摘要：以紫斑牡丹受灰霉病脅迫后的第2和第3階段葉片作為研究材料，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析的方法，研究紫斑牡丹受灰霉病脅迫后的基因表達(dá)調(diào)控與代謝特性。結(jié)果顯示，在第2和第3階段，轉(zhuǎn)錄組分別獲得 12 700、22 257個差異基因，上調(diào)差異基因明顯多于下調(diào)差異基因。差異基因GO功能注釋主要涉及在細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞進(jìn)程。在KEGG代謝通路注釋中，差異基因均主要富集在核糖體、碳代謝和氨基酸的生物合成等通路。此外，在第2和第3階段代謝組分別獲得67、136個差異代謝物，包括有機(jī)酸類、黃酮類、脂質(zhì)類和萜類等物質(zhì)。在KEGG代謝通路注釋中，第2階段差異代謝物主要富集在各種氨基酸的生物合成與代謝通路，第3階段主要富集在各種次生代謝物的生物合成與代謝通路。此外，聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，第2、第3階段的差異基因和差異代謝物都顯著富集在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路上。GLT1、GabD、puuE等基因的表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)了谷氨酸、琥珀酸及4-氨基丁酸等抗逆因子的代謝，從而抵抗病害脅迫。另外，AGXT、purA、argH、argG、GOT2、GDH2、GAD、puuE、SSADH、CS、ACO、IDH1、IDH2、OGDH、DLST、LSC1、SDHA、fumC、MDH2等基因的表達(dá)顯著上調(diào)，直接或間接促進(jìn)檸檬酸循環(huán)，提高了能量代謝效率。綜上所述，本研究為理解灰霉病脅迫下紫斑牡丹代謝響應(yīng)途徑提供了新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫斑牡丹；轉(zhuǎn)錄組；代謝組；灰霉??；差異基因；檸檬酸循環(huán)

中圖分類號：S436.8⁺1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0149-13

收稿日期：2023-11-02

基金項(xiàng)目：魯甘科技協(xié)作項(xiàng)目（編號：YDZX2021103）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（農(nóng)業(yè)良種工程）項(xiàng)目（編號：2020LZGC009）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2021SFGC1205）。

作者簡介：孫 燕（1998—），女，山東威海人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)。E-mail：1066550819@qq.com。

通信作者：吳府勝，高級工程師，研究方向?yàn)榱植莘N質(zhì)資源保護(hù)，E-mail：wufu19 @163.com；高德民，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)，E-mail：gdm607@126.com。

紫斑牡丹［Paeonia rockii（ S. G. Haw amp; Lauener） T. Hong amp; J. J. Li］為芍藥屬多年生木本植物，是我國中西部地區(qū)的特有中藥材和觀賞花卉，被列為珍稀瀕危三級保護(hù)植物。同時，它也是我國重要的油用植物，其藥用、觀賞、經(jīng)濟(jì)價值非常重要^［1-3］。然而，紫斑牡丹常受到灰霉病的危害，導(dǎo)致大面積減產(chǎn)^［4］。特別是在陰雨潮濕的季節(jié)，灰霉病更容易發(fā)生，直接表現(xiàn)為葉片干枯或花瓣腐爛，單純依靠化學(xué)防治不能從根本上解決這一問題^［5-6］。因此，研究灰霉病的致病機(jī)制對于從根本上解決病害的發(fā)生非常重要。灰霉病的主要致病因子為灰葡萄孢，被植物病理學(xué)界列為第二重要的真菌病原體，該病原體具有寄主廣、潛伏時間長、破壞程度大等特點(diǎn)^［7-9］。

研究發(fā)現(xiàn)，灰霉病在我國甘肅、山東、河南、湖北等地以及歐洲、南美洲均普遍發(fā)生^{［6，10-14］}。其中，芍藥屬植物中至少存在灰葡萄孢、牡丹葡萄孢、假灰葡萄孢、歐美葡萄孢等致病因子^［13-14］。病原菌主要靠分生孢子隨氣流、雨水以及農(nóng)具等傳播擴(kuò)散，難以防治^［15］。對灰霉病的報道表明，脂肽類物質(zhì)對牡丹灰霉病菌有很好的抑制作用^［16］。除此之外，由Bx6、Bx7、Bx8和Bx9等基因調(diào)控的次生代謝產(chǎn)物在植物對病原菌的防御反應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用^［17］。BX7、4CL、HCT、COMT、F5H、UGT72E、miR5254、miR165a-3p、miR3897-3p和miR6450a等基因也均參與了對灰霉病感染的應(yīng)答^［18-19］?；颐共≡谄渌魑镏幸草^常見，例如容易侵染觀賞植物玫瑰、藥用植物百合、經(jīng)濟(jì)作物番茄等^［20-22］。這直接導(dǎo)致灰霉病對植物造成了高程度危害，存在重大經(jīng)濟(jì)及生態(tài)安全隱患。盡管對于灰霉病在芍藥屬中的研究取得了一定的進(jìn)展，但對紫斑牡丹的影響機(jī)制還不深入。本研究選擇了受到損傷的植株葉片作為研究對象，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析的方法，旨在了解灰霉病在侵染過程中的轉(zhuǎn)錄和代謝機(jī)制，為紫斑牡丹的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究針對山東中醫(yī)藥大學(xué)種質(zhì)庫種植的紫斑牡丹進(jìn)行了鑒定。試驗(yàn)于2022年在山東中醫(yī)藥大學(xué)百草園試驗(yàn)田（36° 33′N，116° 47′E）進(jìn)行，以葉片為單位，從未侵染到嚴(yán)重侵染過程的葉片參照GB/T 17980.28—2000《農(nóng)藥 田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一） 殺菌劑防治蔬菜灰霉病》進(jìn)行分級取樣研究。其中一部分樣品用于拍照記錄，剩余部分儲存在 -80 ℃ 的環(huán)境中，以便后續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組分析。轉(zhuǎn)錄組測序每個處理進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)，而代謝組分析則進(jìn)行6個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測序

利用Trizol試劑從紫斑牡丹葉片中提取總RNA，用NanoDrop法測定RNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。采用實(shí)時熒光定量PCR法對文庫質(zhì)量進(jìn)行檢測（文庫有效濃度＞2 nmol/L）檢測合格后對高質(zhì)量的RNA采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺進(jìn)行測序分析^［23］。采用Trinity進(jìn)行組裝最終獲得轉(zhuǎn)錄本^［24］。使用Nr、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG數(shù)據(jù)庫并利用BLAST軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋^［25-28］?；虮磉_(dá)水平用FPKM表示^［29］。利用R軟件（https：//www.r-project.org）進(jìn)行樣本相關(guān)性分析。采用DESeq進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）lt;0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從中獲得差異表達(dá)基因（DEG），并對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.3 代謝物提取與分析方法

樣本在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，稱取適量樣本（50～100 mg），加入1 mL水、乙腈、異丙醇（體積比為1∶1∶1）溶液，渦旋60 s，低溫超聲30 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液，-20 ℃放置1 h沉淀蛋白，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液，真空干燥復(fù)溶于200 μL 50%乙腈，渦旋，14 000 r/min 4 ℃離心15 min，取上清液用于后續(xù)分析。色譜柱：Waters HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A相為0.1%甲酸-水溶液，B相為0.1%甲酸-乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；洗脫梯度：0～1 min A/B（體積比為100∶0 ），1～9 min A/B（體積比為5∶95），9～13 min A/B（體積比為5∶95），13～17 min A/B（體積比為100∶0）；整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進(jìn)樣器中。采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊(duì)列中插入質(zhì)控（QC）樣品，用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜（Vanquish，UPLC，Thermo，美國）和高分辨質(zhì)譜（Q Exactive HFX，Thermo，美國）。利用R軟件（https：//www.r-project.org）進(jìn)行樣本相關(guān)性分析。采用正交偏最小二乘法-判別分析法（OPLS-DA）進(jìn)行代謝物差異分析。采用t檢驗(yàn)結(jié)合多元分析OPLS-DA的方法，篩選出組間差異代謝物［變量重要性投影值（VIP）≥1，顯著性P值≤0.05］，并對篩選的差異代謝物進(jìn)行KEGG富集分析^［30］。

1.4 轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析

用軟件R 3.4.2 Heatmap包對轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析得到的差異組分進(jìn)行相關(guān)性分析，并使用Fisher檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)差異組分的顯著性。針對富集顯著通路的差異組分進(jìn)行可視化標(biāo)注，以進(jìn)一步分析基因和代謝物之間的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫斑牡丹灰霉病癥狀表現(xiàn)

紫斑牡丹灰霉病早期發(fā)生在葉片邊緣，隨著時間的推移，病變不斷擴(kuò)大并向內(nèi)擴(kuò)展。根據(jù)病斑面積占葉片面積的百分比，可以將葉片分為3個階段以評估病程的嚴(yán)重程度：第1階段（PL，0級）表示無病斑，即葉片未受到感染（圖1-a）；第2階段（PBL3，0～3級）表示病斑面積占葉片面積15%及以下（圖1-b）；第3階段（PBL9，3～9級）表示病斑面積占葉片面積15%以上（圖1-c）；PL階段作為對照組表示未感染的狀態(tài)。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序序列分析

為了進(jìn)一步探究紫斑牡丹葉片在受病害侵染不同階段轉(zhuǎn)錄水平上的差異，本研究構(gòu)建了9個cDNA文庫用于轉(zhuǎn)錄組分析。通過對cDNA文庫進(jìn)行測序（表1），總共獲得391 970 926 bp的原始序列，其中374 275 728 bp干凈序列。每個文庫的GC量在44.88%～45.47%之間，Q30的比例在92.72%～93.49%之間。使用Trinity軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，發(fā)現(xiàn)9個樣品的干凈序列比對率在69.76%～70.64%之間。表明試驗(yàn)取樣合理，并且RNA-seq數(shù)據(jù)的質(zhì)量是可靠的。

2.2.2 序列比對與注釋信息

使用搜索工具BLAST將上述組裝得到的39 104個非重復(fù)序列基因與各大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。由表2可知，Nr數(shù)據(jù)庫注釋最多，共有36 468個非重復(fù)序列基因獲得了注釋，占總數(shù)的93.26%；其次是Pfam數(shù)據(jù)庫，共有 33 716 個非重復(fù)序列基因獲得了注釋，占比86.22%。而CAZy數(shù)據(jù)庫注釋量最少，僅有2 551個非重復(fù)序列基因獲得了注釋，僅占總數(shù)的6.52%。

2.2.3 樣本相關(guān)性分析

樣本相關(guān)性分析結(jié)果（圖2）顯示，同組樣本的基因表達(dá)模式相似，并且相關(guān)系數(shù)均為1.00。PL、PBL3與PBL9之間的相關(guān)系數(shù)均在0.82～0.83之間，而PL與PBL3之間的相關(guān)系數(shù)在0.90～0.92之間（圖2-a）；主成分分析結(jié)果顯示，第1和第2主成分總解釋度為96.32%。這意味著3組樣本之間相互獨(dú)立，生物學(xué)重復(fù)的結(jié)果良好（圖2-b）。

2.2.4 差異表達(dá)基因分析

以差異倍數(shù)（fold change）≥2且P_adj（由Benjamin校正的P值）≤0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，PBL3較PL共篩選出12 700個差異表達(dá)基因（DEG），其中包含10 840個上調(diào)表達(dá)基因和1 860個下調(diào)表達(dá)基因。PBL9較PL共篩選出22 257個差異表達(dá)基因（DEG），其中包含 19 565 個上調(diào)表達(dá)基因和2 692個下調(diào)表達(dá)基因（表3）。

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集，PBL3較PL共有7 683個基因顯著富集于59個功能類。其中，富集差異基因數(shù)最多的功能類為細(xì)胞（6 123個）、細(xì)胞部分（6 106個）和細(xì)胞進(jìn)程（5 164個）。生物學(xué)過程亞類的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞進(jìn)程（5 164個）、代謝反應(yīng)（4 369個）和應(yīng)激反應(yīng)（1 665個）。細(xì)胞組分亞類的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞（6 123個）、細(xì)胞部分（6 106個）和細(xì)胞器（4 475個）。分子功能亞類的差異表達(dá)基因主要富集在結(jié)合（4 560個）、催化活性（4 354個）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（733個）（圖3-a）。PBL9 較PL共13 407個基因顯著富集于61個功能類，富集差異基因數(shù)最多的功能類為細(xì)胞（10 872個）、細(xì)胞部分（10 836個）和細(xì)胞進(jìn)程（9 282個）。生物學(xué)過程亞類的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞進(jìn)程（9 282個）、代謝過程（7 831個）和生物調(diào)節(jié)（2 827個）。細(xì)胞組分亞類的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞（10 872個）、細(xì)胞部分（10 836個）和細(xì)胞器（8 191個）。分子功能亞類的差異表達(dá)基因主要富集在結(jié)合（7 871個）、催化活性（7 605個）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（1 314個）（圖3-b）。

對差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，圖4展示差異表達(dá)基因顯著性P值最小的前13～15個通路。PBL3較PL富集結(jié)果（圖4-a）顯示，差異基因數(shù)量排名前三的通路依次為核糖體（439個）、碳代謝（303個）和氨基酸的生物合成（255個）；富集顯著性排名前3的通路依次為核糖體（439個）、氧化磷酸化（194個）和檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）（96個）。PBL9較PL富集結(jié)果（圖4-b）顯示，差異基因排名前3的通路依次為核糖體（732個）、碳代謝（538個）和氨基酸的生物合成（475個）；富集顯著性排名前3的通路依次為核糖體（732個）、氧化磷酸化（322個）和氨基酸的生物合成（475個）（圖 4-b）。這些富集結(jié)果表明灰霉病對紫斑牡丹造成了復(fù)雜的分子生物學(xué)影響。

2.3 代謝組學(xué)分析

2.3.1 代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析

代謝組數(shù)據(jù)表明，在PL、PBL3、PBL9 3組樣品中共鑒定出1 109個代謝產(chǎn)物。主成分分析結(jié)果（圖5）顯示，所有組別都位于各自的95%置信區(qū)間內(nèi)，且第1主成分和第2主成分的總計(jì)解釋度達(dá)到了54.6%，表明各樣本之間表現(xiàn)出顯著的分離趨勢，說明不同侵染時期的灰霉病對次生代謝產(chǎn)物的累積產(chǎn)生了明顯的影響。

2.3.2 差異代謝物的篩選

經(jīng)過多維標(biāo)準(zhǔn)［變量重要性投影值gt;1、差異倍數(shù)（FC）gt;1.5或FClt;0.6且顯著性P值lt;0.05］為條件的差異代謝物篩選，在PBL3較PL比較組中檢測到67個差異代謝物，在PBL9較PL比較組中檢測到136個差異代謝物（圖6-a、圖6-b）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PBL3較PL比較組中特有差異代謝物21種，而PBL9較PL比較組中特有差異代謝物90種，相同的差異代謝物有46種（圖6-c）。這些結(jié)果表明，在染病各階段，代謝物的表達(dá)情況存在顯著差異，并且隨著時間的推移，差異代謝物的數(shù)量呈增加趨勢。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究該疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。

2.3.3差異代謝物分析

依據(jù)每個差異代謝物的相對含量生成了差異代謝物的聚類熱圖。結(jié)果（圖7）顯示，PBL3較PL比較組中檢測到差異代謝物可分為52種上調(diào)和15種下調(diào)（圖7-a）。而PBL9較PL比較組中檢測到差異代謝物則包括92種下調(diào)和44種上調(diào)差異代謝物（圖7-b）。這些差異代謝物主要包括有機(jī)酸類、黃酮類、脂質(zhì)、萜類等（圖7-c、圖7-d）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明了差異代謝物在比較組之間的聚類模式明顯不同，也為進(jìn)一步研究灰霉病染病的代謝調(diào)控機(jī)制提供了重要線索。

2.3.4 差異代謝物通路分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行通路注釋，發(fā)現(xiàn)PBL3較PL組匹配到35條通路，而PBL9較PL組匹配到43條通路。在PBL3較PL組中，主要富集在各種氨基酸的生物合成與代謝，富集評價居前3位的通路有丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝及氨基酸的生物合成、2-氧代羧酸代謝（圖8-a）。而在PBL9較PL組中，主要富集在各種次生代謝物的生物合成與代謝，富集評價居前3位的通路有黃酮和黃酮的生物合成、賴氨酸降解及丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝（圖8-b）。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了不同比較組之間代謝物通路的差異，這些通路的富集可能與灰霉病的發(fā)展和進(jìn)展過程密切相關(guān)。

2.4 轉(zhuǎn)錄組與代謝組關(guān)聯(lián)分析

為了更好地了解紫斑牡丹葉片受侵染后基因與代謝物之間的關(guān)系，將差異基因和差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析。結(jié)果（圖9）顯示，PBL3較PL差異組分在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（ko00250）、氨基酸的生物合成（ko01230）、2-氧代羧酸代謝（ko01210）等通路中顯著富集（圖9-a）；PBL9較PL差異組分在碳代謝（ko01200）和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（ko00250）等通路中顯著富集（圖9-b）。顯著性富集通路結(jié)果表明，在氨基酸的生物合成通路上，PBL3較PL注釋得到最多的差異基因（486個）和差異代謝物（3個）；在碳代謝通路上，PBL9較PL注釋得到最多的差異基因（795個）和差異代謝物（4個）。PBL3較PL及PBL9 較PL均在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路上被顯著富集（表4）。將PBL3較PL及PBL9較PL組的差異組分注釋到共有通路及其相關(guān)通路中，結(jié)果顯示上調(diào)基因數(shù)多于下調(diào)基因數(shù)，而在PBL9相對于PBL3中，同一基因或代謝物的表達(dá)模式上下調(diào)更為明顯（圖10）。

3 討論

經(jīng)過病害侵染后，葉片表觀形態(tài)均發(fā)生了明顯變化，葉綠素參數(shù)下降，光合作用被抑制或直接被破壞^［31］。從病害侵染第1階段到第3階段，葉片逐漸褪綠變黃，表明病菌可能阻礙了葉綠體合成或促進(jìn)了葉綠體降解的過程，導(dǎo)致總?cè)~綠素含量隨病害侵染時間增加而逐漸降低，嚴(yán)重影響葉片的光合作用，最終造成葉片發(fā)黃、焦枯^［32］。而施用誘抗劑后葉綠素含量顯著增加^［33］。病害侵染的第2階段開始出現(xiàn)葉片邊緣（尖端）的病變，然后發(fā)展到第3階段侵害葉片內(nèi)部。推測葉片邊緣首先發(fā)病的主要原

因是環(huán)境濕度過大，導(dǎo)致葉片邊緣結(jié)露。其中，葉尖結(jié)露時間最長，這就導(dǎo)致紫斑牡丹灰霉病一般從葉尖向內(nèi)擴(kuò)展的發(fā)病規(guī)律^［34］。因此，控制環(huán)境濕度對預(yù)防灰霉病的發(fā)生具有重要作用^［35-36］。

聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)是逆境脅迫研究中常用的分析方法^［37-38］。通過對灰霉病侵染后的月季進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組及代謝組分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在蛋白質(zhì)類物質(zhì)的合成、蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路^［39］。本研究利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組對灰霉病脅迫下紫斑牡丹的葉部基因表達(dá)和代謝物含量進(jìn)行了分析，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明PL與PBL3的組間相關(guān)系數(shù)高于PL與PBL9，代謝組結(jié)果表明在PCA中PL與PBL3的組間距離較PL與PBL9近，這表明轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)的分析結(jié)果一致，即受灰霉病脅迫后的基因表達(dá)水平和代謝物變化與脅迫時間長短相關(guān)。

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，PBL9較PL組的差異基因數(shù)約為PBL3較PL組的1.75倍。這些差異基因主要富集在核糖體、碳代謝和氨基酸的生物合成通路上。值得注意的是，PBL9較PL組在以上通路富集的差異基因數(shù)量也均高于PBL3較PL組。這表明，在灰霉病的發(fā)生過程中，對細(xì)胞生理活動的影響起主導(dǎo)作用，與差異基因GO富集分析的結(jié)果一致。隨著病原體的侵染積累，新陳代謝紊亂逐漸發(fā)生，最終導(dǎo)致大面積病斑的暴發(fā)^［40］。

代謝組分析結(jié)果表明，病害后葉片差異代謝物主要為有機(jī)酸類和黃酮類物質(zhì)。這是因?yàn)椴『?dǎo)致植物產(chǎn)生大量有害活性氧，而有機(jī)酸和黃酮類物質(zhì)具有清除活性氧的能力，并且有機(jī)酸還能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡，維持細(xì)胞代謝，從而對抗脅迫^［41-42］。值得注意的是，PBL3較PL組之間上調(diào)化合物是下調(diào)化合物的3.47倍，而PBL9較PL組之間下調(diào)化合物是上調(diào)化合物的2.09倍。這可能是由于早期植物為了應(yīng)對脅迫而上調(diào)積累了大量次生代謝物質(zhì)，而后期葉片組織受到了嚴(yán)重脅迫，導(dǎo)致代謝物質(zhì)明顯下調(diào)。這一后期代謝結(jié)果與在逆境脅迫下對裸燕麥的氨基酸代謝進(jìn)行的研究結(jié)果^［43］相似。差異基因及差異代謝物映射結(jié)果顯示，它們在KEGG通路圖上并不成正比分布，表明并非所有差異表達(dá)基因都對代謝通路進(jìn)行調(diào)控^［44］。差異基因和差異代謝物顯著富集到基礎(chǔ)代謝通路，包括碳代謝及2-氧代羧酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝及氨基酸的生物合成，這表明病原微生物通過干擾植物的能量代謝和物質(zhì)代謝，對植物生長、光合作用、氧化應(yīng)激等產(chǎn)生威脅，導(dǎo)致葉片褪綠、營養(yǎng)狀態(tài)紊亂等現(xiàn)象，從而破壞植物體內(nèi)生理生化平衡和基礎(chǔ)代謝功能。

谷氨酸是植物在滲透脅迫下合成脯氨酸的主要途徑之一，它可以清除活性氧并減少氧化脅迫。此外，谷氨酸還可以作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過降低細(xì)胞滲透勢來減少水分流失^［45-47］。琥珀酸也是植物在逆境脅迫下體內(nèi)積累的一種氨基酸^［48］。試驗(yàn)結(jié)果表明，谷氨酸合酶基因（GLT1）在PBL3組和PBL9組中均顯著上調(diào)，但只有PBL3組中谷氨酸含量顯著上調(diào)。PBL3組琥珀酸半醛脫氫酶（SSADH）基因顯著下調(diào)，而PBL9組琥珀酸半醛脫氫酶（GabD）基因顯著上調(diào)。2組4-氨基丁酸酯氨基轉(zhuǎn)移酶基因（puuE）均顯著上調(diào)，但只有PBL9組中琥珀酸含量顯著上調(diào)。先前的研究表明，4-氨基丁酸可以抑制植物病害^［49］。造成谷氨酸和琥珀酸在2組中變化結(jié)果不同的原因可能是PBL3組在低病害脅迫下產(chǎn)生更多谷氨酸，而PBL9組在高病害脅迫時則優(yōu)先產(chǎn)生更多琥珀酸，主要用于促進(jìn)檸檬酸循環(huán)，為植物提供能量。因此，可以推測谷氨酸、琥珀酸及4-氨基丁酸等抗逆因子含量變化程度會隨著病害侵染時間的不同而有所差異。谷氨酸通過glnA、glmS的作用生成葡萄糖胺-6-磷酸，在PBL3和PBL9組中均有顯著的上調(diào)表達(dá)，與橡膠樹受到脅迫后的表達(dá)模式相同^［50］。葡萄糖胺-6-磷酸在細(xì)胞壁合成過程中發(fā)揮著重要作用^［51］。盡管glmS有顯著上調(diào)表達(dá)，但葡萄糖胺-6-磷酸顯著下調(diào)可能是由于受病害脅迫后，細(xì)胞壁作為生物體外層結(jié)構(gòu)組織首先受到損害，植物可能會通過利用葡萄糖胺-6-磷酸來合成細(xì)胞壁以對抗脅迫。同時，病原微生物也可以通過侵染從植物體內(nèi)獲取氨基葡萄糖-6-磷酸等物質(zhì)來支持自身的生長，最終導(dǎo)致葡萄糖胺-6-磷酸在這2個階段中都有顯著的下調(diào)。

植物受到生物脅迫時誘導(dǎo)大量有效的防御機(jī)制，其中包括改變檸檬酸循環(huán)水平以增強(qiáng)植物的抗性^［52］。在紫斑牡丹受病害脅迫后，PBL3組和PBL9組在檸檬酸循環(huán)通路中，檸檬酸合成酶（CS）、順烏頭酸酶（ACO）、異檸檬酸脫氫酶（IDH1、IDH2）、氧戊二酸脫氫酶（OGDH）、二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（DLST）、琥珀酰輔酶A合成酶（LSC1）、琥珀酸脫氫酶（SDHA）、延胡索酸酶C（fumC）、蘋果酸脫氫酶2（MDH2）等基因表達(dá)均顯著上調(diào)。盡管檸檬酸循環(huán)過程中的各有機(jī)酸含量變化不顯著，但這與燕麥葉片在鹽脅迫下體內(nèi)有機(jī)酸含量變化^［53］相似。

此外，病害侵染后丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路中的大部分基因均表現(xiàn)出顯著上調(diào)的表達(dá)趨勢，例如控制丙氨酸乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶（AGXT）、腺苷酸琥珀酸合成酶（purA）、精氨琥珀酸裂解酶（argH）、精氨琥珀酸合酶（argG）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（GOT2）、谷氨酸脫氫酶（GDH2）等的合成基因顯著上調(diào)，類似的結(jié)果也出現(xiàn)在陸地棉受病害侵染的早期研究中^［54］。丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸通過AGXT、purA、argH、argG、GOT2、GDH2、谷氨酸脫羧酶（GAD）、puuE、SSADH等基因上調(diào)生成丙酮酸、延胡索酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸和琥珀酸等代謝產(chǎn)物，直接或間接促進(jìn)檸檬酸循環(huán)，從而刺激植物的防御機(jī)制^［52］。

4 結(jié)論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析，首次揭示了在灰霉病脅迫下的代謝響應(yīng)途徑?；颐共∶{迫致使紫斑牡丹葉片表觀形態(tài)、基因表達(dá)和代謝物含量發(fā)生顯著變化，并涉及多個代謝途徑。紫斑牡丹可能通過增加谷氨酸和琥珀酸等抗逆因子的代謝，以及合成4-氨基丁酸來對抗病害脅迫。同時，檸檬酸循環(huán)通路中的基因也被廣泛激活，提高能量代謝效率，為抵抗病害脅迫提供更多能量。這些結(jié)果為理解紫斑牡丹在灰霉病脅迫下的代謝響應(yīng)途徑提供了新的理論依據(jù)。

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