巖黃連總生物堿對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的改善作用研究

覃 妮，黃曙院，周 柳，黃華萍，沈新輝，周 琳，孫東琪，陸世銀*

柳州市中醫(yī)醫(yī)院（柳州市壯醫(yī)醫(yī)院），中藥（壯瑤藥）制劑研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥（壯瑤藥）制劑開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 柳州 545026

肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是諸多慢性肝病病情發(fā)展的共同病理特征，是多種致病因素導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增長(zhǎng)的肝內(nèi)彌散性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過(guò)度淤積的病理過(guò)程，若未采取及時(shí)有效的治療，將會(huì)導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生[1-3]。巖黃連Corydalis saxicola Bunting 為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，被收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，主要生長(zhǎng)在廣西、云南以及貴州的山區(qū)，其性涼、味苦，功效為清熱解毒、消腫、利濕、止痛、止血等[4-5]。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，巖黃連具有抗炎鎮(zhèn)痛[6-8]、抗氧化[9-10]、保肝[11-13]等作用。 雖然，目前研究表明巖黃連總生物堿（total alkaloids from Corydalis saxicola Bunting,TACS）可以保肝護(hù)肝、改善肝臟功能，然而，有關(guān)其抗HF 的作用與機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。 為此，基于前期研究，本研究以聯(lián)苯雙酯為陽(yáng)性對(duì)照藥物，采用四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）誘導(dǎo)建立大鼠HF 模型，進(jìn)一步探討TACS 在大鼠模型中的抗HF 作用及其可能機(jī)制，為巖黃連抗HF 藥物的研究與開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量100～140 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。 動(dòng)物飼養(yǎng)于通風(fēng)條件良好，12 h 光照晝夜循環(huán)，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～60%的環(huán)境中。 動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK 湘2019-0004，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK 桂2019-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批號(hào)：GXMU2010032418。自由攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料與蒸餾水。

1.2 藥物與試劑

巖黃連藥材（廣西仙茱中藥科技有限公司，批號(hào)20190701），經(jīng)柳州市中醫(yī)醫(yī)院中藥師張洪平主任鑒定為罌粟科紫堇屬植物巖黃連Corydalis saxicola Bunting全草。 聯(lián)苯雙酯（北京協(xié)和藥廠，批號(hào)：200606）；橄欖油（山東魯花集團(tuán)商貿(mào)有限公司，批號(hào)：20190711）；CCl4（天津博迪生化股份有限公司，批號(hào)：20210422）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、總蛋白（total protein, TP）、白蛋白（albumin, ALB）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（super oxide dismutase, SOD）與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20210419、20210420、20210417、20210418、20210420、20210420、20210418）；4%多聚甲醛（廣州賽國(guó)生物科技有限公司，批號(hào)21235935）；HE 染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20210419)；Masson 染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20210707）；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA）、層黏連蛋白（laminin, LN）、Ⅲ型前膠原（typeⅢprocollagen, PCⅢ）及Ⅳ型膠原（collagen Ⅳ, Ⅳ-C）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)均為20220310）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（tran-s forming growth factor-β1, TGF-β1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8, IL-8）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)均為202104）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

Bio-Rad iMark 酶標(biāo)儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號(hào)：Bio-Rad 680）；電熱恒溫水浴鍋（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：SC-20）；高速低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司，型號(hào)：TGD-20MC）；電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：JY2002）；制冰機(jī)（常熟雪科制冷設(shè)備有限公司，型號(hào)：IMS-130）。 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器公司，型號(hào)：RE-52）；熒光成像系統(tǒng)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：Invitrogen EVOS M5000]；臺(tái)式離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：TD5）；超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號(hào)：GWB-1）。

2 方法

2.1 TACS 的制備

將巖黃連藥材置于鼓風(fēng)干燥箱中，50 ℃烘干2 h，粉碎至約1.5 cm，稱取1 000 g，首次加入10 倍量75%乙醇，浸泡30 min，加熱回流提取2 h，趁熱過(guò)濾，重復(fù)提取1 次，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮所得醇提液至1 g/mL（真空度-0.085～-0.095 Mpa，溫度65 ℃），加入4 000 mL 1%鹽酸水溶液回流提取1 h，趁熱過(guò)濾，取濾液加入40%NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至中性，濃縮至相對(duì)密度為1.06～1.08，4 ℃靜置48 h 后過(guò)濾，濾渣用16 倍量的1%鹽酸水溶液回流1 h，趁熱過(guò)濾，濾液加入40% NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至中性，濃縮至相對(duì)密度為1.06～1.08，4 ℃靜置48 h 后過(guò)濾，濾渣冷凍，真空干燥，即得TACS 粉末，提取完成后置于干燥器中備用。

2.2 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、TACS 低/中/高劑量（25、50、100 mg/kg）組[14]和聯(lián)苯雙酯（陽(yáng)性對(duì)照，30 mg/kg，加適量生理鹽水配制成濃度為30 mg/mL）組，每組8 只。除正常組大鼠腹腔注射橄欖油（0.1 mL/100 g）外，其余各組分別于大鼠腹腔注射30% CCl4橄欖油混合液（0.1 mL/100 g）以制備HF 模型[15]，2 次/周，連續(xù)12 周。 各給藥組在造模第11 周按設(shè)定劑量（1.0 mL/100 g） 給予大鼠灌胃相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水，1 次/d，連續(xù)2 周。 實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食飲水，每天觀察各組大鼠活動(dòng)情況，每周稱定質(zhì)量1次。所有大鼠末次給藥后，禁食同時(shí)自由飲水24 h。大鼠經(jīng)3%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉后， 腹主動(dòng)脈采血，3 500 r/min 離心15 min 取血清，于-80 ℃超低溫冰箱保存待檢。采集血樣后頸椎脫臼處死大鼠，取出肝臟和脾臟，并用預(yù)冷生理鹽水清洗后，濾紙拭干，稱重，計(jì)算肝（脾）臟指數(shù)，肝（脾）臟指數(shù)（%）=肝（脾）臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%[16]。 取適量肝組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，其余肝臟置于-80 ℃超低溫冰箱保存待用。

2.3 各組大鼠肝組織病理學(xué)觀察

取肝臟組織右葉同一位置約1 cm3大小，以4%多聚甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為3 μm），經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精常規(guī)逐級(jí)脫水，蘇木精染液染色，洗掉多余的染液后用0.5%鹽酸酒精分色，分別行伊紅染液染色和Masson 麗春紅復(fù)紅液染色，再次酒精常規(guī)逐級(jí)脫水，二甲苯透明后采用中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.4 各組大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

取分離好的大鼠血清，采用比色法檢測(cè)血清中ALT、AST、TP、ALB、MDA、SOD 的含量；采用ELISA 檢測(cè)血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1、IL-1β、IL-8及IL-6 的水平。上述指標(biāo)均嚴(yán)格遵照檢測(cè)試劑盒指南步驟操作，并于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料通過(guò)“±s”表示。所有資料均作正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布，多組間比較當(dāng)滿足方差齊性時(shí)采用單因素方差分析檢驗(yàn)，各組間均數(shù)多重比較采用Tukey 檢驗(yàn)；當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Welch和Dunnett's T3 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的作用

正常組大鼠毛色、精神狀態(tài)、攝食、排便及體質(zhì)量增長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)期間均正常。 與正常組相比，模型組大鼠毛發(fā)有輕微脫落且明顯變黃，精神衰弱，食欲不振，便稀，體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著緩慢。 而TACS 低、中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組大鼠毛色、精神狀態(tài)、攝食和體質(zhì)量增長(zhǎng)等較模型組明顯改善。 相比于正常組，模型組大鼠實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量較小、肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；增長(zhǎng)幅度與聯(lián)苯雙酯組比較，TACS 高劑量組體質(zhì)量升高（P＜0.05）。 與模型組比較，TACS 中、高劑量組及聯(lián)苯雙酯組大鼠肝臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；且TACS 高劑量組優(yōu)于聯(lián)苯雙酯的作用（P＜0.01）；TACS 低、中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組均能顯著降低HF 大鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05，P<0.01），TACS 高劑量組下調(diào)脾臟指數(shù)效果優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組（P＜0.05）。TACS 對(duì)CCl4誘導(dǎo)HF 大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的作用呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。詳見(jiàn)表1。

表1 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠肝脾指數(shù)的影響（±s，n=8）

表1 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠肝脾指數(shù)的影響（±s，n=8）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)苯雙酯組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組TACS 低劑量組TACS 中劑量組TACS 高劑量組實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量/g 251.67±6.85 252.26±7.32 247.77±6.34 248.94±7.38 252.59±5.32 254.77±8.68實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量/g 378.99±15.95 289.13±11.33##358.38±10.35**354.46±15.28**363.16±13.92**377.18±12.60**△肝臟指數(shù)2.18±0.23 3.16±0.16##2.85±0.29*3.04±0.34 2.73±0.23*2.38±0.19**△△脾臟指數(shù)0.16±0.01 0.26±0.01##0.19±0.02**0.24±0.02*0.19±0.01**0.17±0.01**△

3.2 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠血清生化指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST 水平明顯上升（P＜0.01），TP 與ALB 水平顯著下降（P＜0.01），表明CCl4造成了大鼠肝損傷。相較于模型組，TACS 低、中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組均能明顯下調(diào)大鼠血清中ALT 和AST 含量（P＜0.01），并能顯著提高血清TP、ALB 水平（P＜0.05，P＜0.01）。 此外，相較于聯(lián)苯雙酯組，TACS 中、 高劑量組對(duì)ALT、AST、TP與ALB 調(diào)控改善作用更強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01），且TACS各劑量組間呈良好的量效相關(guān)性。 結(jié)果表明TACS具有良好的保肝及改善肝功能作用。 詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中ALT、AST、TP 和ALB 的水平（±s，n=8，U·L-1）

表2 各組大鼠血清中ALT、AST、TP 和ALB 的水平（±s，n=8，U·L-1）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)苯雙酯組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組TACS 低劑量組TACS 中劑量組TACS 高劑量組ALT 16.91±5.94 113.97±8.27##53.24±3.72**97.64±12.41**△△33.60±7.43**△△10.62±2.59**△△AST 14.58±4.97 53.07±9.58##36.60±9.26**36.16±3.70**23.36±3.32**△△15.86±4.08**△△TP 46.01±1.54 38.46±1.68##44.18±3.10**40.92±1.76*46.97±1.57**50.22±1.78**△△ALB 30.09±0.81 24.49±1.43##26.98±2.43*27.69±2.36*29.82±1.56**△32.34±1.01**△△

3.3 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)的HF 大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 表達(dá)的調(diào)控作用

與正常組比較，模型組血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，經(jīng)TACS干預(yù)后，各組血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 含量呈下降趨勢(shì)或明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），且TACS 改善作用呈現(xiàn)良好的劑量依賴性，同時(shí)TACS 中、高劑量組抑制HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 水平效果優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 的水平（±s，n=8，ng·mL-1）

表3 各組大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 的水平（±s，n=8，ng·mL-1）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)苯雙酯組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組TACS 低劑量組TACS 中劑量組TACS 高劑量組HA 98.21±9.04 215.96±8.07##153.26±7.72**177.64±12.31**△△133.60±8.44**△△112.73±10.59**△△LN 104.68±14.97 253.09±9.78##206.60±9.17**208.16±13.24**173.36±9.42**△△145.83±14.12**△△PCⅢ66.23±6.56 178.65±11.96##144.18±13.15**140.94±15.06**106.84±11.57**△△93.24±14.78**△△Ⅳ-C 202.09±13.84 324.47±12.42##286.98±15.17*307.69±12.76 269.92±16.75**△236.62±18.07**△△

3.4 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠血清SOD、MDA 及GSH-Px 水平的影響

模型組大鼠血清MDA 水平明顯高于正常組（P＜0.01），而SOD 與GSH-Px 水平明顯低于正常組（P＜0.01）。相較于模型組，TACS 中、高劑量組和聯(lián)苯雙酯組MDA 水平明顯降低（P＜0.05，P<0.01），同時(shí)大鼠血清SOD 水平明顯上調(diào)（P＜0.01），TACS 各劑量組大鼠血清中GSH-Px 表達(dá)水平升高（P＜0.01）。 此外，TACS 中、高劑量組對(duì)SOD、MDA 及GSH-Px 調(diào)控效果優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組（P＜0.01）。 結(jié)果顯示TACS可通過(guò)抗氧化活性發(fā)揮保肝、護(hù)肝的作用。 詳見(jiàn)表4。

表4 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠血清SOD、MDA 及GSH-Px 水平的影響（±s，n=8，U·L-1）

表4 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠血清SOD、MDA 及GSH-Px 水平的影響（±s，n=8，U·L-1）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)苯雙酯組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組TACS 低劑量組TACS 中劑量組TACS 高劑量組SOD 216.94±7.37 98.51±6.33##179.89±10.55**124.70±5.64**△△165.34±5.31**△209.89±5.70**△△MDA 5.83±0.85 12.41±0.95##11.41±1.24*11.83±0.80 8.68±0.88**△△6.14±0.69**△△GSH-Px 317.56±4.61 173.24±8.63##268.67±9.68**260.32±6.54**281.34±5.97**△293.52±7.64**△△

3.5 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠血清促炎因子與促纖維因子的調(diào)節(jié)作用

相比于正常組，模型組大鼠血清促纖維因子TGF-β1，促炎因子IL-1β、IL-8 和IL-6 水平顯著提高（P＜0.01）。 與模型組相比較，經(jīng)TACS 低、中、高劑量干預(yù)均能顯著抑制TGF-β1、IL-1β、IL-8 和IL-6的表達(dá)（P＜0.05、0.01）。 此外，與聯(lián)苯雙酯組比較，TACS 中、高劑量組的TGF-β1、IL-1β、IL-8 和IL-6的表達(dá)水平下降更明顯（P＜0.01），且TACS 各組呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果提示TACS 可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫，下調(diào)促炎細(xì)胞因子的水平及抑制促纖維因子表達(dá)從而發(fā)揮抗HF 的作用。 詳見(jiàn)表5。

表5 MCAE 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠血清中TGF-β1、IL-1β、IL-8 及IL-6 的調(diào)控作用（±s，n=8，pg·mL-1）

表5 MCAE 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠血清中TGF-β1、IL-1β、IL-8 及IL-6 的調(diào)控作用（±s，n=8，pg·mL-1）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與聯(lián)苯雙酯組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常組模型組聯(lián)苯雙酯組TACS 低劑量組TACS 中劑量組TACS 高劑量組TGF-β1 131.39±13.75 218.78±19.32##185.40±16.77**179.79±10.35**137.21±7.03**△△119.16±10.05**△△IL-1β 76.56±5.41 109.15±8.51##94.25±8.07**100.35±5.72*73.24±8.96**△△60.78±4.03**△△IL-8 67.34±3.12 89.07±5.75##81.14±8.36*76.11±5.49**65.27±5.01**△△57.61±4.22**△△IL-6 76.40±6.48 105.71±7.46##88.52±7.85**98.07±3.62*△74.20±7.32**△△59.61±7.71**△△

3.6 TACS 對(duì)CCl4 誘導(dǎo)HF 大鼠肝組織病理變化的影響

HE 染色顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)均勻完整，肝細(xì)胞排列清晰整齊且未見(jiàn)小膽管及纖維組織增生。相比于正常組，模型組大鼠肝小葉出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞排列紊亂，局灶肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及充血病變，纖維化明顯。 TACS 低、中、高劑量組及聯(lián)苯雙酯組對(duì)CCl4所致大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)完整性、炎癥壞死及纖維化病變均有所改善，且TACS 干預(yù)作用效果呈劑量依賴性，其中TACS 高劑量組較于聯(lián)苯雙酯組改善效果更為明顯。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 TACS 對(duì)CCl4 致HF 大鼠肝組織病理變化的改善作用（HE，×100，標(biāo)尺=50 μm）

Masson 染色顯示，正常組大鼠肝組織無(wú)被染成藍(lán)色的纖維，未見(jiàn)病理性改變，而模型組明顯可見(jiàn)廣泛致密藍(lán)色膠原沉積，肝臟匯管區(qū)和中央靜脈周圍纖維組織增生明顯，且纖維間隔增厚，部分已出現(xiàn)假小葉及膠原纖維束。 與模型組比較，TACS 各劑量組有不同程度的改善與逆轉(zhuǎn)，膠原纖維增生范圍顯著減少，其中以TACS 高劑量組治療效果最佳。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 TACS 對(duì)CCl4 致HF 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響（Masson，×100，標(biāo)尺=100 μm）

4 討論

HF 是由遺傳、代謝、病毒、損傷等原因引起慢性肝病的關(guān)鍵特征，若未采取有效干預(yù)手段，其進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化甚至肝衰竭、肝癌等致命性肝臟疾病，HF 也是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)，嚴(yán)重影響患者健康及生存質(zhì)量[17]。 HF 的病理學(xué)基礎(chǔ)為ECM 的合成異常增多而降解減少，導(dǎo)致膠原在肝臟中過(guò)度沉積。 目前，普遍認(rèn)為肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell, HSC）是肝臟合成ECM 的主要細(xì)胞[18]。 HSC 的激活和增殖是HF 的最終共同途徑，在HF的病理生理過(guò)程的作用尤為關(guān)鍵，是HF 發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[19-20]。 然而，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未找到良好的治療HF 的方法。 中醫(yī)中藥以其對(duì)HF 的良好預(yù)防和治療效果、低毒性反應(yīng)等特點(diǎn)，目前已引起越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注與重視。 巖黃連為嶺南地區(qū)治療肝病的特色植物藥，有研究發(fā)現(xiàn)巖黃連具有抗氧化、保肝及改善肝功能的作用，然而，有關(guān)其抗HF 的作用與機(jī)制尚未明確。 基于此，本實(shí)驗(yàn)將MCAE 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HF 大鼠進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)及可能作用機(jī)制開(kāi)展初步研究。

CCl4是一種典型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HF 模型誘導(dǎo)劑，CCl4在體內(nèi)以肝臟為靶向，破壞肝細(xì)胞，其引起毒性三氯甲基自由基激發(fā)炎癥反應(yīng)，激活HSC 后生成大量ECM，最終導(dǎo)致嚴(yán)重肝損傷[21]。 ALT、AST 是評(píng)價(jià)肝損傷的標(biāo)志，目前極為廣泛地應(yīng)用于肝損傷判斷[22]。在機(jī)體中，當(dāng)自由基參與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)時(shí)，其最終產(chǎn)物為MDA，而MDA 異常升高可致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭受嚴(yán)重?fù)p壞，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞腫脹與壞死[23]。 一般而言，機(jī)體通過(guò)減少自由基水平并將其清除、重塑損傷及上調(diào)抗氧化酶表達(dá)這一系列抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮自身保護(hù)作用。其中SOD 作為關(guān)鍵的抗氧化酶之一，對(duì)自由基具有良好的清除作用，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)物的生成[24]。 GSH-Px 具有抗氧化活性，在體內(nèi)發(fā)揮維持機(jī)體氧化與抗氧化的穩(wěn)態(tài)，起到抵御自由基的作用，具有保護(hù)肝組織的功能[25]。本研究造模12 周后，病理組織學(xué)顯示，模型組大鼠肝臟出現(xiàn)顯著的損傷與纖維化，血清ALT、AST 含量明顯升高，ALB、TP 水平顯著下降。 經(jīng)不同劑量的TACS、聯(lián)苯雙酯干預(yù)治療后，上述血清生化指標(biāo)、肝組織病理?yè)p傷及纖維化病變均具有較大程度的改善。 同時(shí)，TACS 可修正CCl4導(dǎo)致的大鼠血清脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 水平增加和SOD 水平降低。 提示調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善肝脂質(zhì)過(guò)氧化損傷以及提高抗氧化酶活性是TACS 保肝作用的機(jī)制之一。

HA 作為由HSC 合成的ECM 的主要成分，機(jī)體血清中HA 濃度異常升高可反映其過(guò)度分泌；LN 為HSC 合成的一種糖蛋白，在HF 病理進(jìn)展中，血清LN含量與纖維化嚴(yán)重程度高度相關(guān)；體內(nèi)合成膠原蛋白時(shí)，PCⅢ經(jīng)酶誘導(dǎo)釋放到血清中，常作為判斷ECM沉積程度；IV-C 是肝組織ECM 的重要組成部分，其血清水平與HF 嚴(yán)重度呈正相關(guān)[26-27]。因此，血清HA、LN、PCⅢ和IV-C 的含量可作為HF 的診療指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，TACS 干預(yù)可有效降低HF 大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 水平，提示TACS對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠HF 具有良好的抑制作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，絕大多數(shù)肝病的發(fā)展進(jìn)程中均涉及程度各異的氧化應(yīng)激反應(yīng)[28]。 氧化應(yīng)激反應(yīng)所生成的產(chǎn)物可用于肝細(xì)胞，引起大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的變性，使其細(xì)胞膜、亞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)被破壞后造成延續(xù)性氧化損傷；同時(shí)激活枯否細(xì)胞，活化的枯否細(xì)胞引起炎癥因子（如IL-1β、IL-8 和IL-6等）的大量釋放，這些炎癥因子可直接刺激HSC 的活化與增殖[29-30]；而活化后的HSC 導(dǎo)致ECM 過(guò)度形成與沉積，并會(huì)產(chǎn)生促HF 因子，該因子以反饋性調(diào)節(jié)自身或周圍HSC 細(xì)胞群體的形式，穩(wěn)定并增強(qiáng)肝臟纖維化狀態(tài)。 因此，炎癥因子的釋放水平能夠體現(xiàn)肝內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)水平[31]。本研究表明，模型組大鼠相較于正常組，其肝組織中IL-1β、IL-8 和IL-6 的表達(dá)水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)了HF 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。 與模型組比較，TACS 各劑量組和聯(lián)苯雙酯組大鼠肝組織中IL-1β、IL-8 和IL-6的水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 說(shuō)明TACS 可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-8 和IL-6 的表達(dá)而發(fā)揮抗HF 的作用。 此外，TGF-β1 作為極具代表性的促HF 因子，在HSC 的激活和HF進(jìn)展過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要作用；高水平的TGF-β1 可調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄引起ECM 過(guò)度表達(dá)并沉積，誘導(dǎo)或加速HF 發(fā)展，故有效抑制TGF-β1 表達(dá)是逆轉(zhuǎn)HF 形成的重要手段之一[32-33]。

綜上所述，TACS 對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HF 模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥因子及促纖維因子TGF-β1 表達(dá)等相關(guān)。 巖黃連主要分布于我國(guó)南方地區(qū)，在壯族民間，其已成為用于治療肝炎、肝硬化和肝癌等疾病的常用藥材。目前已研制有注射液和片劑等中成藥制劑，是臨床治療肝炎特別是乙型肝炎、肝硬化、肝癌的有效藥。近年研究發(fā)現(xiàn)，TACS 作為巖黃連主要有效成分，具有保肝及改善肝功能之功效，但是其抗HF 的作用研究尚不充分。 本研究采用多項(xiàng)指標(biāo)探討了TACS對(duì)HF 模型大鼠的改善調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了較為全面的考察，為TACS 抗HF 的開(kāi)發(fā)利用奠定了科學(xué)依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)深入研究。