李瑞瑞 張子曉 趙振華 韓威 向海 王錢保 黃正洋 李春苗 宗毅 黃華云

摘要：為初步闡明gga-miR-26a在雞脂肪沉積中的作用，以矮小品系S3系（DW）和隱性白羽雞（RR）為試驗(yàn)素材，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)gga-miR-26a在2個(gè)品種不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期肝臟、腹脂及腿肌組織，腹脂和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖期和分化期的表達(dá)變化，并利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)gga-miR-26a靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，gga-miR-26a在S3系雞（DW）和隱性白羽雞（RR）16 W時(shí)肝臟組織中的表達(dá)存在顯著的品種差異，S3系雞在5個(gè)發(fā)育階段表達(dá)均高于隱性白羽雞；腹脂組織中，gga-miR-26a在0 W時(shí)存在極顯著的品種差異（P＜0.01）且顯著高于其他周齡；gga-miR-26a在腿肌組織中的表達(dá)無(wú)顯著的品種差異（P>0.05）；在脂肪細(xì)胞中，gga-miR-26a在分化4 d的表達(dá)顯著高于增殖期（P<0.05）。利用TargetScan、miRDB、miRmap等3個(gè)軟件對(duì)gga-miR-26a靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到163個(gè)交集靶基因；GO及KEGG分析提示gga-miR-26a可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)PTEN、ULK2和PRKCD的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控雞的脂肪沉積。綜上所述，gga-miR-26a在2個(gè)品種雞脂肪相關(guān)組織及脂肪細(xì)胞中均有表達(dá)，且具有顯著的品種差異；gga-miR-26a參與了雞的脂肪沉積過(guò)程，PTEN、ULK2和PRKCD可能是gga-miR-26a調(diào)控脂肪沉積的預(yù)測(cè)靶基因。

關(guān)鍵詞：gga-miR-26a；雞；表達(dá)特性；靶基因

中圖分類號(hào)：S831.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）05-0064-06

在我國(guó)，由于雞的生產(chǎn)成本比較低，而且具有很高的飼料轉(zhuǎn)化率，它已經(jīng)成為繼豬肉之后的第二大肉食性食品。在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，將快速增長(zhǎng)/增重作為肉雞選擇的主要目標(biāo)，但這也造成了屠體脂肪含量過(guò)多，進(jìn)而引發(fā)了一系列的問(wèn)題，比如降低了飼料轉(zhuǎn)換效率，還會(huì)影響到屠宰的質(zhì)量，對(duì)肉、蛋雞的產(chǎn)蛋性能產(chǎn)生影響［1］。脂肪性狀是畜禽肉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，胴體組成、肉色和嫩度等因素決定肉質(zhì)性狀，脂肪沉積量和沉積部位則是肉質(zhì)性狀的影響因素［2］。脂肪性狀是數(shù)量性狀，受多基因調(diào)控，挖掘出與脂肪沉積密切相關(guān)的基因?qū)檫M(jìn)一步揭示脂肪沉積的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

miRNA是一個(gè)小的（20～23 nt）非蛋白質(zhì)編碼RNA家族，它主要是發(fā)揮基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的作用，在翻譯層面上，miRNA是通過(guò)根據(jù)序列互補(bǔ)性的靶向mRNA來(lái)控制基因表達(dá)的［3-4］。miR-26a 在第3條染色體和第12條染色體上均表達(dá)，分別是miR-26a-1、miR-26a-2［5］。研究表明，miR-26a的表達(dá)量與癌癥的進(jìn)展關(guān)系密切。miR-26a可以作為一種乳腺癌的抑癌基因，它可以通過(guò)靶向作用于FAM98A來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲［6］，miR-26a介導(dǎo)的PTEN可以促進(jìn)體內(nèi)膠質(zhì)瘤的發(fā)生［7］，還能靶向NEK6并抑制馬立克氏病淋巴瘤細(xì)胞增殖［8］，F(xiàn)BXO11介導(dǎo)miR-26a對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有抑制作用［9］。

miR-26a不但調(diào)控癌癥過(guò)程，而且與生理功能有關(guān)，包括血管生成、骨骼肌細(xì)胞分化和骨骼肌損傷后再生以及脂質(zhì)代謝［10-12］。miR-26a可抑制TGF-β誘導(dǎo)的韌帶成纖維細(xì)胞增殖［13］；在高脂肪飲食的小鼠中，miR-26a可通過(guò)減少脂肪酸合成從而減輕肥胖引起的代謝并發(fā)癥［14］；lncRNA GAS5敲低通過(guò)調(diào)節(jié)miR-26a-5p/PDE4B來(lái)激活cAMP/CREB途徑來(lái)減輕肝臟脂質(zhì)積累［15］；miR-26a被抑制后，會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面血管生成和細(xì)胞增殖，進(jìn)而加快創(chuàng)面愈合速度［16］。綜上所述，miR-26a參與了哺乳動(dòng)物的肌肉生成和脂肪代謝過(guò)程。在家禽上，gga-miR-26a 的研究尚不完善。有研究報(bào)道，gga-miR-26a是光感受器L型電壓門控鈣通道α1C亞基（L-VGCCα1C）晝夜節(jié)律調(diào)控表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子［17］。目前關(guān)于gga-miR-26a與優(yōu)質(zhì)肉雞脂肪沉積（腹脂和肌內(nèi)脂肪沉積）的關(guān)系知之甚少。本試驗(yàn)以江蘇省家禽科學(xué)研究所自主選育的矮小品系S3（DW）和隱性白羽雞（RR）為試驗(yàn)材料，分析gga-miR-26a在不同時(shí)期的肝臟、腹脂、腿肌組織以及腹脂和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖期和分化期的表達(dá)差異，將為明確gga-miR-26a在雞脂肪沉積中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)以江蘇省家禽科學(xué)研究所的DW及RR為材料，分別采集0天（0 W）、2周（2 W）、8周（8 W）、14周（14 W）、16周（16 W）的肝臟、腹部脂肪及腿部肌肉樣本，每個(gè)樣本6個(gè)重復(fù)，并將其快速冷凍后置于-80 ℃條件下進(jìn)行貯藏。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

雞原代脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)根據(jù)Cryer等借鑒哺乳動(dòng)物的方法［18］，利用膠原酶消化法進(jìn)行細(xì)胞提取。在原代細(xì)胞融合率達(dá)到70%的情況下，傳代鋪板。

當(dāng)傳代后的細(xì)胞融合到70%的時(shí)候，用0.1%油酸進(jìn)行誘導(dǎo)分化，將這一時(shí)刻界定為分化0 h，沒(méi)有添加油酸組的為增殖期細(xì)胞，在分化后的第1天、第4天、第6天以及增殖期收集細(xì)胞。

1.3 總RNA提取

使用miRNA提取分離試劑盒與紫外分光光度計(jì)，分別對(duì)各組織與細(xì)胞樣本中的總RNA進(jìn)行提取，并對(duì)RNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)（1.8≤D260 nm/D280 nm≤2.0）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量

實(shí)時(shí)定量qPCR引物使用miRNA Design v1.01設(shè)計(jì)（表1）。各樣本中提取3 μL總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)miRNA進(jìn)行第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄以及以第一鏈cDNA為模板的qPCR反應(yīng)。以矮小品系S3雞0 W的表達(dá)量為參照日齡，以U6作為用于歸一化的基因（內(nèi)參），采用2-ΔΔCT法對(duì)miRNA相對(duì)表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 靶基因預(yù)測(cè)及信號(hào)通路富集分析

利用3個(gè)軟件對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，分別是TargetScan （https：//www.targetscan.org/vert_72/）、miRDB （http：//www.mirdb.org/.org/）、miRmap （https：//mirmap.ezlab.org/）。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果繪制venny圖，選擇3個(gè)在軟件預(yù)測(cè)中出現(xiàn)次數(shù)超過(guò)2次的基因作為候選目標(biāo)基因。將預(yù)測(cè)的靶基因集合，通過(guò)DAVID在線工具和KOBAS 3.0在線工具對(duì)靶基因的生物學(xué)功能進(jìn)行分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

雞gga-miR-26a的相對(duì)表達(dá)水平可以采用2-ΔΔCT法分析。試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織中g(shù)ga-miR-26a的表達(dá)

肝臟組織中g(shù)ga-miR-26a的表達(dá)在16 W時(shí)具有顯著品種特異性。5個(gè)時(shí)間點(diǎn)DW雞的表達(dá)量均高于RR雞。gga-miR-26a在DW雞的表達(dá)量8 W時(shí)最低，8 W后直線上升。除16 W外，gga-miR-26a在RR雞各周齡的表達(dá)量差異不顯著（圖1）。

2.2 腹脂組織中g(shù)ga-miR-26a的表達(dá)

gga-miR-26a在腹脂組織中0 W時(shí)的表達(dá)量存在顯著的品種差異。0 W時(shí)DW雞與RR雞的 gga-miR-26a 相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他周齡。gga-miR-26a在2～16 W相對(duì)穩(wěn)定地保持在低表達(dá)水平（圖2）。

2.3 腿肌組織中g(shù)ga-miR-26a的表達(dá)

gga-miR-26a在腿肌組織中的表達(dá)存在一定的品種差異，0 W時(shí)gga-miR-26a在DW雞與RR雞中的相對(duì)表達(dá)量最低，8 W前gga-miR-26a在DW雞中的相對(duì)表達(dá)量高于RR雞，而14 W開(kāi)始DW雞低于RR雞（P>0.05）。2個(gè)品種間，gga-miR-26a在同一周齡的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，差異不顯著（圖3）。

2.4 脂肪細(xì)胞中g(shù)ga-miR-26a的表達(dá)

在雞腹脂脂肪細(xì)胞中，gga-miR-26a的相對(duì)表達(dá)量在分化1 d最低，顯著低于增殖期（圖4，P<0.05）；在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中，gga-miR-26a在分化 4 d 和 6 d 的相對(duì)表達(dá)量顯著高于增殖期（P<0.05，圖5），在分化1 d開(kāi)始表達(dá)量呈現(xiàn)直線上升趨勢(shì)。

2.5 gga-miR-26a靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

利用在線軟件TargetScan、miRDB和miRmap，預(yù)測(cè)出了gga-miR-26a的靶基因，它們分別是469、972、1 072個(gè)。將3種方式中超過(guò)2次的基因進(jìn)行并集，得到了163個(gè)目標(biāo)基因（圖6）。

對(duì)163個(gè)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，GO分析結(jié)果（圖7）分為細(xì)胞組分（cellular component，簡(jiǎn)稱CC）、分子功能（molecular function，簡(jiǎn)稱MF）和生物過(guò)程（biological process， 簡(jiǎn)稱BP）等3個(gè)部分。

在生物學(xué)過(guò)程分類中，靶基因主要富集到肽基蘇氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)去磷酸化、蛋白質(zhì)自磷酸化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA模板、GTP酶活性的正向調(diào)節(jié)等過(guò)程；在細(xì)胞組分分類中，靶基因主要富集到胞質(zhì)溶膠、核質(zhì)、質(zhì)膜等活動(dòng)中；在分子功能分類中，靶基因主要富集到蛋白激酶結(jié)合、小GTP酶結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子功能。KEGG通路富集分析結(jié)果如圖8所示，預(yù)測(cè)到的靶基因在mTOR信號(hào)通路（ULK2、RPTOR、RPS6KA6、PTEN、MTOR、STRADB）、自噬-其他（ULK2、RPTOR、MTOR）、自噬-動(dòng)物（ULK2、PTEN、RPTOR、MTOR、PRKCD）、 信使核糖核酸監(jiān)測(cè)途徑（PPP2R3B、ETF1、CPSF4、PPP2R5A）等途徑顯著富集。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)育階段的肝臟、腹脂和腿肌組織中，gga-miR-26a在呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。gga-miR-26a在2個(gè)品種肝臟組織中的表達(dá)具有顯著的差異，DW雞在肝臟組織中 gga-miR-26a 的相對(duì)表達(dá)量始終高于RR雞，gga-miR-26a 在腹脂組織中0～2 W時(shí)的相對(duì)表達(dá)量RR雞高于DW雞，gga-miR-26a在腿肌組織中的相對(duì)表達(dá)量8 W以前DW雞高于RR雞。綜上所述，miR-26a 不但參與哺乳動(dòng)物肌肉發(fā)育及脂肪代謝的調(diào)控過(guò)程，同時(shí)也參與了優(yōu)質(zhì)肉雞肌肉發(fā)育和脂肪代謝的調(diào)控，而gga-miR-26a對(duì)肌肉發(fā)育和脂肪沉積調(diào)控作用的時(shí)間因品種而異。gga-miR-26a 在體外腹脂和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化后期的表達(dá)量顯著高于增殖期，推測(cè)脂肪細(xì)胞分化后期是gga-miR-26a主要調(diào)控時(shí)期。有研究報(bào)道，哺乳期間通過(guò)乳汁供應(yīng)的miR-26a表達(dá)量的改變能夠改變后代中靶基因的表達(dá)，并可能影響脂肪組織的發(fā)育［18］；miR-26a是一種有效的脂肪前體細(xì)胞分化抑制劑，其作用靶點(diǎn)是Fbxl19［19］；miR-26a是一個(gè)抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化的基因，它通過(guò)介導(dǎo)ACSL3來(lái)促進(jìn)肌前體脂肪細(xì)胞中脂滴的累積［20］；高表達(dá)的AP2-microRNA-26a具有降低內(nèi)臟脂肪含量及血脂的作用［21］。這表明miR-26a對(duì)脂肪的調(diào)節(jié)不僅在同一物種不同品種中有差異，在物種間也存在一定的差異，后期將進(jìn)一步驗(yàn)證這一推論。

miRNA對(duì)相關(guān)性狀的調(diào)控都是通過(guò)靶向基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，靶基因的預(yù)測(cè)是深入研究miRNA功能的重點(diǎn)。本研究采用3種預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到163個(gè)交集靶基因，顯著富集在mTOR信號(hào)通路、信使核糖核酸監(jiān)測(cè)途徑等信號(hào)通路，其中富集在mTOR信號(hào)通路、自噬-其他、自噬-動(dòng)物3條通路中的靶基因都有報(bào)道與脂肪沉積密切相關(guān)。富集在mTOR信號(hào)通路、自噬-其他和自噬-動(dòng)物的ULK2基因，有研究報(bào)道其主要在脂肪細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控脂類代謝的作用［22］；富集在mTOR與自噬-動(dòng)物通路的PTEN，有研究表明，miR-26a正向調(diào)控3T3-L1細(xì)胞成脂分化，其機(jī)制可能與PTEN有關(guān)［23］，miR-21能促進(jìn)BMSCs成骨分化，且能負(fù)性調(diào)控PTEN，抑制BMSCs成脂分化［24］；富集在自噬-動(dòng)物的PRKCD在誘導(dǎo)3T3細(xì)胞的脂肪形成中起重要作用，并對(duì)脂肪形成起抑制作用［25］。綜上所述，推測(cè)PTEN、ULK2和PRKCD可能是miRNA-26a參與調(diào)控雞脂肪代謝或肌肉發(fā)育的靶基因，后續(xù)通過(guò)體外功能試驗(yàn)和熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)將重點(diǎn)關(guān)注這3個(gè)靶基因。

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