麥爾哈巴·麥麥提艾力, 許少全, 李 婧, 劉 輝, 周 潤, 夏衣旦木·吐尼牙孜,趙金龍, 呂國棟,,3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 烏魯木齊 830017; 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院;3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室, 烏魯木齊 830054)

對乙酰氨基酚(Acetaminophen, APAP)是一類非甾體類抗炎藥,具有鎮(zhèn)痛、解熱的功效,于20世紀(jì)50年代被批準(zhǔn)用于臨床,可用于緩解感冒引起的高熱以及緩解輕至中度的疼痛癥狀[1],是全球新冠疫情大流行環(huán)境中最為常用的藥物之一[2]。APAP在推薦劑量下是安全有效的,但長期或過量使用對乙酰氨基酚會引發(fā)肝損傷,導(dǎo)致肝功能衰竭,更嚴(yán)重的會導(dǎo)致死亡[3-4]。毛果蕓香堿是毒蕈堿乙酰膽堿受體m3(Muscarinic acetylcholine receptor m3, m3AchR)激動劑,其能通過直接結(jié)合和激活毒蕈堿受體發(fā)揮作用[5]。研究發(fā)現(xiàn),毛果蕓香堿通過激活m3AchR對CCl4及偶氮甲烷所致的小鼠肝損傷具有保護作用[6]。Khurana等[7]報道,在偶氮甲烷所致小鼠肝損傷模型中,毛果蕓香堿能通過激活m3AchR-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases1/2, ERK1/2)信號通路來促進細(xì)胞增殖,以減輕肝損傷。Kajiya等[8]研究報道,表皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor, EGFR)反式激活連接m3AchR,啟動下游的信號通路,如RAS/MAPK和PI3K/AKT等,參與細(xì)胞的增殖、遷移和存活等過程。在多種組織損傷和修復(fù)過程中,ERK1/2信號通路的激活對于肝細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,當(dāng)ERK1/2信號通路激活后,發(fā)生核轉(zhuǎn)位,并通過影響轉(zhuǎn)錄因子的活性,調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá),從而促進肝細(xì)胞增殖[9]。本研究通過建立APAP肝損傷小鼠模型,探究毛果蕓香堿減輕對乙酰氨基酚所致肝損傷的藥效及作用機制,現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 18只C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,8～10周齡,體重18～20 g。小鼠在新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心IVC屏障環(huán)境中飼養(yǎng),自由攝取食物和水。

1.1.2 試藥 對乙酰氨基酚(美國MedChemExpress公司, HY-66005);毛果蕓香堿(美國MedChemExpress公司, HY-B0726);Anti-GAPDH抗體(英國Abcam公司, ab181602);ERK1/2抗體(美國CST公司, 4695)、p-ERK1/2抗體(美國CST公司, 4370S)、PCNA抗體(美國CST公司, 13110)。

1.2 分組及給藥實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,按照隨機分配原則將18只C57BL/6小鼠分為空白對照組、APAP模型組、毛果蕓香堿組,每組6只。毛果蕓香堿組小鼠腹腔注射毛果蕓香堿(2.5 mg/kg體重)7 d[7,10],空白對照組和APAP模型組注射等量生理鹽水,第7天3組小鼠禁食不禁水過夜24 h,末次給藥毛果蕓香堿1 h后,毛果蕓香堿組及APAP模型組腹腔注射APAP(400 mg/kg體重),空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。APAP注射12 h后處死所有小鼠,采集血液和肝臟等組織樣本。在生理鹽水中沖洗肝臟,并在4%多聚甲醛中固定,一部分在液氮中快速冷凍,備用。

1.3 血清生化指標(biāo)、肝臟病理、PCNA、ERK1/2蛋白水平的測定

1.3.1 肝臟病理染色 將3組小鼠處死后,采集肝臟組織置于4%多聚甲醛中固定,48 h后取出,經(jīng)梯度乙醇和二甲苯脫水透明后,用石蠟包埋,將蠟塊經(jīng)手動切片機切成4 μm厚度,連續(xù)切片,將切片放入60℃烤箱過夜后取出,用二甲苯脫蠟,蘇木素及伊紅進行染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.2 血清AST、ALT水平的測定 空白對照組、APAP模型組、毛果蕓香堿組小鼠在處死前,使用一次性注射器對小鼠心臟采血0.7 mL,室溫放置30 min后,3 000 r/min低溫離心30 min分離血清,采用邁瑞B(yǎng)S-240Y血清生化檢測儀檢測各組小鼠血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase, AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase, ALT)的水平。

1.3.3 肝臟PCNA、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平的測定 3組小鼠各取3例肝臟樣本,稱取20～30 mg肝臟組織,加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液后用研磨儀對肝臟組織進行研磨打碎,在冰上靜置30 min使組織裂解充分,12 000 r/min離心15 min,取上清液,采用BCA法對提取的總蛋白進行定量后,加入上樣緩沖液在100℃煮蛋白10 min,使蛋白變性。將蛋白上樣于制備好的SDS-PAGE膠,電泳完成后電轉(zhuǎn)至 PVDF膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h后,分別加入稀釋后的一抗溶液,GAPDH(1∶10 000),ERK1/2(1∶1 000),p-ERK1/2(1∶2 000),PCNA(1∶1 000),在4℃冰箱孵育過夜。次日經(jīng)TBST洗膜3次,加入相應(yīng)二抗(稀釋比例為1∶5 000)室溫孵育1 h后,加入ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒進行顯影拍照。使用Image J軟件對條帶灰度值進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肝臟病理變化的比較HE染色病理學(xué)結(jié)果顯示,空白對照組肝細(xì)胞索排列規(guī)整,肝細(xì)胞大小無異常,如圖1A所示;APAP模型組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常,白色箭頭指向區(qū)域出現(xiàn)肝小葉中心壞死、肝內(nèi)出血和細(xì)胞核消失或固縮,如圖1B所示;毛果蕓香堿組APAP誘導(dǎo)的小鼠肝毒性減少,白色箭頭指向表示,與APAP模型組比較,肝內(nèi)出血、核固縮和肝細(xì)胞死亡減少,如圖1C所示。

(注: A為空白對照組; B為APAP模型組; C為毛果蕓香堿組。)

2.2 各組小鼠血清ALT和AST水平的比較與空白對照組比較,APAP模型組小鼠血清ALT和AST水平均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與APAP模型組比較,毛果蕓香堿組小鼠血清AST水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。

表1 各組小鼠血清ALT和AST水平的比較

2.3 各組小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)水平的比較與空白對照組比較,APAP模型組小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),毛果蕓香堿組小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與APAP模型組比較,毛果蕓香堿組小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表2、圖2。

表2 各組小鼠肝臟PCNA蛋白表達(dá)水平的比較

圖2 各組小鼠肝臟PCNA蛋白電泳圖

2.4 各組小鼠肝臟ERK和p-ERK蛋白表達(dá)水平的比較與空白對照組比較,APAP模型組小鼠肝臟p-ERK/ERK蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),毛果蕓香堿組小鼠肝臟p-ERK/ERK蛋白水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與APAP模型組比較,毛果蕓香堿組小鼠肝臟p-ERK/ERK蛋白水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表3、圖3。

表3 各組小鼠肝臟ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的比較

圖3 各組小鼠肝臟ERK和p-ERK蛋白電泳圖

3 討論

APAP作為常用的退熱鎮(zhèn)痛藥,多用于治療病毒感染患者, APAP中毒是導(dǎo)致藥物性肝損傷的主要原因[11]。本研究發(fā)現(xiàn)毛果蕓香堿能夠減輕APAP中毒小鼠的肝細(xì)胞損傷,促進APAP致肝損傷小鼠的肝細(xì)胞增殖,這種肝細(xì)胞增殖現(xiàn)象是毛果蕓香堿激活m3AchR-ERK1/2信號通路來調(diào)控的。

本研究通過檢測 APAP所致肝損傷小鼠血清肝功水平和肝臟病理發(fā)現(xiàn),毛果蕓香堿降低了小鼠血清中AST水平,顯著改善了小鼠肝臟的病理結(jié)構(gòu),表明毛果蕓香堿可減輕APAP肝臟損傷。在偶氮甲烷所致小鼠肝損傷模型中,毛果蕓香堿減輕了肝纖維化和膠原沉積,減少肝細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激,同時增加了肝細(xì)胞增殖[7]。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn),毛果蕓香堿減輕了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞AML12損傷并促進AML12增殖,同時減輕了CCl4所致小鼠的肝臟損傷程度。毛果蕓香堿與卡巴膽堿聯(lián)合治療可顯著減少肝臟脂質(zhì)積聚,對脂肪性肝病具有保護作用[12]。有研究報道,毛果蕓香堿通過改善迷走神經(jīng)重構(gòu)來緩解心肌梗死癥狀[13],提示毛果蕓香堿不僅在APAP致肝損傷具有促進組織修復(fù)作用,還可以促進化學(xué)性肝損傷和脂肪性肝病的組織修復(fù),減輕其他臟器損傷。

毛果蕓香堿是m3AchR激動劑,通過激活M膽堿受體發(fā)揮作用。m3AchR是組織損傷修復(fù)中的熱門靶點,是膽堿能神經(jīng)信號傳遞的重要成員,活化后介導(dǎo)多種細(xì)胞反應(yīng),具有調(diào)控胰島素分泌、鈣離子調(diào)節(jié)和器官發(fā)育和再生等功能[14]。膽堿能神經(jīng)元參與調(diào)節(jié)肝損傷,m3AchR的激活可以調(diào)節(jié)肝細(xì)胞功能[15]。有研究報道,m3AchR基因敲除使偶氮甲烷誘導(dǎo)的小鼠肝損傷嚴(yán)重加劇[7],表明選擇性激活m3AchR可以預(yù)防或減少肝損傷,提示m3AchR是APAP致肝損傷的藥物靶點。

本研究中發(fā)現(xiàn)毛果蕓香堿可激活p-ERK信號通路,促進肝細(xì)胞增殖。p-ERK信號通路激活后可以直接或間接地通過調(diào)節(jié)PCNA蛋白水平來影響DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖,促進APAP所致肝損傷小鼠肝細(xì)胞的增殖。肝臟再生能力減弱會加速APAP過量后肝細(xì)胞的損傷和死亡,因此增強APAP所致肝損傷后的肝臟再生極為關(guān)鍵[16]。Khurana等發(fā)現(xiàn),毛果蕓香堿活化m3AchR進而激活p-ERK信號通路促進肝細(xì)胞增殖[7]。同時對偶氮甲烷所致肝損傷有保護作用,表明激活m3AchR可以通過涉及絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族的途徑改變基因轉(zhuǎn)錄[17]。ERK是MAPK家族關(guān)鍵成員,MAPK/ERK作為目前最經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,可將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi),引起細(xì)胞增殖、分化等一系列生物學(xué)反應(yīng)[18]。PCNA在細(xì)胞周期的G1期和S期晚期合成,并與細(xì)胞增殖狀態(tài)相關(guān),PCNA在多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用,如DNA復(fù)制和修復(fù)、染色質(zhì)重塑、染色體分離和細(xì)胞周期進展[19]。PCNA在DNA復(fù)制中起到關(guān)鍵的作用,被認(rèn)為是最典型的細(xì)胞增殖標(biāo)記物[20]。提示毛果蕓香堿通過ERK信號通路發(fā)揮促APAP肝損傷中肝細(xì)胞的增殖作用。

綜上所述,本研究表明毛果蕓香堿通過激活m3AchR-ERK信號通路促進APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷后肝細(xì)胞的增殖,減輕APAP所致肝損傷,為研發(fā)新型治療APAP所致肝損傷的潛在藥物奠定了研究基礎(chǔ)。