連續(xù)秸稈還田條件下氮肥減施對稻田土壤真菌多樣性的影響

周榆越，焦峰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

我國是農(nóng)業(yè)大國，水稻種植面積達到了26%～28%，水稻產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)的43%～45%[1]。水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)離不開養(yǎng)分，氮素是水稻生長和產(chǎn)量形成的首要因素，我國水稻種植過程施氮量都很高，平均施用水平在150～400 kg·hm-2[2]，各地施氮水平不一。土壤中的氮素主要來自大氣干沉降帶入的氮、化肥和有機肥施用的氮、作物秸稈還田歸還的氮，其中化肥與有機肥中的氮對土壤氮肥綜合影響較大[3]。劉紅江等[4]試驗研究表明，太湖地區(qū)高產(chǎn)稻田當?shù)亓?xí)慣施氮量（360 kg·hm-2）上減氮10%，水稻產(chǎn)量提高1.9%，還能顯著提高氮肥利用率、氮肥偏生產(chǎn)率。顏雙雙[5]研究發(fā)現(xiàn)，在降低氮肥施用的同時，通過秸稈還田可改善土壤理化性質(zhì)、促進作物增產(chǎn)、增加土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量。Hong 等[6]研究表明，施用尿素處理下的秸稈還田土壤溶液中溶解性有機氮具有較好的微生物降解特性，降解后成為植物重要的吸收氮源[7]，能夠增加水稻土壤中微生物活性[8]，提高土壤微生物氮含量[9]，改變農(nóng)田土壤真菌多樣性[10]。袁嫚嫚等[11]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田條件下，作物養(yǎng)分積累量可以通過調(diào)控氮肥用量與增施磷鉀肥取得顯著提高。

土壤微生物在維持農(nóng)田土壤健康、生產(chǎn)力及其可持續(xù)性等方面具有非常重要的作用，它既是土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動力，又可作為土壤中植物有效養(yǎng)分的儲備庫[12]。真菌是土壤微生物的重要組成，直接影響土壤有機質(zhì)循環(huán)、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、有毒物質(zhì)降解和作物病害發(fā)生等[13-15]，是土壤肥力和健康的重要指標之一[16]。吳秀紅等[17]在水稻秧盤育秧接種不同濃度真菌后發(fā)現(xiàn)，接種真菌的水稻根數(shù)顯著高于對照組。真菌數(shù)量雖不如細菌和放線菌多，但對秸稈腐蝕分解有著重要的影響，目前秸稈還田對土壤微生物影響的報道較多，但國內(nèi)外關(guān)于長期連續(xù)多年秸稈還田條件下氮肥減施，真菌群落結(jié)構(gòu)研究甚少[18-19]。試驗基于長期水稻秸稈還田及氮肥減施試驗的基礎(chǔ)上，采用高通量測序技術(shù)方法，探究連續(xù)多年秸稈還田條件下與氮肥減施系統(tǒng)對土壤真菌微生物的影響，以討論稻田秸稈全量還田在改善土壤生態(tài)環(huán)境方面的可行性，為推行秸稈全量還田，實現(xiàn)培肥土壤、藏糧于地提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試品種為龍粳31。

1.2 試驗地概況

試驗設(shè)在黑龍江省建三江管理局前進農(nóng)場科技園區(qū)，試驗用地土壤類型為潛育白漿土，土壤性質(zhì)見表1。小區(qū)總面積為1 050 m2，各小區(qū)長度15 m、寬度10 m。

表1 潛育白漿土基本性質(zhì)Table 1 Basic properties of latent white pulp soil

1.3 試驗設(shè)計

長期定位點開始于2015 年，試驗開始于2021 年，試驗共7 個處理，秸稈還田方式在水稻收獲后，將秸稈碎混翻埋還田，處理方式見表2，常規(guī)（100%）氮肥施用量為150 kg·hm-2；減氮（10%）施用量為135 kg·hm-2；減氮（20%）施用量為120 kg·hm-2；減氮（30%）施用量為105 kg·hm-2。供試氮肥為尿素（N 46%），磷肥為重過磷酸鈣（P2O546%），鉀肥為硫酸鉀（K2O 50%）。各小區(qū)嚴格實行單灌單排，田間管理方式按照水稻常規(guī)生產(chǎn)技術(shù)措施標準統(tǒng)一執(zhí)行。

表2 各處理還田及施肥方式Table 2 Treatment and fertilization methods

1.4 試驗方法

1.4.1 土壤樣品采集

試驗第7 年水稻收獲后，在每個小區(qū)隨機劃分3個1 m2區(qū)域，用土鉆按混合采樣法采集0～20 cm 土層的土壤樣品，去除土樣中動植物殘體等雜質(zhì)，混合均勻后裝入自封袋，編號標記，用于分析土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。

1.4.2 土壤微生物高通量測序

采用PowerSoil DNA 提取試劑盒（美國QIAGEN公司）提取土壤微生物總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量，-20 ℃冰箱保存，供后續(xù)試驗使用。以上述檢測到的DNA 為模板，采用帶有barcode 的特異性引物ITS1-F（5′_GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG_3′）和ITS2-R（5′_GCTGCGTTCTTCATCGATGC_3′）擴增真菌ITS1 區(qū)。采用50 μL 擴增體系：DNA 模板1μL，上游和下游引物各1 μL，2×PCR Premix 25 μL，ddH2O 22 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變形3 min；35 個循環(huán)為95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s；72 ℃終延伸10 min。采用核酸純化試劑盒Agencourt AMPure XP 對PCR 擴增產(chǎn)物進行純化，等量混勻后由北京奧維森基因科技有限公司進行高通量測序。當測序原始數(shù)據(jù)下機之后，首先進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，然后進行序列拼接等程序，得到優(yōu)化序列，OTU聚類及注釋在97%相似度水平進行，從而使分析結(jié)果更加準確、可靠?；诰垲惤Y(jié)果，通過進行Alpha 多樣性分析和Beta 多樣性分析得出各水平分類信息，將樣本組成和群落結(jié)構(gòu)差異進行相關(guān)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 進行基礎(chǔ)柱狀圖的繪制；采用Excel 2016 軟件進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的整理；采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（P＜0.05）；采用聯(lián)川生物云平臺進行LefSe 分析圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈還田條件下氮肥減施對土壤真菌群落高通量測序質(zhì)量分析

21 個樣品測序共獲得2 436 299 對Reads，雙端Reads 序列拼接后共產(chǎn)生2 061 364 條Clean Reads，每個樣品至少產(chǎn)生33 355 條Clean Reads，平均產(chǎn)生98 160 條Clean Reads。通過使用Usearch 軟件對Reads 在97.0%的相似度水平下進行聚類，獲得各處理的OTU 個數(shù)（圖1）。如圖1（A）所示，處理組N0S0、N0S、NS、N1S、N2S、N3S 和對照組NS0的OTU 個數(shù)分別為279、283、257、319、325、331 和319。其中，氮肥減施20%（N2S）處理組和氮肥減施30%（N3S）處理組OTU 個數(shù)高于（NS0）對照組，不施氮不施秸稈（N0S0）、不施氮肥施秸稈（N0S）和施氮肥施秸稈（NS）處理組OTU 個數(shù)低于（NS0）對照組。如圖1（B）所示，各組間共有OTU 個數(shù)為193，無特有OTU 數(shù)。

圖1 樣品OTU 個數(shù)分布圖Fig.1 Distribution of the number of OTU in the sample

真菌等級豐度曲線與稀釋性曲線能夠真實反映土壤真菌群落物種多樣性。如圖2（A）所示，隨物種等級的增大曲線在橫軸的長度逐漸變寬，物種組成豐富；曲線逐漸趨于平緩，物種組成均勻度高。如圖2（B）所示，不同處理組的土壤樣品OTU 個數(shù)隨樣品序列數(shù)的增加而增加，當曲線逐漸趨于平緩，即OTU個數(shù)逐漸趨于飽和，說明到達一定序列數(shù)。綜上可知，此次研究測序數(shù)據(jù)量足夠大，樣品物種豐富度和均勻度較高，測序結(jié)果能夠反映土壤微生物多樣性。

圖2 真菌等級豐度曲線（A），真菌稀釋性曲線（B）Fig.2 Fungal grade abundance curve（A），fungal dilution curve（B）

2.2 秸稈還田條件下氮肥減施對土壤樣品真菌群落Alpha 多樣性的影響

對不同秸稈還田氮肥減施處理的土壤真菌群落進行Alpha 多樣性分析，結(jié)果如圖3 所示。其中，ACE指數(shù)和Chao1 指數(shù)表征微生物群落豐富度；Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)表征微生物群落多樣性。由圖3可知，氮肥減施20%（N2S）處理組樣品ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）、不施氮肥施秸稈（N0S）和施氮肥施秸稈（NS）處理組，氮肥減施30%（N3S）處理組樣品ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）和施氮肥施秸稈（NS）處理組，其他處理間物種豐富度指數(shù)差異不顯著；氮肥減施20%（N2S）處理組Simpson 指數(shù)顯著高于不施氮肥施秸稈（N0S）、氮肥減施10%（N1S）處理組和不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組，Shannon 指數(shù)均顯著高于其他各組。綜上所述，不同處理的土壤樣品Alpha 多樣性存在差異，與對照組相比，氮肥減施20%（N2S）處理可顯著提高土壤真菌群落物種多樣性，物種豐富度雖有提高，但效果不顯著。

圖3 樣品Alpha 多樣性指數(shù)分析圖Fig.3 Sample Alpha diversity index analysis chart

2.3 秸稈還田條件下氮肥減施對土壤樣品真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

圖4 為不同秸稈還田氮肥減施處理對土壤樣品真菌群落門水平和屬水平物種分布圖。21 個土壤樣品共檢測到的真菌分屬于10 門、26 綱、48 目、88 科和125 屬。

圖4 物種相對豐度分布圖Fig.4 Relative abundance of species

由圖4（A）可知，真菌門水平上，各處理中相對豐度均大于1%的優(yōu)勢物種為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被胞霉門（Mortierellomycota）和unclassified_Fungi，相對豐度分別為24.20%～56.48%、20.00%～50.12%、13.91%～40.89%和1.31%～10.88%。對相對豐度前四的優(yōu)勢菌屬分析可知，氮肥減施30%（N3S）處理組中子囊菌門的相對豐度分別顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）23.00%、不施氮肥施秸稈（N0S）29.57%、氮肥減施10%（N1S）處理組32.28%和不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組22.76%；氮肥減施10%（N1S）處理組擔(dān)子菌門相對豐度顯著高于不施氮肥施秸稈（N0S）處理組23.80%，其他處理間差異不顯著；氮肥減施20%（N2S）處理組和氮肥減施30%（N3S）處理組被胞霉門相對豐度分別顯著低于不施氮肥施秸稈（N0S）處理組24.57%和26.98%；氮肥減施20%（N2S）處理組unclassified_Fungi 相對豐度分別顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）5.81%、不施氮肥施秸稈（N0S）7.37%、施氮肥施秸稈（NS）7.90%、氮肥減施10%（N1S）9.57%和不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組8.58%，其他處理間差異不顯著。

由圖4（B）可知，真菌屬水平被孢霉屬（Mortierella）、Solicoccozyma 和unclassified_Fungi 為各處理優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為13.90%～40.88%、3.60%～15.23%和1.31%～10.88%。對相對豐度居于前三的優(yōu)勢菌屬分析可知，不施氮肥施秸稈（N0S）處理組被胞霉屬相對豐度顯著高于氮肥減施20%（N2S）和氮肥減施30%（N3S）處理組24.58%和26.97%，其他處理間差異不顯著；不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組Solicoccozyma 相對豐度分別顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）、施氮肥施秸稈（NS）和氮肥減施10%（N1S）處理組5.54%、7.25%和11.43%；氮肥減施20%（N2S）處理組unclassified_Fungi 相對豐度分別顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）、不施氮肥施秸稈（N0S）、施氮肥施秸稈（NS）、氮肥減施10%（N1S）和不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組5.81%、7.37%、7.90%、9.57%和8.58%，其他處理間差異不顯著。

為進一步明確各處理間在群落物種組成上的差異性，采用PCoA 分析不同秸稈還田氮肥減施處理土壤微生物群落物種組成的相似度。由圖5 可知，細菌群落PC1 和PC2 分別為37.17%和12.47%，兩者累計貢獻率達50.64%。不同秸稈還田氮肥減施處理土壤微生物群落組間差異極顯著（P＜0.01）。其中，NS、N1S、N0S0和N0S 組樣品較聚類，組間差異較??；N2S、NS0和N3S 組樣品較聚類，組間差異較?。坏玁S、N1S、N0S0、N0S 組和N2S、NS0、N3S 組樣品組間差異較大。

圖5 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)PcoA 分析Fig.5 PcoA analysis of soil fungal community structure

2.4 秸稈還田條件下氮肥減施土壤樣品真菌群落LEfSe 分析

不同秸稈還田氮肥減施處理的土壤樣品真菌群落組成和結(jié)構(gòu)存在差異，進一步通過先行判別分析，確定各分類水平上各處理組間具有顯著差異的關(guān)鍵物種及其效益大小。對不同處理的所有樣品進行LEfSe 分析可知（圖6），共有26 種具有顯著差異的物種信息在門、綱、目、科、屬水平上。其中，不施氮肥施秸稈（N0S）處理組有3 種具有顯著差異的物種，分別為阿太菌目、阿太菌科和阿太菌屬；氮肥減施10%（N1S）處理組有4 種具有顯著差異的物種，分別為線黑粉菌目、Piskurozymaceae 科、Solicoccozyma 屬和Lasiosphaeriaceae 科；氮肥減施20%（N2S）處理組有8 種具有顯著差異的物種，分別為unclassified_Fungi 綱、unclassified_Fungi 目、unclassified_Fungi 科、unclassified_Fungi 門、unclassified_Fungi 屬、壺菌門、未分類格孢腔菌屬和未分類格孢腔菌目科；氮肥減施30%（N3S）處理組有4 種具有顯著差異的物種，分別為子囊菌門、錘舌菌科、Helotiales_fam_Incertae_sedis 科和柔膜菌目；不施氮不施秸稈（N0S0）處理組僅有1 種具有顯著差異的物種Triangulaira 屬；不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組有6 種具有顯著差異的物種，分別為粉褶菌科、粉褶菌屬、Echria 屬、unclassified_Boletales 科、unclassified_Boletales 屬和牛肝菌目。

圖6 土壤真菌群落LEfSe 分析Fig.6 LEfSe analysis of soil fungal communities

2.5 秸稈還田條件下氮肥減施土壤樣品功能基因預(yù)測分析

基于FUNGuild 的功能預(yù)測分析表明，未定義腐生菌、木質(zhì)腐生菌、排泄物腐生菌、土壤腐生菌、植物寄生物、植物病原菌、植物腐生菌、內(nèi)生植物、真菌寄生菌和動物病原菌等功能基因相對豐度較高。對相對豐度居于前6 的功能基因進行分析，結(jié)果如圖7所示。與不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組相比，各處理中排泄物腐生菌的相對豐度均增加，而木質(zhì)腐生菌相對豐度除在施氮肥施秸稈（NS）處理組增加外，在其他各組中呈降低趨勢；未定義腐生菌相對豐度在氮肥減施10%（N1S）、氮肥減施20%（N2S）和氮肥減施30%（N3S）處理組中呈增加趨勢，其他各組中呈降低趨勢；土壤腐生菌相對豐度在氮肥減施10%（N1S）、不施氮不施秸稈（N0S0）和氮肥減施30%（N3S）處理組中呈增加趨勢，其他各組中呈降低趨勢；植物寄生物相對豐度在不施氮不施秸稈（N0S0）、氮肥減施10%（N1S）和氮肥減施30%（N3S）處理組中呈增加趨勢，其他各組呈降低趨勢；植物病原菌相對豐度在不施氮肥施秸稈（N0S）和施氮肥施秸稈（NS）處理組中呈增加趨勢，其他各組呈降低趨勢；但這些功能基因相對豐度在各處理間的變化均不顯著。

圖7 土壤樣品功能基因預(yù)測分析Fig.7 Predictive analysis of functional genes in soil samples

3 討論

3.1 秸稈還田條件下氮肥減施對土壤真菌相對豐度影響

土壤微生物是土壤各項生態(tài)功能的重要參與者，土壤微生物的豐度及多樣性可靈敏反映土壤環(huán)境的變化，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，土壤真菌是分解有機物質(zhì)和土壤生物量重要的組成部分[20]。已有大量的研究[21-22]表明，土壤真菌豐度隨著秸稈還田條件下氮肥減施用量的減少而增加，即合理減施氮肥能促進土壤真菌的生長。研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田條件下，被孢霉屬（Mortierella）、Solicoccozyma 和unclassified_Fungi為優(yōu)勢菌屬，不施氮肥施秸稈（N0S）處理組被胞霉屬相對豐度顯著高氮肥減施20%（N2S）和氮肥減施30%（N3S）；不施秸稈，常規(guī)施用氮肥（NS0）Solicoccozyma 相對豐度分別顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）、施氮肥施秸稈（NS）和氮肥減施10%（N1S）；氮肥減施20%（N2S）處理組unclassified_Fungi 相對豐度分別顯著高于不施氮不施秸稈（N0S0）、不施氮肥施秸稈（N0S）、施氮肥施秸稈（NS）、氮肥減施10%（N1S）和不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0），表明減施氮肥能夠提高部分優(yōu)勢菌屬的相對豐度。相關(guān)研究[23]表明，土壤微生物的研究主要集中在20 cm 以上土層中，微生物的生物量會隨著土層深度的增加逐漸下降，故微生物多樣性研究主要集中在20 cm 以上的土壤。研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田條件下氮肥減少施土壤真菌群落物種多樣性顯著高于CK，這與前人研究結(jié)果有所差異。分析研究差異，總結(jié)有兩方面原因，一方面可能是土壤由于秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等有機物的輸入，從而促進了真菌的生長[24]，另一方面秸稈還田增加了土壤穩(wěn)定性，改良了土壤結(jié)構(gòu)，提高了土壤團聚體結(jié)構(gòu)水平，從而為真菌的生長創(chuàng)造了良好的條件[25]。

3.2 秸稈還田條件下氮肥減施對真菌多樣性的影響

多樣性指數(shù)是評價土壤微生物群落豐富度和多樣性的重要指標，ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)表征微生物群落豐富度；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)表征微生物群落多樣性。研究中氮肥減施20%（N2S）、氮肥減施30%（N3S）處理，生物多樣性（ACE、Chao1 指數(shù)）顯著高于不施秸稈，常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組；氮肥減施20%（N2S）處理組Simpson 指數(shù)顯著高于常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組，其余各處理間未與對照達到顯著水平，即長期秸稈還田條件下，減施氮肥對土壤真菌多樣性影響顯著。Peng 等[26]研究表明，秸稈提供的高能碳和營養(yǎng)源會支持微生物生長，增加微生物生物量，秸稈還田會使土壤C/N 升高，因此施用尿素有利于降低土壤中的C/N 比，使土壤中的氮磷鉀元素得到有效補充，有利于增加微生物數(shù)量、提高微生物活力[27]。

3.3 秸稈還田條件下氮肥減施對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

連續(xù)多年秸稈還田條件下氮肥減施可以改變微生物群落結(jié)構(gòu)[10]，但秸稈還田量及氮肥施入量不同對其影響也不同。土壤類型很大程度上決定了土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)，鄭學(xué)博等[28]研究發(fā)現(xiàn)，沼液全氮（30%）處理會顯著改變土壤微生物區(qū)系組成。真菌可以通過產(chǎn)生多種細胞外解聚酶，從而對作物秸稈進行分解。研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田條件下氮肥減施土壤真菌門水平上，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被胞霉門，unclassified_Fung 相對豐度較高，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）作為腐生菌對復(fù)雜化合物分解起到重要作用，能夠有效分解植物殘體和降解秸稈殘留物[29]。氮肥減施30%（N3S）處理組中子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度顯著高于不施秸稈常規(guī)施用氮肥（NS0）對照組；氮肥減施20%（N2S）處理組unclassified_Fungi 相對豐度分別顯著高于對照與其他處理，不同秸稈還田氮肥減施處理土壤微生物群落組間差異極顯著（P＜0.01）。Li 等[30]研究發(fā)現(xiàn)土壤真菌群落多樣性隨腐解時間的增長而顯著提高，Penicillium sp.、Aspergillus sp.和Acremonium sp.是分解水稻秸稈的主要真菌。研究中未定義腐生菌、木質(zhì)腐生菌、排泄物腐生菌、土壤腐生菌、植物寄生物、植物病原菌、植物腐生菌、內(nèi)生植物、真菌寄生菌和動物病原菌等功能基因相對豐度較高，優(yōu)勢菌為未定義腐生菌和土壤腐生菌，在氮肥減施30%群落結(jié)構(gòu)增加較多，這與辛勵等[31]研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

秸稈還田條件下減施氮肥顯著增加真菌OTU 值和真菌群落的多樣性，在土壤真菌門水平上與對照相比較，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被胞霉門，unclassified_Fung；相對豐度較高，未定義腐生菌、木質(zhì)腐生菌、排泄物腐生菌、土壤腐生菌、植物寄生物、植物病原菌、植物腐生菌、內(nèi)生植物、真菌寄生菌和動物病原菌等功能基因相對豐度較高，減施氮肥20%（N2S）與減施氮肥30%（N3S）對增加真菌OTU 值，真菌ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)，增強腐生菌作用尤為顯著。