高曉晨，申嘉明，王躍龍，程端端，吳佩潼，王碩，張輝，孫佳明

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117）

糖尿?。―iabetes）是一種以慢性高血糖癥狀為主要特點(diǎn)的終身性代謝疾病[1]，臨床常用胰島素類、促胰島素分泌類、-葡萄糖苷酶抑制劑和胰島素增敏劑等藥物進(jìn)行治療[2]；阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease,AD）是一種慢性、快速進(jìn)展的神經(jīng)退行性疾病[3]，目前臨床常采用M 型膽堿能受體激動(dòng)劑、膽堿酯酶抑制劑、抗氧化和抑制淀粉樣蛋白沉積藥等藥物來(lái)治療阿爾茲海默病[4]。以上治療藥物常存在有引起不良反應(yīng)和治療效果不理想等問(wèn)題[5]。中藥治療慢性疾病具有效果好、副作用小的優(yōu)點(diǎn)，而中藥的小分子肽因其來(lái)源廣泛、安全高效而倍受關(guān)注，因此從中藥中篩選出天然的生物活性肽，在抗阿爾茨海默病和糖尿病方面將會(huì)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

黑參（Black ginseng）為五加科人參屬植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根及根莖，經(jīng)九蒸九曬炮制或結(jié)合微生物發(fā)酵而成[6]，多含Rh2、Rh3、Rg3和Rk1 等稀有皂苷成分[7]，具有抗腫瘤、抗炎、降壓保肝、抗糖尿病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等藥理作用[8]。Lee等[9]在研究高麗白、紅和黑參提取物對(duì)膽堿酯酶（ACE）抑制活性和膽堿能功能的比較中發(fā)現(xiàn)，黑參可以調(diào)節(jié)乙酰膽堿（ACh）的代謝，對(duì)膽堿酯酶的抑制作用最強(qiáng)。Seo 等[10]通過(guò)給糖尿病小鼠灌服黑參提取物，發(fā)現(xiàn)黑參提取物可通過(guò)增加葡萄糖的攝取而降低血糖，從而治療糖尿病。目前，對(duì)黑參有效成分的研究多集中于稀有皂苷方面，而對(duì)黑參肽的藥理活性報(bào)道較少。

為了在黑參中篩選活性寡肽類成分，本研究通過(guò)超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜和分子對(duì)接技術(shù)分析黑參精制組分中抑制乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的活性寡肽類成分，并預(yù)測(cè)它們與乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的對(duì)接結(jié)合能和對(duì)接模式。與傳統(tǒng)篩選研究方法相比，液質(zhì)聯(lián)用與分子對(duì)接技術(shù)相結(jié)合不僅可以提高篩選的效率，而且可為黑參寡肽類成分的作用機(jī)制的推測(cè)和闡述提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

黑參藥材由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院自制。UltiMate 3000 series 高效液相色譜儀、超高效液相色譜線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher 公司；BP211D 型十萬(wàn)分之一電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；KQ3200BE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LDZX-30KBS立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

甲醇（分析純，20220309），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲酸（色譜純），賽默飛世爾科技（中國(guó)）；Flash SphericalC8填料，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 樣品制備

將干燥的5 年生的人參置于高壓滅菌鍋中在120℃的溫度條件下蒸制2 h后，放入鼓風(fēng)干燥箱50 ℃干燥8 h，繼續(xù)重復(fù)操作循環(huán)蒸制干燥8 次，得到黑參，置于陰涼干燥處貯藏。

取10 g 黑參飲片，用50%乙醇（質(zhì)量比1:10）超聲提取，每次60 min，共2 次，將合并的提取液加壓回收乙醇至無(wú)醇味，加適量超純水定容到100 mL。

甲醇1 mL 活化C8 固相萃?。⊿PE）小柱，用水1 mL 平衡。將上述水溶液樣品1 mL 上柱，收集漏出液，用水1 mL 洗脫雜質(zhì)，用30%甲醇1 mL 洗脫，收集洗脫液，作為黑參精制組分樣品溶液，經(jīng)0.45m微孔濾膜過(guò)濾，供超高效液相色譜線性離子阱靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀分析。

1.3 黑參精制組分的液質(zhì)分析

色譜條件：采用UnitaryC18 色譜柱（4.6mm 150mm，2.8m 100）；流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%的甲酸水溶液（B），通過(guò)二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相梯度：0～30 min（10%～100%A），流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量10L；柱溫30 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源（ESI），樣品采用正離子模式掃描。噴霧電壓2.5 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，透鏡電壓50 eV，鞘氣壓力2.76×105Pa，輔助氣壓力6.89×104Pa，輔助氣溫度300 ℃，分辨率70 000，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 500。

1.4 分子對(duì)接

使用ChemDraw 20.0 繪制黑參中寡肽類成分的sdf 2D 結(jié)構(gòu)的分子式，通過(guò)Chem 3D 軟件能量最小化，轉(zhuǎn)換為柔性結(jié)構(gòu)的pdb格式，使用OpenBabel 2.4.1確認(rèn)可旋轉(zhuǎn)的鍵并保存為pdbqt 格式，以備后續(xù)對(duì)接使用。

通過(guò)RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）下載乙酰膽堿酯酶的晶體結(jié)構(gòu)（4EY6）和-葡萄糖苷酶（2QMJ）的pdb 格式文件，經(jīng)PyMOL 對(duì)其進(jìn)行去水、加氫等操作，使用Autodock 保存為pdbqt 格式。通過(guò)查詢文獻(xiàn)[11,12]確定乙酰膽堿酯酶的結(jié)合位點(diǎn)坐標(biāo)（4EY6，2.827，40.098，30.802）及尺寸（26×26×26）和-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點(diǎn)坐標(biāo)（2QMJ，21.56，6.936，1.971）及尺寸（26×26×26），并按照相關(guān)格式保存為txt 格式，寡肽所有可旋轉(zhuǎn)鍵均設(shè)為柔性，乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶設(shè)置為鋼性，搜尋精度exhaustiveness設(shè)為64，格點(diǎn)間距1，其他參數(shù)默認(rèn)，運(yùn)行Autodock Vina，采用拉馬克遺傳算法對(duì)接運(yùn)算100 次。將結(jié)果用LigPlus 和PyMOL 程序?qū)?duì)接構(gòu)象進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑參精制組分的液質(zhì)分析

用甲醇溶液配制濃度為1 mg/mL 的黑參精制組分樣品溶液，過(guò)0.22m 膜，經(jīng)超高效液相色譜線性離子阱靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜分析，得到正離子模式下的總離子流圖，見(jiàn)圖1。結(jié)合各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰的解析、與文獻(xiàn)[13-15]對(duì)比，指認(rèn)了其中5 個(gè)寡肽類成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 為黑參精制組分化合物的正譜總離子流圖，指認(rèn)出5 個(gè)寡肽類化學(xué)成分，分別為谷氨酸天冬酰胺（Glu-Asn），酪氨酸天冬酰胺（Tyr-Asn），亮氨酸甲硫氨酸（Leu-Met），脯氨酸甲硫氨酸（Pro-Met），蘇氨酸苯丙氨酸（Thr-Phe）。

2.2 分子對(duì)接結(jié)果

表2 5 個(gè)寡肽與乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的結(jié)合情況Table 2 Binding of five oligopeptides to acetylcholinesterase and-glucosidase

表2 5 個(gè)寡肽與乙酰膽堿酯酶和-葡萄糖苷酶的結(jié)合情況Table 2 Binding of five oligopeptides to acetylcholinesterase and-glucosidase

一般認(rèn)為配體和受體分子對(duì)接的結(jié)合能小于0，便可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越小發(fā)生相互作用的可能性越大[16]。從表2 可以看出，黑參中的5 個(gè)寡肽化合物與乙酰膽堿酯酶和葡萄糖苷酶的結(jié)合能均小于0，說(shuō)明5 個(gè)寡肽類化合物均可以與兩種酶自發(fā)結(jié)合。同時(shí)5 個(gè)寡肽的結(jié)合能均小于20.9 kJ/mol，表明黑參寡肽可能具有良好的乙酰膽堿酯酶和糖苷酶抑制活性。通過(guò)對(duì)比兩者發(fā)現(xiàn)，5 個(gè)寡肽成分與糖苷酶的結(jié)合能普遍低于乙酰膽堿酯酶，表明黑參可能對(duì)糖苷酶的抑制作用更好。其中酪氨酸天冬酰胺相較于其他寡肽對(duì)兩種酶的分子對(duì)接結(jié)合能更小，提示酪氨酸天冬酰胺可能具有良好的抗阿爾茨海默病和糖尿病活性。

3 結(jié)論