三種抗菌藥物微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證研究

蔣天逖，曹聰聰

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410219）

對(duì)于非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料的微生物污染程度的檢查，《中國(guó)藥典》制定了微生物限度檢查法[1]，主要檢查項(xiàng)目有需氧菌總數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌總數(shù)及控制菌（指藥品中特定的菌體）檢查[2]。藥品微生物限度檢查的主要目的是通過微生物數(shù)量的定量檢測(cè)以準(zhǔn)確反映藥品侵蝕程度，繼而確定樣品微生物具體含量[3]。

微生物在日常生活中不可或缺，可參與大自然循環(huán)，分解有機(jī)物，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，其中部分代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致人畜疾病、食物腐敗或霉?fàn)€等，具有分布廣、種類多、繁殖快的特點(diǎn)[4]。在藥品中，可造成藥物污染的微生物種類繁多，如生活中隨處可見的細(xì)菌、酵母菌和霉菌，其中絕大部分是致病菌。由于藥物在生產(chǎn)過程中原料、輔料和生產(chǎn)工藝的差異，不同種類藥物受到微生物污染程度也不盡相同。而藥品在生產(chǎn)過程中受污染的微生物越多，其變質(zhì)越快，有效期越短，甚至將導(dǎo)致服藥者產(chǎn)生發(fā)熱、感染、中毒、過敏等不良反應(yīng)，從而造成各種臨床疾病的可能性就越多[5-6]。

研究表明，導(dǎo)致藥物活性降低的原因一般有兩種：（1）部分微生物存在于藥品中，繼而導(dǎo)致部分藥品效果缺失或完全喪失；（2）樣品存儲(chǔ)年限較久而導(dǎo)致其部分失效[7-8]。因此，藥品生產(chǎn)、流通、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)均需嚴(yán)格遵循相應(yīng)的質(zhì)量把控、管理規(guī)范，從而最大限度降低藥品受到微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)及污染程度。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，驗(yàn)證不同抗菌藥物的微生物限度檢查方法有效性，改善相關(guān)檢測(cè)技術(shù)也非常必要。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BSC-1500IIA2 生物安全柜，上海中庸檢驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HTY 無菌隔離器，浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司；HR 封閉式/開放式兩用無菌檢查薄膜過濾器，北京恒瑞天創(chuàng)機(jī)電設(shè)備有限公司；標(biāo)準(zhǔn)型PH 計(jì)PB-10/C，上海精密科學(xué)儀器有限公司；移液槍，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FC104 電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；智能高壓蒸汽滅菌器，艾德生儀器有限公司；25℃SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱、35℃SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；勻漿儀，杭州高得醫(yī)療器械有限公司。

大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]，0.5 ～1.0×103cfu/顆，中國(guó)食品藥品檢定研究院。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、BL增菌培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基，中國(guó)藥品生物制品檢定所；培養(yǎng)基所用蛋白胨、氯化鈉等其他試劑均由廣東翁江化學(xué)試劑有限公司提供。鹽酸莫西沙星（批號(hào)：180304）、諾氟沙星（批號(hào)：180210）、阿奇霉素（批號(hào)：180401），湖南迪諾制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沖洗劑制備

配置0.9%氯化鈉溶液和0.1%蛋白胨氯化鈉緩沖液，高壓滅菌后備用。

1.2.2 菌液制備

取兩種新鮮培養(yǎng)物（金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌）同時(shí)分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，而后取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種到沙氏液體培養(yǎng)基，按《中國(guó)藥典》描述的具體方法，將其制備成50 ～100 個(gè)/mL水平，分為一式三份待用。

1.2.3 供試液制備

取10 g 藥物樣品到100 mL 無菌氯化鈉溶液（濃度0.9%），制成供試液（1 ∶10），若存在不溶性顆粒，則可500 r/min 離心處理5 min，而后取上層液體，確保供試液均勻。

1.2.4 試驗(yàn)方法

1.2.4.1 平皿菌落計(jì)數(shù)法（平皿法）

采用常規(guī)平皿傾注法進(jìn)行試驗(yàn)。分別取1 ∶10的供試品溶液9.9 mL，加入試驗(yàn)菌液各0.1 mL，充分混勻后吸取混合溶液1 mL 至無菌平皿中，傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，先后經(jīng)過混勻、凝固等操作步驟，平行制備2 組。將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌在30～35 ℃培養(yǎng)3 d，白色念珠菌在30～35 ℃培養(yǎng)5 d。計(jì)數(shù)，計(jì)算各組的平均菌落數(shù)。

1.2.4.2 洗脫法

取供試液使用直徑為50 mm、孔徑0.45 μm 的濾膜進(jìn)行減壓抽濾，而后取出濾膜使用100 mL滅菌生理鹽水緩慢流動(dòng)沖洗，總用量不超過1 000 mL。取1 mL沖洗液放入雙碟中，先后加入等量的營(yíng)養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，并先后在35 ℃培養(yǎng)48 h、27 ℃培養(yǎng)72 h 后取出計(jì)算菌數(shù)。

1.2.4.3 薄膜過濾法（薄膜法）

分別取1 ∶10 的供試品溶液1.0 mL 至薄膜過濾器中，用0.7%氯化鈉蛋白胨溶液沖洗3 次，每次用量100 mL，在最后一次沖洗前加入0.1 mL 菌液進(jìn)行過濾，轉(zhuǎn)移濾膜，將細(xì)菌表面貼于胰蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基上，按規(guī)定培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.2.4.4 回收率測(cè)定

分別取前述步驟中制備的菌液，將其稀釋至指定濃度（30 ～100 cfu/mL），而后將其加入至供試液中，并取1 mL 溶液進(jìn)行培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，計(jì)算回收率。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)過程中的數(shù)據(jù)收集整理采用Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢出情況

使用三種藥物重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，平皿菌落計(jì)數(shù)法細(xì)菌數(shù)、洗脫法細(xì)菌數(shù)、薄膜過濾法細(xì)菌數(shù)具體見表1?？梢钥吹?，3 種藥物供試樣品中薄膜過濾法檢出細(xì)菌數(shù)均最多。

表1 三種方法樣品檢出細(xì)菌數(shù)（單位：個(gè)/g）

2.2 回收率

如表2 所示，3 種藥物使用薄膜過濾法檢測(cè)細(xì)菌回收率均最高，鹽酸莫西沙星中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和白色念珠菌的回收率分別為78.00%、81.25%、75.38%，諾氟沙星中的回收率分別為70.00%、72.50%、84.62%，阿奇霉素中的回收率分別為72.00%、75.00%、80.00%。

表2 三種驗(yàn)證方法對(duì)菌種的回收率

2.3 討論

需氧菌總數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌總數(shù)及控制菌（指藥品中特定的菌體）等是非規(guī)定的滅菌制劑（及其原料）、輔料等藥品組分中微生物存在情況及具體污染程度的主要檢查項(xiàng)目。本試驗(yàn)研究中采取薄膜過濾法檢查鹽酸莫西沙星、阿奇霉素和諾氟沙星的需氧菌總數(shù)、控制菌（大腸埃希菌）總數(shù)和鹽酸莫西沙星的霉菌數(shù)，所得結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。三種抗菌藥物微生物限度檢查結(jié)果比較，莫西沙星的抑菌活性強(qiáng)于其余兩者，通過不同稀釋級(jí)供試液和不同檢查方法得出薄膜過濾法適用于鹽酸莫西沙星、阿奇霉素和諾氟沙星的微生物限度檢查[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)薄膜法樣品中菌數(shù)測(cè)定結(jié)果和回收率顯著高于平皿法和洗脫法，可能與以下原因有關(guān)。（1）平皿菌落計(jì)數(shù)法是將供試液按照設(shè)定程度予以稀釋后直接接種于平皿并進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定的方法，雖然稀釋劑和培養(yǎng)基會(huì)對(duì)抗菌藥物中的抑菌成分進(jìn)行稀釋，其抑菌能力有所降低，但是不至于完全消失，因此會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)過程，同時(shí)降低其檢出率和回收率。（2）洗脫法的操作過程中細(xì)菌會(huì)吸附在濾膜表面或鑲嵌在纖維膜的間隙中，很難通過沖洗洗脫下來，因此會(huì)出現(xiàn)檢出率和回收率低。（3）薄膜法在具體操作過程中則會(huì)使用稀釋液對(duì)濾膜進(jìn)行反復(fù)沖洗，該處理方式會(huì)極大降低抑菌成分濃度，甚至在微生物限度檢查層面會(huì)降低原有成分的抑菌效果。需要注意的是，在具體操作過程中，薄膜過濾法必須首先將供試液加入濾罐中，先混勻沖洗液再進(jìn)行減壓抽濾，否則抑菌成分不能徹底去除，將直接影響測(cè)定結(jié)果[10]。

3 結(jié)論

薄膜法在過濾樣品過程中，將微生物留在濾膜表面，藥品中的抑菌成分則在無菌沖洗液的反復(fù)沖洗下有效去除，培養(yǎng)過程中其營(yíng)養(yǎng)成分和代謝物也可以通過濾膜上的微孔不斷進(jìn)行交換。總的來說，薄膜法不僅能增大取樣量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具代表性，還可以有效減少外部環(huán)境或操作因素的干擾，操作過程更為方便實(shí)用，簡(jiǎn)化了微生物的檢測(cè)程序，可在相關(guān)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。