒在小腸上皮細(xì)胞膜的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量較初始顆粒有所增加，一方面是因?yàn)楸砻嫖降哪扄}促進(jìn)了消化后的顆粒在黏液層的滲透，提高了小腸上皮細(xì)胞膜的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量；另一方面則是因?yàn)轭w粒結(jié)構(gòu)變化帶來的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的增加，在小窩蛋白和網(wǎng)格蛋白依賴的內(nèi)吞作用基礎(chǔ)上，增加了巨胞飲轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，減少了黏液層和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)雙重吸收屏障的限制，促進(jìn)了細(xì)胞對BC的吸收和利用。