摘要：鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）廣泛存在于植物細(xì)胞中，它通過(guò)調(diào)控小G蛋白的活性來(lái)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等多種胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。目前GEF已經(jīng)在擬南芥、水稻等物種中被發(fā)現(xiàn)，但番茄中GEF家族基因的研究尚未報(bào)道。本研究從番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選鑒定出了13個(gè)植物特有的GEF基因家族成員，并將其分別命名為SlRopGEF1～SlRopGEF13。利用生物信息學(xué)手段對(duì)其理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、共線性等進(jìn)行分析，并基于番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其組織特異性表達(dá)和青枯菌脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，13個(gè)番茄GEF基因分別定位在9條染色體，各染色體上平均分布1～3個(gè)基因；氨基酸序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，SlRopGEF都具有由多個(gè)保守基序組成的典型PRONE （plant-specific ROP nucleotide exchanger）結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示所有的SlRopGEF都定位于細(xì)胞核，SlRopGEF2和SlRopGEF11還部分分別定位于細(xì)胞膜和葉綠體中；根據(jù)物種間進(jìn)化關(guān)系分析將GEF家族成員分為3個(gè)亞族；番茄物種內(nèi)共線性分析檢測(cè)到6對(duì)共線性關(guān)系；物種間共線性分析結(jié)果顯示多個(gè)番茄SlRopGEF與擬南芥和水稻中GEF家族同源基因存在共線性關(guān)系；除SlRopGEF1和SlRopGEF7在根部組織中表達(dá)水平較高，其余SlRopGEF更傾向于在花和果實(shí)組織中積累；青枯菌侵染處理下，番茄抗病和感病品種中一些SlRopGEF的表達(dá)水平顯著性變化，表明部分GEF家族蛋白在調(diào)控番茄抗青枯病過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用。本研究結(jié)果為接下來(lái)探究番茄GEF家族蛋白的免疫功能并解析其通過(guò)調(diào)控小G蛋白活性以參與番茄抗青枯病提供了基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番茄；GEF基因家族；生物信息學(xué)；基因表達(dá)；青枯菌

中圖分類號(hào)：S436.412.1+5" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）24-0034-10

收稿日期：2023-12-26

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金（編號(hào)：2023M733004）；江蘇省科協(xié)青年科技人才托舉工程（編號(hào)：JSTJ-2023-007）。

作者簡(jiǎn)介：駱少丹（1996—），女，貴州安順人，碩士研究生，主要從事番茄青枯病抗性相關(guān)基因挖掘與功能分析方面的研究。E-mail：211211801105@stu.just.edu.cn。

通信作者：王 瓊，博士，講師，主要從事植物病理學(xué)、植物免疫學(xué)方面的教學(xué)與研究。E-mail：wangqiong@yzu.edu.cn。

番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內(nèi)一種重要且備受喜愛(ài)的蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物，也是研究果實(shí)發(fā)育與成熟的理想模式植物。成熟的番茄果實(shí)富含維生素C、番茄紅素、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)^［1］。在我國(guó)，番茄栽培面積和產(chǎn)量逐年增加，是種植面積最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的蔬菜作物之一^［2］。但番茄在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中經(jīng)常受到真菌、病毒、細(xì)菌等生物脅迫，嚴(yán)重危害其產(chǎn)量與品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）在茄科作物上引起的一種土傳性細(xì)菌病害，在我國(guó)番茄主產(chǎn)區(qū)發(fā)病日趨嚴(yán)重。青枯菌在入侵植物根部或莖基部的導(dǎo)管系統(tǒng)后，可堵塞或破壞寄主維管束輸導(dǎo)組織，導(dǎo)致植株失水枯萎但仍保持青綠^［3］。在防治番茄青枯病的眾多措施中，培育并種植抗病品種是最為綠色環(huán)保且高效的途徑之一，而發(fā)掘抗病相關(guān)基因則可為育種工作提供新的遺傳資源和理論指導(dǎo)。

鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）是小G蛋白從GDP結(jié)合的非活性形式轉(zhuǎn)換為GTP結(jié)合的活性形式關(guān)鍵調(diào)控因子^［4-5］。GEF蛋白可刺激GDP從小G蛋白上釋放，使細(xì)胞內(nèi)高濃度水平的GTP自發(fā)地結(jié)合到無(wú)核苷酸結(jié)合形式的小G蛋白上，從而將小G蛋白激活^［6-7］。PRONE （plant-specific ROP nucleotide exchanger）類型的 GEF是植物所特有的一類GEF蛋白，最初是通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，并被命名為RopGEF^［8］。RopGEF具有一個(gè)可變的N端和C端以及中央保守的PRONE結(jié)構(gòu)域。PRONE結(jié)構(gòu)域具有催化功能并且直接與下游小G蛋白結(jié)合，而C端可變區(qū)則具有抑制GEF活性的作用^［9-10］。

GEF在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。擬南芥GEF家族蛋白AtRopGEF1和AtRopGEF4與AtROP11互作并特異性地調(diào)控脫落酸（ABA）介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程^［11］。AtRopGEF7激活A(yù)tRAC1，并通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平從而維持根部干細(xì)胞生態(tài)位^［12］。OsRopGEF7B調(diào)節(jié)水稻花器官的發(fā)育，影響水稻結(jié)實(shí)率^［13］。藍(lán)莓基因組共編碼32個(gè)GEF蛋白，其中VcGEF3參與根毛和表皮毛發(fā)育調(diào)控^［14］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一些GEF蛋白的活性還受其上游類受體激酶（receptor-like kinase，RLK）的調(diào)控，比如擬南芥花粉特異性類受體激酶AtPRK2和AtPRK6直接磷酸化RopGEF的C端，從而逐級(jí)激活RopGEFs-ROPs介導(dǎo)的花粉管極性生長(zhǎng)途徑^［15-16］。類似地，長(zhǎng)春花類受體激酶家族蛋白FERONIA與RopGEF互作并將其激活，進(jìn)而參與ROS介導(dǎo)的根毛發(fā)育、花粉管信號(hào)感知以及白粉病感染等多種胞內(nèi)活動(dòng)^［17-19］。此外，水稻類受體激酶OsCERK1被幾丁質(zhì)信號(hào)激活后可磷酸化OsRacGEF1的C末端第549位絲氨酸，從而將OsRacGEF1激活。被激活的OsRacGEF1可通過(guò)與小G蛋白OsRac1互作將其激活，隨后誘導(dǎo)一系列免疫反應(yīng)以防御稻瘟病菌的入侵^［20］。越來(lái)越多的證據(jù)表明RLK-GEF-Rop/Rac是調(diào)控植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，且在不同物種中具有一定的保守性。近期筆者所在課題組對(duì)番茄ROP家族9個(gè)小G蛋白（SlRop1-9）的亞細(xì)胞定位、免疫功能以及是否參與調(diào)控抗青枯病進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，發(fā)現(xiàn)在本氏煙草中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)激活狀態(tài)的SlRop3和SlRop4可抑制青枯菌的增殖^［21］。鑒于SlRop3和SlRop4極有可能具有正調(diào)控番茄青枯病抗性的能力，而GEF蛋白是細(xì)胞內(nèi)小G蛋白的激活者，那么番茄中必然存在可以調(diào)節(jié)SlRop3和SlRop4活性狀態(tài)的GEF蛋白。但是，至今尚未見(jiàn)任何有關(guān)于番茄中GEF蛋白的系統(tǒng)性分析以及其參與調(diào)控青枯病抗性功能的報(bào)道。

本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)番茄GEF家族進(jìn)行了全基因組鑒定，對(duì)鑒定到的13個(gè)GEF基因折理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、共線性關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了分析，并利用番茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其組織特異性表達(dá)和青枯菌侵染脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步探究番茄GEF家族蛋白的抗青枯病功能以及揭示GEF-ROP模塊調(diào)控番茄青枯病抗性的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2023年3—8月在揚(yáng)州大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理系實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 試驗(yàn)材料

本研究選用番茄Ailsa Craig品種作為試驗(yàn)材料，培養(yǎng)于28 ℃、75%濕度、12 h光周期的人工氣候室10 d，然后收集番茄幼苗的新鮮根、莖、葉，液氮速凍并保存于-80 ℃。

1.3 番茄GEF基因家族的檢索和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

將水稻OsRacGEF1（Os09g0544800）編碼的氨基酸序列導(dǎo)入番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//solgenomics.net/）進(jìn)行BLAST搜索，下載番茄GEF基因組序列、編碼序列（coding sequence，CDS）和蛋白序列。在擬南芥基因組網(wǎng)站TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)RAP-DB（https：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）中分別下載擬南芥和水稻的GEF基因家族蛋白序列。

使用Expasy網(wǎng)站在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析SlRopGEF基因的理化性質(zhì)。利用Cell-PLoc 2.0網(wǎng)站中的Plant-mPLoc服務(wù)器（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測(cè)番茄GEF家族蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.4 序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

分別利用在線軟件MUSCLE（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）和GeneDoc（http：//www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html）對(duì)番茄13個(gè)GEF家族蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)及將比對(duì)結(jié)果可視化。

將番茄、水稻和擬南芥GEF基因家族成員的氨基酸序列按上述方法進(jìn)行多序列比對(duì)，使用trimAI軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行修整以排除不需要的區(qū)域，然后使用IQ-TREE軟件（設(shè)置bootstrap重復(fù)次數(shù)為 1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 染色體分布、保守基序、基因結(jié)構(gòu)與共線性分析

使用MEME軟件鑒定番茄GEF家族蛋白序列中的保守基序，設(shè)置保守基序最小長(zhǎng)度為6，最大長(zhǎng)度為50，最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目為15個(gè)。在茄科數(shù)據(jù)庫(kù)下載番茄SlRopGEF基因組注釋文件，利用TBtools提取基因起始位置、ID及Chrom等信息，并繪制染色體定位圖并進(jìn)行物種內(nèi)共線性分析。采用GSDS在線軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）繪制番茄GEF基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)圖。利用MCScanX軟件分別繪制番茄與水稻、番茄與擬南芥之間的共線性關(guān)系圖。

1.6 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用南京諾唯贊公司的FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit和HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒分別進(jìn)行番茄幼苗根、莖、葉總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用南京諾唯贊公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒和美國(guó)伯樂(lè)CFX96 Touch Real-Time PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試驗(yàn)。利用qPrimerDB在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//qprimerdb.biodb.org/）搜索SlRopGEF1～SlRopGEF13基因的特異性實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增引物序列（表1），并在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以番茄根、莖、葉的cDNA為模板，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)GEF家族基因在番茄不同器官中的表達(dá)水平。擴(kuò)增體系總體積12 μL，包括cDNA 2 μL、2×SYBR Master Mix 6 μL、10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL和去離子水3 μL。使用SlUbiquitin7基因作為定量分析內(nèi)參基因，qPCR引物序列見(jiàn)表1。試驗(yàn)共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 表達(dá)模式分析

利用Tomato Functional Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/-TFGD/digital/h-ome.cgi）搜索并下載SlRopGEF基因在番茄Heinz品種的不同器官組織以及不同成熟度果實(shí)中的表達(dá)水平（RPKM），并使用TBtools繪制基因相對(duì)表達(dá)熱圖。在線下載青枯菌侵染番茄抗病品種（Hawaii 7996）和感病品種（M82）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)（https：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.14175），利用GraphPad Prism 9.5軟件對(duì)SlRopGEF基因在青枯菌脅迫后的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄GEF基因家族鑒定及理化性質(zhì)分析

基于水稻OsRacGEF1的序列在番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共搜索到13個(gè)番茄GEF基因，根據(jù)各基因染色體位置及與水稻GEF基因家族的同源關(guān)系依次將其命名為SlRopGEF1～SlRopGEF13。由圖1可知，番茄GEF家族基因分布在9條染色體上，其中12號(hào)染色體上分布最多，有3個(gè)GEF基因；1號(hào)和8號(hào)染色體上各分布2個(gè)GEF基因；3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、9號(hào)和10號(hào)染色體上各分布1個(gè)GEF基因。接下來(lái)對(duì)13個(gè)SlRopGEF的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（表2）顯示，番茄GEF蛋白長(zhǎng)度在469～679個(gè)氨基酸之間，蛋白分子量大小在53.1～76.2 ku之間，理論等電點(diǎn)在 5.20～8.36之間。SlRopGEF蛋白不穩(wěn)定系數(shù)在46.28～59.42之間，表示全部處于不穩(wěn)定形態(tài)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，番茄GEF基因家族成員都定位于細(xì)胞核中；SlRopGEF2和SlRopGEF11除定位在細(xì)胞核外，還分別定位于細(xì)胞膜和葉綠體中。

2.2 番茄GEF家族系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)報(bào)道可知，擬南芥和水稻基因組分別共編碼14、11個(gè)PRONE類型的GEF蛋白^{［9，22］}。為了揭示番茄GEF基因在進(jìn)化過(guò)程中與其他物種中該家族基因的同源關(guān)系，將番茄、水稻和擬南芥中所有GEF基因家族蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖2）顯示，所有的GEF基因可根據(jù)其親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分為3個(gè)亞族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），同一亞族成員之間具有較高的同源性以及較近的親緣關(guān)系，可能發(fā)揮相似的功能。亞族Ⅰ由6個(gè)AtRopGEF、4個(gè)OsRopGEF和5個(gè)SlRopGEF組成；亞族Ⅱ有1個(gè)AtRopGEF、1個(gè)OsRopGEF和2個(gè)SlRopGEF；亞族Ⅲ包括7個(gè)AtRopGEF、6個(gè)OsRopGEF和6個(gè)SlRopGEF。其中SlRopGEF1、SlRopGEF2、SlRopGEF4、SlRopGEF7、SlRopGEF9、SlRopGEF10與水稻中調(diào)控稻瘟病抗性的關(guān)鍵免疫因子OsRacGEF1（即OsRopGEF7）處于同一亞族中，暗示著這些SlRopGEF也有參與番茄的免疫信號(hào)通路的可能。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖3）顯示除SlRopGEF13有13個(gè)外顯子外，其余12個(gè)GEF基因外顯子數(shù)都在5～7個(gè)之間。保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果表明，番茄GEF家族蛋白序列中存在10個(gè)保守基序，依次將其命名為motif1～motif10。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)除SlRopGEF4和SlRopGEF13只含有8個(gè)保守基序外，其余SlRopGEF都含有9個(gè)保守基序；同一亞族GEF同源蛋白的保守基序組成幾乎一致；亞族Ⅰ特異性含有motif 8但不含motif 10，而亞族Ⅱ特異性含有motif 10卻不含motif 8；13個(gè)SlRopGEF的所有保守基序都處于GEF蛋白的PRONE結(jié)構(gòu)域內(nèi)且序列相似度較高（圖3和圖4）。

2.3 GEF基因家族共線性分析

番茄基因組內(nèi)GEF基因共線性分析結(jié)果顯示存在6個(gè)旁系同源基因?qū)?，分別為SlRopGEF2/SlRopGEF4、SlRopGEF3/SlRopGEF5、SlRopGEF3/SlRopGEF12、SlRopGEF5/SlRopGEF11、SlRopGEF5/SlRopGEF12和SlRopGEF9/SlRopGEF10（圖5）。每組旁系同源基因?qū)χg存在大片段同源現(xiàn)象，且同源片段內(nèi)部基因排序保守，這意味著功能上可能也是保守的。

番茄與擬南芥和水稻基因組中GEF基因家族的物種間共線性分析結(jié)果（圖6）表明，SlRopGEF中有9個(gè)基因與AtRopGEF為直系同源基因，其中SlRopGEF3、SlRopGEF5和SlRopGEF12都與AtRopGEF11有共線性，SlRopGEF5和SlRopGEF12都與AtRopGEF12有共線性，SlRopGEF9和SlRopGEF10都與AtRopGEF7有共線性，暗示這3組基因可能發(fā)揮相似的功能。此外，SlRopGEF中有5個(gè)基因與OsRopGEF為直系同源基因，其中SlRopGEF9和SlRopGEF10都與OsRopGEF5和OsRopGEF10有共線性，SlRopGEF2和SlRopGEF4都與OsRopGEF7（即OsRacGEF1）有共線性，進(jìn)一步提高了SlRopGEF2和SlRopGEF4在番茄中發(fā)揮抗病功能的可能性。相較于擬南芥，水稻中SlRopGEF的直系同源基因數(shù)目較少，表明番茄中該基因家族與擬南芥親緣關(guān)系更近。番茄SlRopGEF6、SlRopGEF7和SlRopGEF13與擬南芥和水稻基因組GEF基因家族中成員均無(wú)共線性關(guān)系，這可能是由于進(jìn)化過(guò)程中這些基因發(fā)生變異從而獲得了新的特異性功能。

2.4 番茄GEF家族基因在不同組織中的表達(dá)分析

為了深入了解GEF基因在番茄生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，本研究利用番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中Heinz番茄品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，結(jié)果表明SlRopGEF具有不同的表達(dá)譜。由圖7可知，SlRopGEF13在所有組織中的轉(zhuǎn)錄水平都是最高的，SlRopGEF7的整體表達(dá)水平較低；SlRopGEF1和SlRopGEF7在根部組織中表達(dá)較多，暗示這2個(gè)基因可能參與調(diào)控根部某些細(xì)胞通路，例如根毛發(fā)育、響應(yīng)土壤環(huán)境脅迫等；SlRopGEF3、SlRopGEF4、SlRopGEF5、SlRopGEF6、SlRopGEF8、SlRopGEF11和SlRopGEF12在花器官中顯著表達(dá)，它們極有可能在花器官生長(zhǎng)、發(fā)育或其他信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用；SlRopGEF2、SlRopGEF9、SlRopGEF10和SlRopGEF13則傾向于在果實(shí)中表達(dá)，表明這些基因有調(diào)控果實(shí)成熟、顏色、形狀、大小或其他果實(shí)發(fā)育指標(biāo)的可能。

由于本研究重點(diǎn)關(guān)注GEF家族基因響應(yīng)青枯菌入侵脅迫的情況，而根—莖—葉是青枯菌從土壤向番茄入侵的途徑，因此接下來(lái)利用qRT-PCR方法對(duì)番茄Ailsa Craig品種幼苗的根、莖、葉組織中的SlRopGEF基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果（圖8）與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致。

2.5 番茄GEF家族基因受青枯菌誘導(dǎo)表達(dá)分析

為了初步探究番茄GEF家族基因在抗青枯病過(guò)程中的作用，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別對(duì)青枯菌侵染處理（0、3、5 d）后番茄抗病和感病品種中SlRopGEF在根、莖部組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果（圖9）顯示，青枯菌處理后5 d，SlRopGEF1、SlRopGEF4、SlRopGEF7、SlRopGEF9、SlRopGEF10、SlRopGEF11和SlRopGEF13的表達(dá)水平在感病或抗病品種的根或莖中受到顯著下調(diào)；而抗病品種根部SlRopGEF6和SlRopGEF8的表達(dá)水平在青枯菌侵染3 d時(shí)受到顯著上調(diào)； SlRopGEF2、 SlRopGEF3和SlRopGEF5的轉(zhuǎn)錄水平并不受青枯菌脅迫的影響；SlRopGEF12由于轉(zhuǎn)錄水平過(guò)低，在各品種組織中都未被檢測(cè)到。綜上而言，除SlRopGEF2、SlRopGEF3、SlRopGEF5和SlRopGEF12外，其余SlRopGEF均有可能在調(diào)控番茄青枯病抗性中發(fā)揮一定的作用。

3 討論與結(jié)論

迄今為止，GEF家族基因已在多個(gè)物種中被鑒定出來(lái)，其中水稻中有11個(gè)、擬南芥中有14個(gè)、藍(lán)莓中有32個(gè)，但尚無(wú)番茄中GEF家族基因的相關(guān)報(bào)道^{［9，14］}。本研究基于番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)共鑒定到13個(gè)GEF基因，分布在9條染色體上，并將其命名為SlRopGEF1～SlRopGEF13。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，SlRopGEF蛋白的等電點(diǎn)介于5.20～8.36之間，其中酸性蛋白占85%左右，說(shuō)明大部分SlRopGEF可能會(huì)定位于酸性細(xì)胞環(huán)境中。番茄、水稻和擬南芥3個(gè)物種中GEF基因家族的進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果揭示番茄GEF家族基因可分為3個(gè)聚類組，這與藍(lán)莓中報(bào)道的研究結(jié)果^［14］相同。值得注意的是，SlRopGEF1、SlRopGEF2、SlRopGEF4、SlRopGEF7、SlRopGEF9、SlRopGEF10與水稻中OsRopGEF7（也叫OsRacGEF1）處于同一分組中，而OsRacGEF1是正調(diào)控稻瘟病抗性的關(guān)鍵因子，推測(cè)番茄中同組GEF基因可能也具有響應(yīng)病原菌入侵的相似功能^［20］。保守結(jié)構(gòu)域組成與進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果基本一致，即具有相似保守基序的SlRopGEF聚類在同一分組中。組織特異性表達(dá)和青枯菌誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果顯示，SlRopGEF1和SlRopGEF7傾向于在番茄根部表達(dá)且其表達(dá)水平受青枯菌侵染抑制，暗示這2個(gè)基因很有可能在番茄根部中參與響應(yīng)青枯菌

入侵的免疫信號(hào)途徑。

根據(jù)報(bào)道可知，GEF蛋白最典型的功能是在受到上游信號(hào)分子刺激后調(diào)控小G蛋白的活性：幾乎所有的GEF蛋白都是通過(guò)與小G蛋白互作以占據(jù)小G蛋白上的鎂離子和磷酸基結(jié)合位點(diǎn)以促進(jìn)GDP的解離，催化小G蛋白從與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變成與GTP結(jié)合的活性狀態(tài)^［23］。被激活的小G蛋白通過(guò)與不同的下游蛋白互作，從而調(diào)控不同的胞內(nèi)信號(hào)通路。比如，水稻OsRacGEF1與小G蛋白OsRac1互作并將其激活，被激活的OsRac1與包括支架蛋白OsRACK1A、OsMPK3/6、NADPH氧化酶、木質(zhì)素生物合成酶OsCCR1等15個(gè)組分互作，調(diào)控ROS產(chǎn)生及抗病相關(guān)基因的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌入侵的防御^［24-27］。筆者所在課題組前期發(fā)現(xiàn)番茄中的小G蛋白SlRop3和SlRop4可能正調(diào)控番茄青枯病抗性，但是調(diào)控其活性的上游GEF蛋白尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道^［21］。本研究鑒定出了2個(gè)可能響應(yīng)青枯病脅迫的GEF蛋白——SlRopGEF1和SlRopGEF7，這為進(jìn)一步探究番茄GEF-ROP模塊參與抗青枯病過(guò)程的分子機(jī)制提供了一定的研究方向和理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］Li N，Wu X T，Zhuang W，et al. Tomato and lycopene and multiple health outcomes：umbrella review［J］. Food Chemistry，2021，343：128396.

［2］李君明，項(xiàng)朝陽(yáng)，王孝宣，等. “十三五”我國(guó)番茄產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及展望［J］.中國(guó)蔬菜，2021（2）：13-20.

［3］姚文武，張曉麗，秦雙林，等. 番茄青枯病發(fā)生機(jī)制及主要防治技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 長(zhǎng)江蔬菜，2022（20）：30-34.

［4］Cherfils J，Zeghouf M. Regulation of small GTPases by GEFs，GAPs，and GDIs［J］. Physiological Reviews，2013，93（1）：269-309.

［5］Feiguelman G，F(xiàn)u Y，Yalovsky S. ROP GTPases structure-function and signaling pathways［J］. Plant Physiology，2018，176（1）：57-79.

［6］Bos J L，Rehmann H，Wittinghofer A. GEFs and GAPs：critical elements in the control of small G proteins［J］. Cell，2007，129（5）：865-877.

［7］Berken A，Wittinghofer A. Structure and function of Rho-type molecular switches in plants［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2008，46（3）：380-393.

［8］Berken A，Thomas C，Wittinghofer A. A new family of RhoGEFs activates the Rop molecular switch in plants［J］. Nature，2005，436（7054）：1176-1180.

［9］Gu Y，Li S D，Lord E M，et al. Members of a novel class of Arabidopsis rho guanine nucleotide exchange factors control rho GTPase-dependent polar growth［J］. The Plant Cell，2006，18（2）：366-381.

［10］Zhang Y，McCormick S. A distinct mechanism regulating a pollen-specific guanine nucleotide exchange factor for the small GTPase Rop in Arabidopsis thaliana［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104（47）：18830-18835.

［11］Li Z X，Liu D. ROPGEF1 and ROPGEF4 are functional regulators of ROP11 GTPase in ABA-mediated stomatal closure in Arabidopsis［J］. FEBS Letters，2012，586（9）：1253-1258.

［12］Chen M，Liu H L，Kong J X，et al. RopGEF7 regulates PLETHORA-dependent maintenance of the root stem cell niche in Arabidopsis［J］. The Plant Cell，2011，23（8）：2880-2894.

［13］Huang J Q，Liu H L，Berberich T，et al. Guanine Nucleotide Exchange Factor 7B （RopGEF7B） is involved in floral organ development in Oryza sativa［J］. Rice，2018，11（1）：42.

［14］尹亞紅，馬 芮，李 可，等. 藍(lán)莓GEF家族基因鑒定與功能分析［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2023，59（3）：515-526.

［15］Chang F，Gu Y，Ma H，et al. AtPRK2 promotes ROP1 activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth［J］. Molecular Plant，2013，6（4）：1187-1201.

［16］Yu Y X，Song J L，Tian X H，et al. Arabidopsis PRK6 interacts specifically with AtRopGEF8/12 and induces depolarized growth of pollen tubes when overexpressed［J］. Science China（Life Sciences），2018，61（1）：100-112.

［17］Duan Q H，Kita D，Li C，et al. FERONIA receptor-like kinase regulates RHO GTPase signaling of root hair development［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（41）：17821-17826.

［18］Kessler S A，Shimosato-Asano H，Keinath N F，et al. Conserved molecular components for pollen tube reception and fungal invasion［J］. Science，2010，330（6006）：968-971.

［19］Nibau C，Cheung A Y. New insights into the functional roles of CrRLKs in the control of plant cell growth and development［J］. Plant Signaling amp; Behavior，2011，6（5）：655-659.

［20］Akamatsu A，Wong H L，F(xiàn)ujiwara M，et al. An OsCEBiP/OsCERK1-OsRacGEF1-OsRac1 module is an essential early component of chitin-induced rice immunity［J］. Cell Host amp; Microbe，2013，13（4）：465-476.

［21］Wang Q，Zhang D，Liu C C，et al. Comprehensive analysis of subcellular localization，immune function and role in bacterial wilt disease resistance of Solanum lycopersicum Linn. ROP family small GTPases［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（17）：9727.

［22］Kim E J，Park S W，Hong W J，et al. Genome-wide analysis of RopGEF gene family to identify genes contributing to pollen tube growth in rice （Oryza sativa）［J］. BMC Plant Biology，2020，20（1）：95.

［23］Thomas C，F(xiàn)ricke I，Scrima A，et al. Structural evidence for a common intermediate in small G protein-GEF reactions［J］. Molecular Cell，2007，25（1）：141-149.

［24］Nakashima A，Chen L T，Thao N P，et al. RACK1 functions in rice innate immunity by interacting with the Rac1 immune complex［J］. The Plant Cell，2008，20（8）：2265-2279.

［25］Kim S H，Oikawa T，Kyozuka J，et al. The bHLH rac Immunity1 （RAI1） is activated by OsRac1 via OsMAPK3 and OsMAPK6 in rice immunity［J］. Plant and Cell Physiology，2012，53（4）：740-754.

［26］Wong H L，Pinontoan R，Hayashi K，et al. Regulation of rice NADPH oxidase by binding of rac GTPase to its N-terminal extension［J］. The Plant Cell，2007，19（12）：4022-4034.

［27］Kawasaki T，Koita H，Nakatsubo T，et al. Cinnamoyl-CoA reductase，a key enzyme in lignin biosynthesis，is an effector of small GTPase Rac in defense signaling in rice［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（1）：230-235.