宮長斌，陳可泉，賈紅華

(南京工業(yè)大學生物化學工程實驗教學示范中心，江蘇 南京 210018)

1 簡 介

蛋白質(zhì)化學是生物化學教學中最重要的內(nèi)容之一，蛋白質(zhì)不僅參與了細胞中的許多生理過程，是探索生命機理的關(guān)鍵，也是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，廣泛應用于工業(yè)、醫(yī)學、營養(yǎng)學等行業(yè)[1]。對蛋白質(zhì)在生物中的含量進行分析，可以進一步了解蛋白在生物體中的占比組成，幫助對蛋白質(zhì)的表達、結(jié)構(gòu)和功能進行分析，也可以幫助對工業(yè)用品、食品、飼料等物質(zhì)的營養(yǎng)價值進行鑒定[2]。因此蛋白質(zhì)的定性與定量檢測，是生物技術(shù)、醫(yī)學、食品、營養(yǎng)學等行業(yè)畢業(yè)生必須要掌握的知識點，也是生物化學實驗教學中必備的實驗項目，在實驗教學中具有非常重要的地位，也是相關(guān)專業(yè)在生物化學課程中深入理解和研究蛋白質(zhì)的重要基礎(chǔ)。目前蛋白質(zhì)的定量分析檢測方法很多，其中很多種已應用于生物化學實驗教學。表1列出了目前在教學中使用較多的幾種蛋白質(zhì)分析實驗及其適用專業(yè)類型。

表1 蛋白質(zhì)分析實驗項目對課程體系的支撐情況和適用專業(yè)

2 不同蛋白質(zhì)分析方法原理與特點

2.1 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

該方法是利用帶電荷的膠體粒子在電場中移動的現(xiàn)象，用醋酸纖維薄膜作為支持物分離鑒定血清中多種蛋白質(zhì)的實驗方法。醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，具有強滲透性，對分子移動無阻力等優(yōu)點。用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法具有樣品用量少、快速、方便、應用范圍廣、分離清晰等優(yōu)點，實驗使用設(shè)備為低壓電泳儀和水平電泳槽。該實驗方法具備實驗操作簡單，藥品與設(shè)備成本低、微量快速等優(yōu)點，目前已廣泛應用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白和同功酶的分離以及免疫電泳。成為生物化學實驗課常用的實驗項目之一[3-4]。

2.2 微量凱氏定氮法

該方法作為最經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量測定方法，目前廣泛應用于食品、飼料加工、實驗研究等領(lǐng)域，在生物化學實驗教學中也是一種常用的實驗教學項目。微量凱氏定氮法是利用蛋白質(zhì)含氮量來測定蛋白質(zhì)含量的一種方法，被測的天然含氮化合物與98%濃硫酸在高溫(480 ℃以上)共熱時分解出氨，氨與硫酸反應生成硫酸銨，該過程稱之為消化或消解。將消化后的溶液轉(zhuǎn)移至凱氏定氮儀中，然后加入強堿，使硫酸銨中的銨根離子釋放生成氨水。加熱至沸騰，用水蒸汽將氨蒸餾入2%硼酸等弱酸溶液中，然后再用標準稀鹽酸溶液進行滴定，根據(jù)所測得的氨量即可計算樣品的含氮量。凱氏定氮法優(yōu)點是準確性高，但耗時長，需要對樣品的高溫消煮至少需要3 h，用到濃硫酸、鹽酸等管控試劑，并且對測定樣品蛋白質(zhì)純度以及是否含尿素、三聚氰胺等含有氮元素的雜質(zhì)，有較高要求。針對以上問題雷紅等[5]提出了將實驗用蛋白質(zhì)樣品加入濃硫酸和硫酸銅催化劑后放置過夜再消化，減少消化時間的方法。張澤泉等[6]探討了利用乙酸鋅做沉淀劑，分離蛋白質(zhì)與非蛋白氮，再用凱氏定氮法測定蛋白含量的方法。該方法是目前較為經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量測定的實驗方法。

2.3 紫外分光光度法

該方法是利用蛋白質(zhì)分子中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)含有共軛雙鍵的特征，使得蛋白質(zhì)在280 nm紫外波長處具有吸收紫外線的性質(zhì)。在這個波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)的濃度呈正比關(guān)系。因此可以利用已知含量的蛋白質(zhì)樣品繪制標準曲線，標定未知蛋白質(zhì)的含量。該方法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定，但酸類物質(zhì)和醇類物質(zhì)均會影響紫外分光光度計法對小分子蛋白的測定[7]。在在蛋白質(zhì)的柱層析分離或者各種生物來源的酶的制備中得到廣泛應用。此方法在使用過程中，對蛋白質(zhì)的種類和干擾物質(zhì)有一定的要求，一是對于不適合測定與標準蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)；二是若樣品中含有有共軛雙鍵的物質(zhì)，如各種核甘酸、富馬酸等吸收紫外線的物質(zhì)，則會出現(xiàn)較大的誤差。該方法不需要額外消耗藥品，使用儀器為分光光度計，其他器皿均為試管、移液器等簡單裝備，成本低廉且操作方便，該方法較為適用于一些成份比較單純的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

2.4 考馬斯亮蘭法

該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸與染料考馬斯亮藍相結(jié)合發(fā)生藍色反應的原理設(shè)計的?？捡R斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應迅速而穩(wěn)定，化合物在595 nm處吸光值與蛋白濃度成正比，可用于計算蛋白的含量。該方法最低蛋白質(zhì)檢測量可達1 mg，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數(shù)，反應靈敏，實驗成本不高，是目前生物化學實驗教學中最常見的一種測定蛋白質(zhì)含量的方法。該方法盡管相對與其它方法來說干擾物質(zhì)較少，但由于每一種蛋白精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，導致蛋白質(zhì)與該染料的結(jié)合能力不同，所以標準品的選擇非常重要，在制作標準曲線時通常選用g-球蛋白或牛血清清蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差?？捡R斯亮蘭法的突出優(yōu)點是：靈敏度高、干擾物質(zhì)少、測定快速、簡便，尤其適用于生物來源的蛋白質(zhì)的檢測。

2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺催化劑過硫酸銨或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳。用該種凝膠電泳可利用生物大分子攜帶電荷的多少、分子量的大小進行分離。通過在電泳體系中加入陰離子表面活性劑的十二烷基磺酸鈉(簡稱SDS)，破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水鍵，使蛋白質(zhì)變性，再加入強還原劑巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，解聚后的蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的復合物，消除蛋白質(zhì)所帶電荷的差異，使遷移率完全取決于蛋白質(zhì)的分子量，因此可用此法測得的蛋白質(zhì)的分子量，與用其它方法測得的分子量相比，誤差一般在±10%以內(nèi)，準確度高、重復性好。此方法雖然適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)分子量的測定，但對于一些蛋白質(zhì)，如帶有較大輔基的蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白和一些含二硫鍵較多的蛋白質(zhì)等是不適用的。該方法蛋白樣品用量較少，但所用的儀器裝置、藥品價格較高，屬于實驗成本較高的實驗。

2.6 蛋白質(zhì)的呈色反應

蛋白質(zhì)中的某些共價鍵或氨基酸殘基中的某些化學基團可以與某些特殊試劑形成特定的有色物質(zhì)，稱之為呈色反應。該類反應由于各種蛋白質(zhì)的氨基酸殘基有所差異，所以不同類的蛋白質(zhì)反應后呈現(xiàn)的顏色也不完全一樣。而且，由于呈色反應是蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團或者蛋白質(zhì)中的共價鍵導致的顏色，一些擁有類似基團或共價鍵的非蛋白物質(zhì)往往也能呈現(xiàn)類似的顯色反應。因蛋白質(zhì)為高分子物質(zhì)，鏈長和所含氨基酸殘基中的側(cè)鏈基團數(shù)目有較大差異，顯色反應很難對蛋白質(zhì)進行定量測定，因此，這一類方法具有較大的局限性。常用的蛋白質(zhì)呈色反應有雙縮脲反應、茚三酮反應和黃色反應。雙縮脲反應利用的是蛋白質(zhì)類物質(zhì)中氨基酸殘基鏈接時的肽鍵加熱至180 ℃可以縮合成一分子雙縮脲并釋放一份子氨的反應，再利用雙縮脲在堿性溶液中與金屬銅離子結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物用于檢測。茚三酮反應利用的是氨基酸的氨基與茚三酮共熱可產(chǎn)生紫色或黃色有色縮合物，因此可以用茚三酮定性檢測或定量檢測蛋白質(zhì)。黃色反應則利用在蛋白質(zhì)分子中具有芳香環(huán)的酪氨酸和色氨酸殘基上的芳香環(huán)硝酸氧化，可轉(zhuǎn)變?yōu)殚冱S色的硝醌衍生物。多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應。

3 結(jié) 語

在科研實驗和工業(yè)生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)分析方法還有很多，例如同位素示蹤質(zhì)譜法、免疫電泳、等電聚焦等方法均已在科學研究中有所應用，但目前這些蛋白質(zhì)的分析方法在儀器、藥品等方面均成本較高、難以應用于實驗教學。目前這些應用于本科生實驗教學的蛋白質(zhì)分析方法，特點與應用方向各有側(cè)重，可根據(jù)教學要求予以選擇。表2和表3匯總了這幾種蛋白質(zhì)分析方法的優(yōu)缺點與對不同專業(yè)實驗課程體系的支撐度。

表2 不同蛋白質(zhì)分析實驗項目的特點

表3 不同蛋白質(zhì)分析實驗項目對實踐能力支撐度

隨著國家對新工科建設(shè)的要求，培養(yǎng)適應國民經(jīng)濟建設(shè)需要，具有解決復雜工程問題能力的新工科人才對實驗教學提出了新的要求[8]。在教學中合理運用各種不同的實驗方法，培養(yǎng)掌握不同技能的新工科人才，是目前生物化學實驗教學的重要教學改革方向。