林雨昕, 柏如海, 陳昳璠, 吳榮謙, 王海容, 杜肇清1,

(1陜西人民醫(yī)院肝膽外科, 西安 710068; 2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 上海 200025; 3南京理工大學(xué)公共關(guān)系學(xué)院, 南京 210094;4北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 北京 100191; 5西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精準外科與再生醫(yī)學(xué)國家地方聯(lián)合工程研究中心, 西安 710061;6西安交通大學(xué)精密工程研究所, 西安 710049)

他克莫司(Tacrolimus)是一種廣泛應(yīng)用于臨床器官移植術(shù)后的免疫抑制劑,由于治療窗較窄,藥物濃度個體差異較大,藥物副作用大,如腎功能損害、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及胃腸道反應(yīng)等,因此對其血藥濃度的監(jiān)測非常重要[1]。目前臨床對患者他克莫司血藥濃度監(jiān)測的方法為免疫分析法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。免疫分析法包括:化學(xué)發(fā)光酶免疫測定(CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫測定(ECLIA)、親和柱介導(dǎo)免疫測定(ACMIA)、酶擴大免疫測定技術(shù)(EMIT)、Dimension TAC測定和V-twin系統(tǒng)等[2-3]。但這些方法定量分析步驟復(fù)雜,操作困難。LC-MS/MS法作為他克莫司檢測的金標準,由于技術(shù)要求高、檢測成本昂貴、需要多步驟預(yù)處理等,在臨床中無法廣泛應(yīng)用[4]。表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced raman spectroscopy,SERS)具有分子指紋識別、檢測成本低、檢測方法便捷等優(yōu)勢,近年來在臨床化療藥物及免疫抑制劑血藥濃度監(jiān)測中被廣泛研究。本研究建立基于第五代KlariteTM芯片SERS快速檢測生理溶劑及血清溶液中他克莫司藥物濃度的方法,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑他克莫司膠囊(安斯泰來制藥有限公司,H20130235,0.5 mg);丙酮(意大利Sigma Aldrichgong公司);磷酸鹽緩沖(PBS)溶液(意大利Sigma Aldrich公司,pH 7.4);牛血清(BSA)白蛋白(武漢谷歌生物公司,36101ES25,25 g);人血清白蛋白標準溶液(武漢谷歌生物公司,S24985,10 mL)。

1.2 芯片鍍金的第五代SERSKlariteTM芯片(英國Mesophotonics 有限公司),芯片參數(shù):節(jié)距長度1 250 nm,凹坑尺寸1 000 nm,矩形縱橫比1∶1.2,聚甲基丙烯酸甲酯塑料基底厚度0.5 mm,尺寸8 mm×8 mm,表面沉積金厚度400 nm,標準角度25°。

1.3 溶液的配置

1.3.1 他克莫司丙酮溶液和水溶液的配置 取他克莫司粉末,加入丙酮溶液,配置成濃度為50 μg/mL的他克莫司丙酮溶液。取0.5 mg他克莫司粉末溶解在0.2 mL甲醇中,用蒸餾水定容至10 mL,得到初始濃度為50 μg/mL的他克莫司水溶液,按比例配置成濃度分別為0.1、0.6、1.2、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0和50.0 μg/mL的他克莫司標準溶液,備用。

1.3.2 他克莫司PBS溶液的配置 取0.5 mg他克莫司粉末溶解在0.2 mL甲醇中,用PBS溶液定容至10 mL,得到初始濃度為50 μg/mL的他克莫司PBS溶液,按比例配置成梯度濃度分別為0.1、0.6、1.2、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0和50.0 μg/mL的他克莫司PBS標準溶液,備用。

1.3.3 他克莫司模擬血清溶液的配置 取4 g的BSA溶解在100 mL PBS溶液中,得到4%的BSA-PBS溶液;取20 mL人血清白蛋白標準溶液按體積比1∶4溶解于80 mL PBS溶液,得到人血清樣品檢測的溶劑。取0.5 mg他克莫司粉末溶解在0.2 mL甲醇中,用BSA-PBS溶液將按比例稀釋的人血清溶液定容至10 mL,得到濃度為50 μg/mL的他克莫司BSA-PBS溶液或人血清溶液。

1.3.4 溶液的儲存及檢測 將所有配置溶液保存在生理pH值(7.4),4℃環(huán)境存放。檢測時,將1.5 μL藥物溶液滴涂在 KlariteTM金字塔納米結(jié)構(gòu)表面,室溫下風(fēng)干2 h。

1.4 指標測定

1.4.1 他克莫司粉末及丙酮溶液拉曼光譜的測定 取他克莫司粉末及丙酮溶液采用MS20型拉曼光譜儀(英國雷尼紹有限公司),激光功率為1 mW,積分時間為10 s,測定785 nm處的SERS信號,積累2次,使用50×物鏡,采用WiRE 3.1軟件收集拉曼光譜數(shù)據(jù)。每個樣品在SERS基底液滴區(qū)域隨機選擇6個采集點,取平均值作為最終信號值。為獲取較為純凈的拉曼光譜,所有收集的波長數(shù)值在300～1 700 cm-1范圍內(nèi),對不可避免的系統(tǒng)噪點,拉曼譜帶位置的再現(xiàn)性在±2 cm-1內(nèi)有效。

1.4.2 他克莫司水溶液及PBS溶液拉曼光譜的測定 取“1.3.1”項下他克莫司水溶液和“1.3.2”項下他克莫司PBS溶液各1.5 μL,分別滴涂在KlariteTM芯片表面,室溫下風(fēng)干2 h,按“1.4.1”項下光譜條件,測定785 nm處的SERS信號,積累6次。采用WiRE 3.1軟件收集拉曼光譜數(shù)據(jù),對所有采集到的光譜信息進行歸一化分析和記錄。

1.4.3 蒸餾水溶液中他克莫司濃度檢出限的測定 取“1.3.1”項下他克莫司水溶液按“1.4.2”項下方法,測定蒸餾水溶液中他克莫司濃度的檢出限,繪制標準曲線,計算回歸方程。采用檢出限(Limit of detection,LOD)和定量限(Limit of quantification, LOQ)評估芯片對藥物的檢測能力。LOD作為可檢出的最低藥物濃度,由3倍的信噪比(Signal-to-noise, S/N)表示,LOQ為S/N的10倍。

1.4.4 PBS溶液中他克莫司濃度檢出限的測定 取“1.3.2”項下制備的他克莫司標準PBS溶液,按照“1.4.2”項下方法,測定PBS標準溶液中他克莫司濃度的檢出限,繪制標準曲線,計算回歸方程。采用LOD和LOQ評估芯片對他克莫司的檢測能力。

1.4.5 血清溶液中他克莫司的拉曼光譜測定 取“1.3.3”項下制備濃度為50 μg/mL的他克莫司BSA-PBS溶液或人血清溶液,按照“1.4.2”項下方法,測定他克莫司的拉曼光譜,每個點表示來自每個KlariteTM基底3個隨機SERS光譜的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析采用Origin 2017軟件對拉曼光譜數(shù)據(jù)做基線化和標準平滑處理,進行預(yù)處理和峰比較,獲取峰值定位、線性結(jié)果和光譜展示圖。使用Graphpad prism 8.0軟件對線性結(jié)果及光譜展示圖進行美化。采用理論拉曼光譜圖與粉末拉曼光譜圖比對,對譜峰歸屬進行指認。

2 結(jié)果

2.1 他克莫司粉末及他克莫司丙酮溶液拉曼光譜的測定拉曼光譜顯示他克莫司粉末在354～396、474、851～917和1 088 cm-1處出現(xiàn)尖峰,在1 265～1 475 cm-1處出現(xiàn)寬峰;他克莫司丙酮溶液在354、475、1 090 cm-1處出現(xiàn)尖峰,在854～917、1 265 cm-1處出現(xiàn)寬峰,見圖1。

(注: a為他克莫司粉末的拉曼光譜; b為他克莫司丙酮溶液的拉曼光譜; c為作為參考背景的空KlariteTM基底的拉曼光譜。)

2.2 滴涂沉積法(DCDR)測定他克莫司溶液顯微鏡觀察他克莫司水溶液和PBS溶液沉積在KlairteTM芯片表面的“咖啡環(huán)”,見圖2、3。拉曼光譜顯示KlariteTM上涂滴沉積的光譜“咖啡環(huán)”的外邊緣和中心區(qū)域顯示出非常一致的特征峰,在354、474、851～917和1 088 cm-1處出現(xiàn)尖峰,在1 265、1 337和1 475 cm-1處出現(xiàn)寬峰,見圖4、5。

圖2 顯微鏡下他克莫司水溶液的“咖啡環(huán)”圖(50×透鏡)

圖3 顯微鏡下他克莫司PBS溶液的“咖啡環(huán)”圖(50×透鏡)

(注:a為他克莫司粉末的拉曼光譜; b和c為50 μg/mL他克莫司水溶液在“咖啡環(huán)”上的點i處分別使用60 s和20 s信號積分;d為50 μg/mL他克莫司水溶液在“咖啡環(huán)”上的第二點使用20 s信號積分;e為50 μg/mL他克莫司水溶液在裸金表面上使用20 s信號積分;f為水溶液在KlariteTM上使用20 s信號積分。)

(注:a為他克莫司粉末的拉曼光譜;b和c為50 μg/mL他克莫司PBS溶液在“咖啡環(huán)”上的點i處分別使用60 s和20 s信號積分;d為50 μg/mL他克莫司PBS溶液在“咖啡環(huán)”上的第二點使用20 s信號積分;e為50 μg/mL他克莫司PBS溶液在裸金表面上使用20 s信號積分;f為PBS溶液在KlariteTM上使用20 s信號積分。)

2.3 他克莫司水溶液中濃度檢出限的測定與他克莫司粉末的拉曼光譜比較,他克莫司梯度水溶液中鑒定處的峰沒有顯示出明顯位移,在354、476、854、879、1 091、1 268和1 461 cm-1處出現(xiàn)尖峰,譜峰強度與濃度存在線性關(guān)系,見圖6。取354 cm-1處的特征峰作為研究對象,在選定的標準濃度區(qū)間內(nèi)回歸方程為:Y=52.86X+596.5,峰的測定系數(shù)(R2)為0.890 5,LOD為0.14 μg/mL,LOQ為0.47 μg/mL,見圖7。

圖6 他克莫司水溶液的拉曼光譜圖

圖7 他克莫司水溶液中藥物濃度與拉曼光譜峰強度的標準曲線

2.4 他克莫司PBS溶液中濃度檢出限的測定與他克莫司水溶液的拉曼光譜比較,特征峰變寬變?nèi)?而且位置也略有偏移,在350、478、850、1 077、1 126、1 269和1 464 cm-1處產(chǎn)生尖峰,譜峰強度與濃度趨勢存在線性關(guān)系,見圖8。取350 cm-1處的特征峰作為研究對象,標準濃度區(qū)間內(nèi)獲取的線性方程為:Y=19.54X+537.8,峰的測定系數(shù)(R2)為0.2176,LOD為2.5 μg/mL,LOQ為8.3 μg/mL,見圖9。

圖8 他克莫司PBS溶液的拉曼光譜圖

圖9 他克莫司PBS溶液中藥物濃度與拉曼光譜峰強度的標準曲線

2.5 他克莫司血清溶液拉曼光譜的測定與他克莫司水溶液和PBS溶液的拉曼光譜比較,血清溶液中他克莫司的拉曼信號較弱,高濃度時能檢測到他克莫司的部分特征峰,主要分布在352、488、855、1 135、1 213和1 456 cm-1處,這些峰的強度均明顯減弱,且發(fā)生不同程度的頻率偏移,見圖10。

3 討論

作為一種快速、簡單、經(jīng)濟的方法,表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced raman spectroscopy,SERS)已被用于各種抗癌藥物和生物標志物分析和定量監(jiān)測[5-7]。他克莫司膠囊粉末的拉曼光譜信號與他克莫司軟膏、他克莫司TiO2化合物等類似原料藥物的拉曼光譜信號不完全一致,但多個主要峰高度接近。光譜的差異歸因于膠囊中的4種非活性成分,盡管輔料會導(dǎo)致不同的拉曼光譜強度值和帶移,但不會影響他克莫司的檢測和識別。以丙酮作為溶劑時,丙酮受到芯片表面的強金屬吸附作用容易分散,導(dǎo)致光譜信號不穩(wěn)定性且靈敏度較低,但在液體滴涂區(qū)域仍可檢測到他克莫司的特征峰。

與普通拉曼信號比較,SERS的信號可增強106～108倍[8]。利用SERS納米基底產(chǎn)生的表面等離子體共振效應(yīng),信號能夠增強1010～1014倍,可獲得單分子指紋圖譜[9]。KlariteTM芯片作為一款優(yōu)秀的具有倒置四棱錐金字塔矩陣的商用SERS芯片,已經(jīng)展現(xiàn)出高度穩(wěn)定和可再現(xiàn)的SERS信號[10]。研究發(fā)現(xiàn)不同的KlariteTM縱橫比能夠顯著增強SERS的信號,與標準KlariteTM芯片相比,節(jié)距為1 250 nm、凹坑尺寸為1 000 nm、縱橫比為1∶1.2的第五代SERS KlariteTM芯片增加了786%的SERS計數(shù)(約8倍),表現(xiàn)出更好的再現(xiàn)性[11]。

國內(nèi)外多項研究報道利用SERS基底實現(xiàn)了對低濃度生物分子或蛋白質(zhì)的滴涂沉積拉曼(Drop coating deposition Raman, DCDR)檢測方案,如胰島素、耐藥肺炎克雷伯菌株[12]、結(jié)直腸癌患者血漿蛋白[13]、糖基化血紅蛋白[14]、骨關(guān)節(jié)炎患者滑液[15]等。DCDR是將分析物直接滴涂在SERS基底表面,使用拉曼光譜系統(tǒng)評估風(fēng)干后殘留“咖啡環(huán)”輪廓的檢測方法。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過合理的預(yù)處理和標定,DCDR即使在含有熒光基質(zhì)或復(fù)雜緩沖成分的混合物中,也是一種有效的表面分析法[16]。與他克莫司粉末拉曼光譜比較,他克莫司水溶液經(jīng)過DCDR處理,SERS光譜中鑒定出的峰沒有顯示出明顯的位移,表明他克莫司藥物分子對金表面的作用較弱。與蒸餾水溶液中他克莫司拉曼光譜比較,PBS沉積液滴的SERS光譜顯示他克莫司的特征峰形狀和位置均發(fā)生一定改變,這與PBS緩沖液中存在大量離子,影響了他克莫司藥物分子與金膜的結(jié)合有關(guān)。

綜上所述,于KlariteTM芯片表面增強拉曼光譜法第五代SERS KlariteTM芯片進行滴涂沉積有望成為一種快速便捷地測定免疫抑制劑他克莫司藥物濃度的方法。本研究中,確定了他克莫司膠囊粉末的拉曼光譜和特征峰,KlariteTM納米結(jié)構(gòu)在蒸餾水和PBS溶液中均以極低檢出限展示出足夠的反應(yīng)性,可以清晰地捕獲藥物的特征峰,仍然無法獲得低于LOQ的信號強度和藥物濃度之間的精確線性關(guān)系。此外,即使在蒸餾水等單組分溶液中,第五代SERS KlariteTM芯片對他克莫司的LOD值也比臨床檢測需求低約2個數(shù)量級,距離臨床應(yīng)用還有差距。作為未來他克莫司濃度監(jiān)測的有效方案,在傳感器微觀結(jié)構(gòu)優(yōu)化和基于新一代SERS KlariteTM芯片的生物樣本檢測方面,仍需要進行進一步的研究。