張柏銘 秦立得 王淑婷 劉迎春 孫曉亮 李雪萍 王玉東 王曉茵 趙思俊 曹旭敏 劉坤 王述柏 宋翠平

收稿日期：2022-11-14

基金項目：山東省家禽產(chǎn)業(yè)技術體系項目（SDAIT-11-14）

作者簡介：張柏銘（2000-），男，山東煙臺人，本科生，主要從事動物產(chǎn)品安全監(jiān)測研究，（電話）18853559551（電子信箱）1820623270@qq.com；共同第一作者，秦立得（1989-），男，山東泰安人，助理研究員，碩士，主要從事動物產(chǎn)品安全監(jiān)測研究，（電話）15712710612（電子信箱）825149813@qq.com；通信作者，宋翠平（1971-），女，山東濰坊人，正高級獸醫(yī)師，博士，主要從事動物產(chǎn)品安全監(jiān)測研究，（電話）13963915205（電子信箱）1575369253@qq.com。

摘要：建立了同時檢測有機肥中磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類3類55種抗菌藥物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。將有機肥研磨、過篩制成試驗樣品后，使用HLB固相萃取柱凈化，上樣后依次用去離子水、5%乙腈水溶液淋洗，甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比7∶3，含5%氨水）洗脫，氮吹吹干，0.1%甲酸水/乙腈（體積比=9∶1）復溶；在多反應檢測模式下進行測定，外標法定量。結(jié)果表明，4批有機肥中55種藥物在1.0～100 μg/kg范圍內(nèi)線性關系良好（R2>0.990 0），該方法的檢出限為2.0～7.5 μg/kg，定量限為5.0～25.0 μg/kg，各種藥物的回收率為60.2%～118.7%，批內(nèi)相對標準偏差（n=5）為0.5%～15.0%，批間相對標準偏差（n=20）為4.3%～24.1%。該方法簡單可靠，凈化效果好，適用于有機肥中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)脂類藥物的同時檢測。

關鍵詞：有機肥；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）；快速檢測；抗菌藥物

中圖分類號：S859.84???????? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0175-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.031??????????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Simultaneous and rapid detection of 55 antibacterial drugs in organic fertilizer using

UPLC-MS/MS

ZHANG Bai-ming1，QIN Li-de1，2 ，WANG Shu-ting1，LIU Ying-chun3，SUN Xiao-liang1，LI Xue-ping4，WANG Yu-dong1，

WANG Xiao-yin1， ZHAO Si-jun1，CAO Xu-min1，LIU Kun1，WANG Shu-bai5， SONG Cui-ping1

（1. China Animal Health and Epidemiology Center， Qingdao? 266032， Shandong，China；2. College of Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University，Jinzhong? 030031， Shanxi，China；3. Qingdao Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Qingdao? 266032， Shandong，China；

4.Qingdao Jiulian Group Co.，Ltd，Qingdao? 266611， Shandong，China；5. College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University， Qingdao? 266032， Shandong，China）

Abstract： An ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was established for the simultaneous detection of 55 types of antibacterial drugs， including sulfonamides， macrolides， and quinolones， in organic fertilizer.After grinding and sieving the organic fertilizer into experimental samples， they were purified using HLB solid-phase extraction column. After loading， the samples were sequentially washed with deionized water and 5% acetonitrile aqueous solution， eluted with methanol/ethyl acetate solution （volume ratio 7∶3， containing 5% ammonia）， blown dry with nitrogen， and re-dissolved in 0.1% formic acid water/acetonitrile （volume ratio 9∶1）；measurement was carried out in a multi reaction detection mode， with the external standard method for quantification. The results showed that among the four batches of organic fertilizers， 55 drugs had a good linear relationship （R2>0.990） within the range of 1.0～100 μg/kg，the detection limit of this method was 2.0～7.5 μg/kg，the quantitative limit was 5.0～25.0 μg/kg，the recovery rates of various drugs were 60.2%～118.7%，the relative standard deviation within the batch （n=5） was 0.5%～15.0%， and the relative standard deviation between batches （n=20） was 4.3%～24.1%. This method was simple and reliable， with a good purification effect， and was suitable for the simultaneous detection of sulfonamide， quinolone， and macrocyclic lipid drugs in organic fertilizer.

Key words： organic fertilizer； UPLC-MS/MS； rapid detection； antibacterial drugs

張柏銘，秦立得，王淑婷，等. UPLC-MS/MS法同時快速檢測有機肥中55種抗菌藥物［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2024，63（5）：175-181．

中國每年生產(chǎn)肉蛋奶1.5億t，伴隨產(chǎn)生畜禽糞污約31億t［1］。畜禽糞污是制造有機肥的重要原料，農(nóng)田施用有機肥可改善土壤肥力，對形成種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)良性循環(huán)具有重要意義。中國動物養(yǎng)殖環(huán)節(jié)大量使用抗菌藥物，2019年用量為3.7萬t，30%～90%抗菌藥物代謝至體外并最終進入糞污［2］。常用的有機肥制作方法難以高效降解畜禽糞污中的抗菌藥物，導致有機肥中普遍檢測出抗菌藥物殘留［3-5］?？咕幬镫S肥料進入環(huán)境，可增加細菌耐藥性選擇壓力，促進抗菌藥物抗性基因積累，導致致病菌耐藥性增強，影響公共衛(wèi)生安全［6-8］。

有機肥成分復雜，基質(zhì)對檢測結(jié)果影響較大，目前已有檢測其中喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等多類藥殘留的方法［9-13］。但在樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，這些方法存在耗材成本較高、基質(zhì)干擾嚴重、方法不穩(wěn)定、檢測藥物種類較少等缺點。本試驗采用乙腈與EDTA-Mcllvaine緩沖液作為提取液，HLB固相萃取柱對有機肥樣品進行前處理，運用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）進行檢測，建立能同時檢測有機肥中喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類等畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)常用抗菌藥物殘留的方法，該方法靈敏度高、準確度高，適用于大批量樣品的檢測，可為監(jiān)測畜禽糞污中抗菌藥物含量并評估風險提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Aglient 6470型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀［配備分析軟件，安捷倫科技（中國）有限公司］，5804R型臺式高速冷凍離心機［艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司］，Milli-Q型超純水儀［密理博儀器（上海）有限公司］，CP225D型電子天平［賽多利斯斯泰帝（上海）貿(mào)易有限公司］，UMV-2型多功能振蕩器（日照億嵐儀器設備有限公司），KQ-500DE型超聲波儀（昆山市超聲儀器公司）。

1.2 主要試劑

色譜純級乙腈、甲醇、甲酸，分析純級乙酸、氨水等試劑均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類3類55種藥物標準品均購自上海安普實驗科技股份有限公司和德國Dr.Ehrenstorfer公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）等試劑均購自國藥集團化學試劑公司；去離子水為實驗室自制。HLB 固相萃取柱（3 mL，60 mg）購自美國沃特世公司；0.22 μm濾膜等耗材購自天津市津騰科技有限公司。

1.3 標準溶液配制

準確稱取磺胺二甲基異嘧啶標準品2.5 mg，用甲醇充分溶解后定容至25 mL，配制成濃度為 100 μg/mL的磺胺二甲基異嘧啶標準儲備液，用同樣的方法分別配制其余54種藥物儲備液，-20 ℃冷凍保存。從上述55種藥物儲備液中分別吸取250 μL溶液至25 mL容量瓶中，用甲醇定容并混勻，配制成各種藥物濃度為1.0 μg/mL的混合標準工作液，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取 有機肥經(jīng)研磨，過1.7 mm試樣篩，制成試驗樣品。將不含55種藥物的有機肥作為空白樣品。準確稱取樣品（2.00±0.02） g于50 mL離心管中，加入5 mL EDTA-Mcllvaine（pH=4.0）緩沖液，振蕩混合均勻；加入20 mL乙腈/乙酸（體積比為9∶1），混合均勻后，超聲波處理15 min，振蕩15 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.4.2 樣品凈化 取2.5 mL上清液，置于45 ℃水浴氮吹儀中緩慢濃縮至液體體積小于0.5 mL，加入??? 5 mL EDTA-Mcllvaine緩沖液復溶，振蕩1 min。HLB固相萃取柱用 3 mL甲醇、3 mL去離子水活化，將前一步復溶液全部過柱，依次用3 mL去離子水、? 3 mL 5%乙腈水溶液淋洗。用3 mL甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比7∶3，含5%氨水）洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，45 ℃水浴氮吹儀吹干。加入1 mL 0.1% 甲酸水/乙腈（體積比為9∶1）復溶液溶解殘渣，渦旋20 s，超聲波處理2 min，渦旋20 s，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后裝瓶上機檢測。

1.5 測定條件

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱為BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫35 ℃，流動相A為乙腈，流動相B為 0.1%甲酸溶液，流速為0.3 mL/min，進樣體積為5.0 μL，梯度洗脫條件如表1所示。

1.5.2質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，正離子掃描模式（ESI+），檢測方式為多反應檢測（MRM）；載氣溫度為250 ℃，載氣氣流為7 L/min，鞘氣溫度為325 ℃，鞘氣流速為11 L/min。55種藥物的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

1.6 線性范圍和基質(zhì)匹配標準曲線的繪制

有機肥空白樣品經(jīng)過“1.4”前處理方法提取、凈化后，添加不同體積的混合標準工作液，配制成藥物濃度分別為 1.0、1.5、2.0、5.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標準工作液并上機分析。以標準工作液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制基質(zhì)匹配標準曲線，計算回歸方程和相關系數(shù)。

1.7 回收率、檢出限和定量限

向2.00 g空白有機肥樣品中添加不同體積的混合標準工作液，按“1.4”前處理對樣品進行處理，上機檢測。綜合試驗數(shù)據(jù)，當特征離子色譜峰信噪比S/N≥10時，對應的樣品抗菌藥物濃度為定量限（LOQ）；S/N≥3時，對應的樣品抗菌藥物濃度為檢出限（LOD）。

在4批有機肥樣品（每批樣品5個重復）中分別添加適量混合標準工作液，使其成為藥物濃度為25 μg/kg的陽性樣品，測定55種藥物的回收率，并計算批內(nèi)相對標準偏差（RSD）和批間相對標準偏差（RSD）。

1.8 實際樣品的檢測

采用本試驗建立的方法對山東省4家有機肥場采集的4份有機肥樣品進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取方法優(yōu)化 參考相關文獻和標準的提取方法［9-13］，對比甲醇、乙腈、乙酸乙酯、EDTA-Mcllvaine緩沖液等不同提取液的提取效果。試驗發(fā)現(xiàn)，使用甲醇、乙酸乙酯作為提取液時，會提取到大量雜質(zhì)并難以凈化；使用乙腈作為提取液時，提取到的雜質(zhì)較少，藥物回收率較高；使用EDTA-Mcllvaine緩沖液有助于喹諾酮類藥物的提取。因此，本研究采用乙腈-EDTA-Mcllvaine緩沖液作為提取液，并對比了乙腈與EDTA-Mcllvaine緩沖液不同混合比例的提取效果。結(jié)果表明，EDTA-Mcllvaine緩沖液與乙腈的體積比為1∶4時，提取效果最佳（圖1）。研究發(fā)現(xiàn)，在提取液中加入10%乙酸有助于提升提取效果，最優(yōu)的提取液配比為EDTA-Mcllvaine緩沖液∶乙腈（10%乙酸）=1∶4（體積比）。此外，超聲波處理有助于大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類藥物的提?。?4］，本試驗中提取體系超聲波處理時間為15 min。

2.1.2 凈化方法優(yōu)化 對淋洗液進行優(yōu)化，比對5%甲醇水溶液、10%甲醇水溶液、5%乙腈水溶液、10%乙腈水溶液的淋洗效果。結(jié)果表明，10%乙腈水溶液、10%甲醇水溶液作為淋洗液時，降低了部分抗菌藥物的回收率；5%乙腈水溶液去除雜質(zhì)的效果較好，回收率較高。因此本研究選用5%乙腈水溶液作為淋洗液（圖2）。

1為5%甲醇水溶液；2為10%甲醇水溶液；3為5%乙腈水溶液；4為10%乙腈水溶液

2.1.3 洗脫液優(yōu)化 對固相萃取柱上保留的目標藥物進行洗脫，含氨水的甲醇能夠較好地洗脫目標藥物，但洗脫的雜質(zhì)較多；乙酸乙酯洗脫的雜質(zhì)較少，但不能有效洗脫大部分藥物。試驗對比了不同比例乙酸乙酯和甲醇混合洗脫液對目標藥物的洗脫效果，并優(yōu)化了洗脫液中氨水的濃度。結(jié)果表明，70%甲醇/乙酸乙酯（體積比7∶3，含5%氨水）作為洗脫液時洗脫效果最佳（圖3）。

1為5%氨化甲醇溶液（體積比為5∶95）；2為50%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為1∶1）；3為50%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為1∶1，含2%氨水）；4為50%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為1∶1，含5%氨水）；5為70%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為7∶3）；6為70%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為7∶3，含2%氨水）；7為70%甲醇/乙酸乙酯溶液（體積比為7∶3，含5%氨水）

2.2 線性范圍和基質(zhì)匹配標準曲線

以標準溶液質(zhì)量濃度（ng/mL）為橫坐標，以離子峰面積為縱坐標，制作基質(zhì)匹配標準曲線。目標藥物在1～100 μg/kg的濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)（R2）均大于0.990 0，如表3所示。

2.3 回收率、檢出限、定量限 、批內(nèi)相對標準偏差和批間相對標準偏差

由表4可知，該方法的檢出限為2.0～7.5 μg/kg，定量限為5.0～25.0 μg/kg；4批有機肥樣品中55種藥物的回收率為60.2%～118.7%；批內(nèi)相對標準偏差（n=5）為0.5%～15.0%，批間相對標準偏差（n=20）為4.3%～24.1%。

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

使用本檢測方法對山東省采集的4份有機肥進行測定，結(jié)果顯示，1份樣品中未檢測出55種藥物殘留，其余3份均有藥物殘留檢出，其中1份樣品中檢測出恩諾沙星殘留，殘留濃度為120.0 μg/kg；1份樣品中檢測出恩諾沙星、環(huán)丙沙星和替米考星藥物殘留，殘留濃度分別為173.4、16.3、51.6 μg/kg；1份樣品中檢測出恩諾沙星、環(huán)丙沙星和達氟沙星藥物殘留，殘留濃度分別為112.0、49.0、18.7 μg/kg。

3 小結(jié)

本研究優(yōu)化了提取液、提取方法、淋洗液、洗脫液等前處理步驟，建立了能同時檢測有機肥中磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類3類55種抗菌藥物殘留的UPLC-MS/MS方法。與文獻報道方法和國標方法相比，該方法的凈化效果較好，使用的耗材成本較低，檢測靈敏度和重復性滿足檢測需求，可實現(xiàn)對有機肥中磺胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類3類55種抗菌藥物的快速檢測。

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