王彥林

中國福利會國際和平婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（上海 200030）

近10 余年，伴隨醫(yī)學技術的快速進步，尤其是醫(yī)學遺傳學技術與宮內(nèi)操作技術的飛躍式發(fā)展，一批新技術應用于圍產(chǎn)醫(yī)學臨床，改變了產(chǎn)前診斷與胎兒醫(yī)學的面貌。胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）、染色體微陣列（chromosomal micro-array，CMA）、外顯組測序（exome sequencing，ES）等遺傳學技術的臨床應用，高分辨影像學技術在胎兒疾病診斷中的應用，胎兒宮內(nèi)治療技術以及產(chǎn)房外科治療（ex-utero intrapartum treatment，EXIT）技術日新月異，將既往的縱向學科鏈胎兒-新生兒-兒科理念推向整合，宮內(nèi)兒科學應運而生[1]。圍產(chǎn)醫(yī)療的重心不斷向母胎雙重關注方向轉移。

NIPT 是過去10 余年里產(chǎn)前診斷領域的重大突破。NIPT 大幅提升了唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的靈敏度和特異度，在臨床得到廣泛應用。低深度基因組測序技術的特點賦予了NIPT 唐氏綜合征篩查以外的更多潛力，但是也給結果解讀和臨床處理帶來了極大的復雜性。一方面，NIPT 在未來必將應用于更為廣泛的領域；另一方面，臨床上關于NIPT 的許多應用存在許多相對模糊的區(qū)域。NIPT 依然面臨許多實際問題和困惑，需要更多循證醫(yī)學證據(jù)加以厘清，以導向更為科學的臨床實踐。

1 高齡及合并多種高危因素雙胎妊娠的NIPT選擇

NIPT 目前已作為低危雙胎人群非整倍體一線篩查方案[2]。然而迄今為止，對于什么是雙胎妊娠的“高齡”及“高危人群”則并無界定。通常對于單胎，基于非整倍體發(fā)生風險，將分娩時≥35 歲定義為高齡人群，而對于雙胎，既往將32 歲作為高齡的界限[3]。NIPT 的出現(xiàn)模糊了“高齡”作為產(chǎn)前診斷指征的界限，而基于輔助生育技術的二代、三代試管雙胎，以及“高齡”雙胎，雖然一直是業(yè)界共識需要后續(xù)進行產(chǎn)前診斷的人群，但是這些人群也是最希望規(guī)避侵入性操作風險的孕婦。雖然羊水CMA 和ES 能夠獲得比NIPT 更多信息，但是產(chǎn)前診斷也必須考慮風險的必要性。對于“高?！被蛘摺案啐g”孕婦，CMA 與ES 相比NIPT 所能獲得邊際效應需要充分的臨床研究證據(jù)，以評價這部分孕婦承受侵入性檢測風險接受產(chǎn)前診斷是否確實有益。

2 雙胎之一早期消失的NIPT最佳時機

輔助生殖技術是雙胎的重要來源之一。伴隨輔助生殖技術的推廣，雙胎之一早期消失發(fā)生率達到了15%～30%[4]，成為NIPT假陽性、假陰性以及重抽血率增加的重要因素之一。這一情況臨床常見，因此諸多研究團隊都在試圖攻克這一難題。然而，當前沒有足夠的數(shù)據(jù)來全面評估消失雙胎NIPT的表現(xiàn)。通常的臨床共識是一胎消失后8周進行NIPT檢測。筆者與張靜瀾博士團隊[5]之前針對不同孕周不同絨毛膜性減胎人群的研究發(fā)現(xiàn)，通過胎兒特異性單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的數(shù)量和等位基因分數(shù)不但可以檢測卵子捐贈、污染和雙胞胎完整的葡萄胎等復雜妊娠，同時發(fā)現(xiàn)約80%(7/9)未發(fā)育雙胎的游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）在減胎7周后下降，而67%(6/9)的幸存胎兒cffDNA 在減胎2 天內(nèi)立即增加。8 周是否是合適的雙胎之一消失后的NIPT檢測時間，是否需要等待更長時間以提高NIPT檢測的準確性，尚缺乏足夠的證據(jù)。

3 NIPT異常結果對妊娠合并惡性腫瘤的提示作用

外周血游離DNA 不但包括來自胎兒的DNA，也可能包括來自惡性腫瘤細胞的DNA。因此，在妊娠患者基于NIPT的胎兒風險評估中，也可以檢測到源自母體腫瘤的DNA 序列。多條染色體非整倍體（multiple chromosome aneuploidies，MCAs）是NIPT檢測失敗或者結果異常的最常見原因之一，也是提示隱匿性母體惡性腫瘤最常報告的NIPT異常。2015年，Bianchi等[6]總結了125 426例NIPT檢測隊列，其中共報道了39例MCAs結果，發(fā)生概率為萬分之3。其中7例確診為妊娠合并惡性腫瘤。國內(nèi)學者針對193萬例NIPT檢測的回顧性研究中共發(fā)現(xiàn)639例MCAs的孕婦，其發(fā)生比例與Bianchi團隊報道一致，并從中診斷了41例妊娠合并惡性腫瘤患者[7]。

現(xiàn)有研究已經(jīng)證實，NIPT檢測發(fā)現(xiàn)的MCAs與妊娠合并惡性腫瘤存在相關性。當NIPT成為針對唐氏綜合征的一線篩查方法之后，勢必需要更有效的方法對孕婦是否合并惡性腫瘤進行評估。上述國內(nèi)學者的研究分析了所有MCAs孕婦的CNV數(shù)據(jù)，以CNV區(qū)域在整個基因組中的占比（fraction of CNV，F(xiàn)CNV）為標志物對MCAs孕婦罹患惡性腫瘤的風險進行分級，結果發(fā)現(xiàn)FCNV 對MCAs 孕婦的惡性腫瘤陽性預測值可以達到30%；如進一步結合血漿生化腫瘤標志物后，陽性預測值可達到75%。但是，這一模型在臨床實際應用的效果究竟如何尚無評價數(shù)據(jù)。NIPT檢測到的惡性腫瘤中構成比較高的是淋巴瘤、乳腺癌和消化道腫瘤，超聲、磁共振成像和內(nèi)鏡等影像學技術在后續(xù)診斷中的作用非常重要。但是，目前對這類孕婦的臨床綜合評價尚無可參考的規(guī)范，也缺乏系統(tǒng)的評估體系。其中尤為重要的是，當報告孕婦存在合并惡性腫瘤高風險后，將對其帶來極大的心理壓力，使之產(chǎn)生焦慮、抑郁等情緒，影響母嬰安全。在缺乏系統(tǒng)性評價體系的情況下，報告此類風險，將帶來很大的倫理問題。

4 性染色體異常的倫理思考

雖然NIPT 的目標疾病是唐氏綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征，但是性染色體異常從一開始就以附加報告的形式出現(xiàn)。性染色體異常種類多，并且嵌合的發(fā)生率高，其在染色體非整倍體中構成比最高。但是與唐氏綜合征等疾病不同，性染色體異常大多并不屬于嚴重致殘致畸的疾病。Turner綜合征和Klinefelter綜合征以影響生育為主要表現(xiàn)，而47,XXX綜合征則可能不產(chǎn)生任何臨床可見的表型。此外，性染色體異常由于存在嵌合、X染色體失活等因素，其表型變異多，異質(zhì)性很大。

產(chǎn)前診斷往往以終止嚴重發(fā)育異常胎兒的妊娠為最終目的，出于倫理考量，對于性染色體異常的NIPT結果是否報告存在較多爭議。許多國家并不將性染色體列入NIPT篩查范圍。歐洲人類遺傳學會和美國人類遺傳學會聯(lián)合聲明，反對NIPT對性染色體進行篩查[8]。國際產(chǎn)前診斷學會、澳大利亞和新西蘭皇家婦產(chǎn)科學院聲明，性染色體篩查需在知情同意下有選擇的進行。

不可否認的現(xiàn)狀是，在我們現(xiàn)有NIPT陽性報告中，診室的空間及時間資源有將近一半被這一類報告占據(jù)。因此，我們所面對的問題并非是否報道性染色體異常結果（在目前的現(xiàn)實情況下討論這一問題是不切實際的），而是怎樣在遺傳咨詢的過程中提供科學的決策依據(jù)。以宮內(nèi)兒科學的理念處理這一問題，需要咨詢醫(yī)師在面對孕婦的同時，也為尚未出生的胎兒負責。實際上，在真實世界中只有25%的Klinefelter綜合征患者因一系列問題就診[9]，這是否意味著許多性染色體異常的胎兒出生后并不會面臨實際的問題？通過顯微外科和輔助生育等手段，一些Klinefelter 綜合征的患者也能獲得生育能力。因此對于這類患者，亟需大樣本的縱向研究或橫斷面研究回答在現(xiàn)代醫(yī)療技術介入的情況下，他們在性功能、生育、學業(yè)、就業(yè)等方面的真實情況，而非籠統(tǒng)地以“不能生育”進行總結。這些都是正確處理性染色體異常的NIPT 結果、提供科學遺傳咨詢意見、進行充分知情選擇的必備功課。

5 單基因疾病無創(chuàng)產(chǎn)前篩查真正應用于臨床的困境

雖然NIPT 從唐氏綜合征擴展到包括基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）等一系列異常，但是其所針對的依然是染色體結構異常和微缺失、微重復綜合征。由于NIPT 低深度NGS 的特點以及cffDNA 在孕婦外周血中的低濃度，傳統(tǒng)的NIPT 技術難以對胎兒單基因疾病進行篩查。針對胎兒單基因遺傳病的無創(chuàng)檢測目前主要遵循兩種策略。

一種是針對胎兒與母親的差異序列進行檢測，即胎兒的基因變異為新發(fā)變異，或者為遺傳自父親的變異。這一情況下由于排除了母親同源序列的位點干擾，適當加深測序深度，采用針對性的數(shù)據(jù)解讀程序，就能對胎兒是否攜帶某個變異位點進行檢測。2011年英國國家醫(yī)療體系（UK National Health Service,NHS）首次批準NIPT用于胎兒性別確定以及Rh陰性孕婦胎兒Rh血型的臨床鑒定[10-14]。2012年NHS批準NIPT用于FGFR3基因變異導致的軟骨發(fā)育不全和致死性發(fā)育不良[15]。2014年，NHS批準基于NGS的NIPT技術進行多個基因的父源或顯性新發(fā)變異檢測[16]。貝勒醫(yī)學院于2021年發(fā)表一項基于NGS技術、包含25種顯性單基因病、30個基因檢測的前瞻性研究，共納入2 208名孕婦，結果顯示陽性率高達5.7%，在有隨訪結局的65 例中沒有發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性案例[17]。2022年復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院徐晨明教授團隊采用協(xié)調(diào)等位基因感知靶標富集測序（coordinative allele-aware target enrichment sequencing，COATE-seq）同時進行拷貝數(shù)變異和顯性單基因病檢測，在入組的1 129名孕婦中，檢測到54例胎兒非整倍體、8例微缺失/微重復和8例單基因變異，靈敏度為100%，特異度為99.3%[18]。

去年11月，新英格蘭醫(yī)學雜志同期發(fā)表了兩篇通訊[19-20]，分別介紹了采用深度家系外顯組測序和高分辨率無創(chuàng)胎兒外顯組篩查的方法，深度家系外顯組測序能夠在完成攜帶者篩查的同時，準確檢出胎兒與母親的差異位點，而高分辨外顯組篩查方法也可以實現(xiàn)對各胎齡胎兒新發(fā)變異的準確檢出。

不同于差異性序列分析，對于母親攜帶相同致病變異的胎兒（如常染色體隱性遺傳病或者X 連鎖隱性遺傳?。捎跈z測分辨率的問題，目前無法通過直接測量方法對胎兒的基因型做出判斷?；趧┝渴Ш庥嬎闾旱膯伪缎褪侵饕募夹g手段。劑量失衡計算方法主要包括相對變異劑量（relative mutation dosage，RMD）計算和相對單倍型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）計算兩種。RHDO在多種疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中被報道，但是這種方法需要先證者的樣本來確定父母的單倍型，因此僅限于再發(fā)預防。然而，有先證者的家庭一般傾向于高估風險，更愿意選擇產(chǎn)前診斷。目前很多研究的目標是開發(fā)無先證者的 RHDO，長度長測序等技術可能在此領域產(chǎn)生突破。此外，增加胎兒DNA 濃度結合靶向測序的方法，也可能是另一條路徑。前述高分辨率無創(chuàng)胎兒外顯組篩查的研究顯示，在cffDNA占比超過20%時，可以檢測出胎兒是否攜帶母系遺傳的變異。

6 非cffDNA來源的NIPT新方法臨床應用的潛力

臨床目前采用的NIPT 基于cffDNA 的低深度NGS，不區(qū)分來自胎兒的DNA與來自母親的DNA，因此有其方法學上的局限。有學者在探索采用其他來源的胎兒遺傳物質(zhì)，實現(xiàn)類似基于cffDNA 的NIPT功能，并且獲得cffDNA所不包含的信息。其中，基于細胞的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（cell-based NIPT,cbNIPT）是研究較多的一種方法。在妊娠期間需要常規(guī)進行宮頸細胞篩查。宮頸細胞檢查時采集宮頸黏液，可以采用特殊的方式富集出高純度的滋養(yǎng)層細胞（trophoblast retrieval and isolation from the cervix,TRIC）。TRIC 來自于胎盤，對于胎兒基因組有高度代表性。有研究發(fā)現(xiàn)，通過TRIC，早在妊娠5周即可檢測常見的三體，還可檢測三倍體、缺失、重復、不平衡結構重排、鑲嵌、罕見常染色體三體性、局限性胎盤嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)及單基因疾病等[21]。與cffDNA不同，基于TRIC的檢測還能獲得與胎盤功能和產(chǎn)科并發(fā)癥相關的信息。有研究認為，與胎盤形成相關的妊娠晚期并發(fā)癥會影響TRIC細胞數(shù)，從而可能通過TRIC細胞數(shù)的變化對妊娠晚期并發(fā)癥作出預測。由于TRIC獲得較為容易，同時擁有cffDNA所不包含的信息，因此有可能成為未來NIPT發(fā)展的另一條路徑。

7 結語

NIPT 技術的進化和多元化，如增加測序深度、采用外顯組測序或目標片段捕獲測序方法、利用非cffDNA來源的胎兒信息進行檢測等，都將使得NIPT邁進更好的十年。而這只是胎兒醫(yī)學發(fā)展之一斑，近年興起的宮內(nèi)兒科學錨定的目標是從篩查診斷為主，發(fā)展為篩查、診治并重。產(chǎn)前診斷不再以終止妊娠為目的，開展合適的治療和干預措施、改善預后、挽救胎兒成為了與診斷緊密伴隨的目標。本刊同期組稿的幾篇文章，分別從我國胎兒鏡配置和使用的現(xiàn)狀、重癥胎兒膈疝的宮內(nèi)治療、宮內(nèi)心臟介入手術等多個不同的角度，探討了胎兒疾病的宮內(nèi)治療。未來的圍產(chǎn)醫(yī)學必然更依賴于多學科交叉與協(xié)作，而在此過程中更需不斷發(fā)展新技術，解決臨床問題。如同NIPT在過去十年來所取得的成就一般，在新的十年里，以NIPT為代表的篩查技術，與更多前沿宮內(nèi)治療技術相結合，將能為醫(yī)治胎兒帶來新的希望和可能。