許晚舟,李海婷,郭珈宜,李峰,于海珍,徐騰婷,周沁,徐豐,黃惠琴

1.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350100; 2.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院,河南 洛陽 471002

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是臨床常見的退行性疾病[1],以關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥、軟骨下骨改變、半月板損傷等為主要病理變化,以疼痛、腫脹、僵硬和功能障礙為主要臨床表現(xiàn)[2],部分患者可出現(xiàn)持續(xù)性或嚴重關(guān)節(jié)腫脹[3]。KOA多呈慢性漸進性發(fā)展[4],隨著時間的推移,由于膝關(guān)節(jié)的軟骨不斷被破壞,滑膜增生情況加重,最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)無法完全伸展、關(guān)節(jié)僵硬甚至膝關(guān)節(jié)畸形,嚴重影響患者生活質(zhì)量。

1 細胞焦亡

細胞焦亡是一種細胞程序性死亡方式,細胞焦亡過程即細胞形態(tài)膨脹變形、細胞膜破裂,細胞內(nèi)容物釋放激活炎癥因子引發(fā)強烈的炎癥反應(yīng)[5],同時伴有染色體脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid,DNA)的斷裂。一般情況下,細胞焦亡屬于一種機體的自我保護機制,是一種自身的免疫反應(yīng),外來致病因素侵襲時,適量細胞焦亡可激發(fā)機體免疫機制,利于清除外因;而過度的細胞焦亡則會使炎癥反應(yīng)加重,不斷釋放的炎性因子,可導(dǎo)致激烈的炎性反應(yīng),造成細胞組織壞死,出現(xiàn)全身性炎性反應(yīng),如發(fā)熱、休克等嚴重情況[6]。

1.1 細胞焦亡的機制與途徑當發(fā)生細胞焦亡時,細胞膜內(nèi)外的離子失衡,導(dǎo)致細胞內(nèi)外出現(xiàn)滲透壓,焦亡的細胞在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細胞膜表面形成了10～15 nm的孔洞,細胞外液快速進入細胞內(nèi),引起細胞膨脹,焦亡的細胞核與凋亡的細胞核不同,其維持了核膜與核仁的完整性[7],它是一種由半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)激活的細胞死亡形式[8]。細胞焦亡包括經(jīng)典和非經(jīng)典兩種途徑[9],其中經(jīng)典途徑包括病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)與損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),前者有病菌感染、DNA損傷等誘導(dǎo)所致,后者由蛋白質(zhì)、植入物碎片誘導(dǎo)所致。

經(jīng)典模式的途徑依賴于caspase-1[10],當機體受到外因不良刺激后,NOD樣受體(nucleotidebinding oligomerization domain like receptors,NLR)或煙堿型受體2(nicotinic receptor2,NR2)被激活,從而直接激活了caspase-1,它一方面切割了Gasdermin(GSDM)家族蛋白,形成有活性的多肽蛋白,該蛋白轉(zhuǎn)移至細胞膜上,對其造成空洞樣破壞,還會導(dǎo)致K+的外流,間接誘導(dǎo)了含Pyrin結(jié)構(gòu)域3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎癥小體的聚合[11];另一方面caspase-1會對炎癥因子IL-1β、白細胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的前體進行切割,使其具有活性,從而釋放引起炎癥引發(fā)焦亡。

非經(jīng)典模式的途徑[12]依賴于caspase-4/caspase-5/caspase-11,當機體受到外界病原菌的感染后,激活caspase-4/caspase-5/caspase-11蛋白(在人源的細胞里激活的是caspase-4/caspase-5,屬源的細胞里激活的是caspase-11),一方面對 GSDMB 進行切割,形成多肽蛋白,破壞細胞膜;另一方面,在切割GSDMD的N端形成的活性多肽蛋白又可以激活NLRP3炎癥小體,再次激活caspase-1,又能對炎癥因子IL-1β、IL-18的前體進行切割,使其具有活性,釋放至細胞膜外引起炎癥引發(fā)焦亡[13]。

1.2 炎癥與細胞焦亡的關(guān)系根據(jù)細胞焦亡的機制和途徑,caspase-1/caspase-4/caspase-5/caspase-11、炎癥小體以及膜孔蛋白GSDM都與細胞焦亡引發(fā)炎癥有關(guān)。

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)屬于半胱氨酸蛋白酶,對細胞程序性死亡的調(diào)控起到了重要意義[14]。其中caspase-1是細胞應(yīng)對炎癥的關(guān)鍵[15],有活性的caspase-1可以水解蛋白,包括白細胞介素-1β前體(pro-IL-1β)和白細胞介 素-18 前體(pro-IL-18)。外界因素和內(nèi)源性介質(zhì)都會激活caspase-1啟動免疫應(yīng)答對抗炎癥,但是過度的激活則會導(dǎo)致免疫炎癥性疾病的發(fā)生。有研究表明,caspase-1抑制劑能有效抑制其活性,阻斷炎癥反應(yīng)的進程[16]。

炎癥小體由上游感受器蛋白組成,分為NLR家族和AIM2兩類,其包括刺激感受器模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)、ASC和下游的caspase-1蛋白組成的蛋白復(fù)合物[17]。NLRP3是目前臨床研究最為透徹的一種炎癥小體[18],當啟動 NLRP3 炎癥小體之后,NLRP3方可廣泛被激活,如三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)、離子通量、線粒體功能障礙等。在致病因素的刺激下,對其激活可以起到保護細胞的作用;但在非致病因素的刺激下,可誘導(dǎo)線粒體失衡、NLRP3去泛素化、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD,ASC)線性泛素化。NLRP3的泛素化[19]可以防治炎癥性疾病,其中起到負性調(diào)控的E3泛素連接酶可將NLRP3失活,減少感染的風(fēng)險。

膜孔蛋白GSDM[20]是細胞焦亡過程的效應(yīng)蛋白,其主要依賴于經(jīng)典模式中的caspase-1和非經(jīng)典模式中的caspase-4/caspase-5/caspase-11,激活后切割GSDM家族蛋白有活性的N端,使其對細胞膜形成孔道,從而釋放IL-1β和IL-18,募集更多的炎癥細胞,使得炎癥反應(yīng)進一步加劇。GSDMD被廣泛研究[21],其N端不僅可以參與感染過程直接殺死游離細菌,還起到警報作用,募集免疫細胞消除病原體并誘發(fā)病理性炎癥。

2 細胞焦亡與KOA

KOA的主要病理機制為軟骨受損分解、軟骨細胞死亡等[22],研究發(fā)現(xiàn)基因表達錯誤是引起軟骨細胞非正常死亡的原因[23];當軟骨細胞受到不良刺激時,早期細胞炎性反應(yīng)可以幫助清除不利因素,如果炎性反應(yīng)激烈,則可能導(dǎo)致代償調(diào)節(jié)失衡出現(xiàn)細胞死亡,軟骨組織破壞等現(xiàn)象[24];軟骨組織損傷可引起松質(zhì)骨丟失,軟骨下皮質(zhì)骨板變薄,病變持續(xù)發(fā)展,軟骨下皮質(zhì)骨板逐漸增厚,鈣化軟骨不斷侵襲關(guān)節(jié)軟骨向前礦化,從而使關(guān)節(jié)軟骨越來越薄,同時伴有蛋白聚糖的丟失和纖維震顫,晚期表現(xiàn)為極薄的關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下硬化[25]。

2.1 NLRP3、AIM2與膝關(guān)節(jié)炎非免疫源性的軟骨細胞也可導(dǎo)致細胞焦亡。KOA中脆薄的軟骨細胞不斷受到機械刺激后可通過線粒體損傷等途徑產(chǎn)生DAMPs,從而激活NLRP3炎癥小體,而線粒體死亡出現(xiàn)的氧化線粒體DNA以及融合蛋白對NLRP3的上調(diào)都會誘導(dǎo)軟骨細胞的炎性死亡[26]。有研究證實,NLRP3參與羥基磷灰石誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)滑膜炎的產(chǎn)生[27],其作為IL-1β的上游激活蛋白,在IL-1β刺激這些通路的激活過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,參與了多種炎癥通路,如核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(nuclear factor-κB,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、 磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路。同時,NLRP3被激活后,分泌基質(zhì)金屬蛋白酶3和基質(zhì)金屬蛋白酶13,降解軟骨基質(zhì),引發(fā)軟骨損傷,被破壞的軟骨細胞又可再次導(dǎo)致細胞焦亡,形成惡性循環(huán)導(dǎo)致組織損傷,病情加重。通過對機制的解讀,針對KOA可以采取對NLRP3的調(diào)控,抑制軟骨細胞的焦亡,從而在達到控制炎癥的基礎(chǔ)上,選擇增加軟骨細胞活性的藥物[28],延緩KOA的退變進程,為臨床治療KOA提供思路。

此外,E3泛素連接酶作為泛素化正性、負性調(diào)節(jié)因子,通過靶向?qū)ρ装Y小體進行調(diào)控[29]。在負性調(diào)節(jié)中,多巴胺受體D1可通過其誘導(dǎo)NLRP3的泛素化,抑制炎癥小體被激活,對于KOA中可以減輕軟骨組織的降解,改善軟骨損傷;在正性調(diào)節(jié)中,例如血漿E3泛素連接酶-2(Pellino-2)在NLRP3的負性泛素化調(diào)控中可能出現(xiàn)兩種不同的情況[30],細菌中的細胞壁成分促使NLRP3與Pellino-2聯(lián)合產(chǎn)生聚泛素化現(xiàn)象,從而激活炎癥小體。同時,Pellino-2泛素化出現(xiàn)的IRAK1的泛素化則會起到抑制NLRP3炎癥釋放的作用[31]。對NLRP3中E3泛素連接酶的把控,做到在控制膝關(guān)節(jié)炎癥的同時,減少過度免疫抑制引發(fā)臨床感染的風(fēng)險。

在正常情況下,AIM2在免疫細胞中極少表達,但當機體因環(huán)境因素或感染時,AIM2通過下游的ASC銜接蛋白,激活caspase-1,切割了炎癥因子IL-1β、IL-18釋放于細胞外誘發(fā)炎癥[32]。短期的炎癥誘發(fā)是機體的自我保護行為,能有效控制炎癥的進展,但長期慢性炎性刺激或強烈炎性反應(yīng)可引起組織嚴重病理變化。在DNA激活A(yù)IM2炎性小體引發(fā)的內(nèi)皮細胞焦亡的小鼠實驗中[33],DNA可以刺激內(nèi)皮細胞AIM2的活化,故得出AIM2的表達離不開配體DNA的參與;同時ASC作為其傳導(dǎo)的一部分也是不可或缺的。通過對潛在抑制劑的挖掘[34],發(fā)現(xiàn)了一種新的人類干擾素γ誘導(dǎo)蛋白16(recombinant interferon gamma inducible protein 16,IFI16)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體IFI16-β在與AIM2的相互作用下能有效阻止AIM2-ASC的結(jié)合。此外還發(fā)現(xiàn)了一些能夠阻斷AIM2炎癥小體的藥物,如RGFP966、穿心蓮內(nèi)酯、EFLA945(一種水溶性紅葡萄藤葉提取物)等。在膝關(guān)節(jié)炎癥的控制方面,對于DNA-AIM2與AIM2-ASC兩種信號通路阻斷劑的研究也是未來需要深挖的一大重點。

2.2 IL-1β與KOAIL-1β是退行性關(guān)節(jié)病變的代謝調(diào)節(jié)因子[35],可誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)降解酶類基因表達,刺激成纖維細胞、軟骨細胞等分泌多種炎癥介質(zhì),使軟骨損傷加重膝關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)[36]。有研究顯示,caspase-1在骨關(guān)節(jié)炎中較caspase-3/9明顯升高[37],其轉(zhuǎn)化的IL-1β也隨之升高,被證實在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起到關(guān)鍵作用[38]。IL-1β 由活化的巨噬細胞產(chǎn)生,與KOA的疼痛、腫脹密切相關(guān),關(guān)節(jié)腔液體中的IL-1β含量越高,說明炎癥程度越重[39]。同時,IL-1β能誘導(dǎo)軟骨細胞和滑膜細胞的自分泌,促進軟骨及滑膜組織蛋白金屬酶、輔助B細胞生長、誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞黏附因子的表達,還會刺激滑膜細胞釋放前列腺素E2,使血管充血擴張滲出,促進滑膜細胞黏附因子的釋放,溶解周圍骨組織,抑制軟骨細胞膠原蛋白的產(chǎn)生,引發(fā)炎癥與骨吸收造成關(guān)節(jié)破壞[40]。除此之外,KOA患者關(guān)節(jié)滑液中IL-1β的含量明顯升高,其存在于膝關(guān)節(jié)的軟骨細胞,具有高度的敏感性,長期大量產(chǎn)生抑制合成因子(如蛋白聚糖和Ⅱ型膠原)的表達[41],破壞軟骨組織的穩(wěn)定,組織破壞后會再次產(chǎn)生炎癥刺激,又會增加IL-1β的表達,如不及時控制,則會出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的損壞、關(guān)節(jié)疼痛腫脹,嚴重時會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)運動障礙,影響患者的日常生活能力。

2.3 ASC與KOA關(guān)于組成蛋白復(fù)合物之一的ASC不僅參與炎癥激活還在細胞之間起到聯(lián)絡(luò)作用[42]。其中一個結(jié)構(gòu)完整的亞型ASC-b,兩者都能夠與NLRP3和下游的caspase-1結(jié)合促進 IL-1β 的分泌,但ASC-b相比ASC多出了部分鉸鏈區(qū)[43],能夠為NLPR3提供炎性體平臺。兩者均具有完整的Pyrin結(jié)構(gòu)域(pyrin domain,PYD)和caspase募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)[44],共同表達增加了更多炎癥因子的釋放,還會激活無菌性炎癥的級聯(lián)并不斷放大激活。當KOA急性發(fā)作時,外周血液中會產(chǎn)生高表達的ASC和ASC-b參與了下游炎癥反應(yīng),使骨破壞因子不斷上升,產(chǎn)生劇烈的炎癥反應(yīng),同時導(dǎo)致患者產(chǎn)生局部關(guān)節(jié)腫痛,表達成骨細胞重組人血管生成素樣蛋白4(recombinant human angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4)促進破骨細胞的增殖和骨基質(zhì)降解卻抑制了成骨細胞,與炎癥相關(guān)的骨破壞因子異常分泌,最終導(dǎo)致了骨質(zhì)的破壞。

在細胞焦亡激活的過程中,上述蛋白和細胞因子均有參與炎癥因子的表達,但彼此之間存在差異,各個因子導(dǎo)致KOA的具體作用機制仍需進一步探討。

3 中醫(yī)藥調(diào)控細胞焦亡在膝關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用

KOA是臨床常見的退行性疾病,其主要病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨退變、關(guān)節(jié)周圍骨贅形成、關(guān)節(jié)軟骨下骨質(zhì)硬化及滑膜炎性增生。中醫(yī)認為,KOA屬于“痹證”的范疇,與風(fēng)、寒、濕、熱等外邪侵襲人體,導(dǎo)致氣血運行不暢、經(jīng)絡(luò)痹阻有關(guān)[45]。中醫(yī)藥在膝關(guān)節(jié)病防治中發(fā)揮重要作用,研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可以調(diào)控細胞焦亡保護膝關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織,但調(diào)控機制的臨床干預(yù)或中醫(yī)藥機制探討有待進一步深入。

謝芳等[46]采用改良Hulth造模法建立大鼠膝關(guān)節(jié)炎模型,給予活膝湯灌胃4周后發(fā)現(xiàn),活膝湯可以通過降低CC趨化因子受體2型(CC chemokine receptor 2,CCR2)、趨化因子配體2(CCL2)、p-p65、caspase-1的表達水平,起到補益肝腎、除濕散寒、活血通絡(luò)的功效,從而抑制軟骨細胞焦亡,減緩大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的退變。王甜甜[47]通過構(gòu)建外傷性KOA大鼠模型研究艾灸干預(yù)對大鼠膝骨關(guān)節(jié)的影響,發(fā)現(xiàn)艾灸可以通過下調(diào)p38MAPK信號通路,對NLRP3炎性小體介導(dǎo)的大鼠軟骨細胞焦亡產(chǎn)生抑制效果,減少軟骨細胞外基質(zhì)的降解,從而起到疏經(jīng)通絡(luò)、調(diào)理氣血,保護軟骨細胞的作用。何花等[48]采用Hulth法建立KOA大鼠模型,通過28 d的灌胃后發(fā)現(xiàn),丹紫康膝沖劑通過對kappa B抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)/核因子κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)/NF-κB信號通路活化的抑制,可以減少大鼠關(guān)節(jié)軟骨炎性因子的表達,減輕軟骨的病理性損傷,并且在安全劑量下丹紫康膝沖劑的用量與效果呈正相關(guān)。林晴等[49]通過藥物干預(yù)二代軟骨細胞發(fā)現(xiàn),榮筋拈痛方中的補肝腎強筋骨藥物與祛風(fēng)濕止痹痛藥物,分別有刺激關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖合成和抗炎鎮(zhèn)痛的作用,可以抑制炎癥因子表達保護軟骨,調(diào)控軟骨細胞 NLRP3/caspase-1/GSDMD途徑來降低細胞焦亡引起的炎癥反應(yīng)。蔡猛等[50]采用Hulth法建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型,藥物干預(yù)8周后,觀察各實驗室指標發(fā)現(xiàn)三七總皂苷中的PNS來源于三七的根莖和根部,具有消腫止痛、散瘀止血等功效,其可能通過抑制TLR4/NLRP3/caspase-1信號通路,降低大鼠軟骨細胞焦亡。金靈璐等[51]采用改良Hulth造模法建立大鼠KOA模型,藥物干預(yù)8周后發(fā)現(xiàn),烏頭湯功擅溫陽通絡(luò)、宣痹止痛,可以通過抑制大鼠軟骨caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β的相關(guān)表達,抑制大鼠軟骨細胞焦亡,改善軟骨退變。

從上述研究可以看出,中醫(yī)藥對于細胞焦亡的研究還處于基礎(chǔ)動物實驗方面。從這些實驗中可以發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥主要通過調(diào)控caspase-1、NLRP3、NF-κB、IL-18、IL-1β等相關(guān)表達來抑制KOA的細胞焦亡。中醫(yī)藥調(diào)控細胞焦亡在KOA的研究方面,以中藥復(fù)方實驗多見,中藥單體及中藥活性成分的研究較少,針灸、手法等方面的研究也相對薄弱。

4 討論

目前,細胞焦亡仍然是被持續(xù)關(guān)注的研究話題,它是調(diào)節(jié)細胞炎癥免疫機制的保護性過程。本文探討導(dǎo)致KOA最主要的三大因素:炎癥小體NLRP3和AIM2、炎癥因子IL-1β以及ASC,雖然已有部分研究表示KOA與細胞焦亡存在一定的關(guān)聯(lián),對細胞焦亡的通路進行干預(yù)可阻斷炎癥進展,如抑制TLR4/NLRP3/caspase-1信號通路、抑制IKK/IκB/NF-κB信號通路、下調(diào)p38MAPK信號通路等,但是這些研究對于調(diào)控度量的把控仍然沒有一個具體的結(jié)果。

細胞焦亡在靶向藥物的研究中有了一定的進展,但針對KOA類別的相關(guān)研究均處于動物實驗階段,對改善炎癥反應(yīng)的途徑尚不明確。在能夠保證“骨穩(wěn)態(tài)”的基礎(chǔ)上,相對溫和有效地采用中醫(yī)藥調(diào)控方式延緩KOA的疾病進展,從中醫(yī)學(xué)氣血、經(jīng)絡(luò)的理論探討調(diào)控細胞焦亡的作用機制。因此,今后的研究需要攻破細胞焦亡在其他分子機制上的作用,同時基于中醫(yī)藥調(diào)控方面的基礎(chǔ)動物實驗需進一步深入研究并積極探討KOA的預(yù)防和治療,為KOA的臨床診治提供新的思路和方案。