文艷玲　羅葆明　智　慧　馮　霞　楊海云　梁碧玲

【摘要】 目的 本研究在大鼠Walker 256實體瘤射頻消融術(shù)（RFA）后應(yīng)用不同腫瘤抗原致敏的DC瘤苗，探討其對大鼠抗腫瘤免疫的不同影響。方法 38只荷Walker 256實體瘤SD大鼠隨機(jī)分成3組：對照組行RFA治療，實驗組1行RFA＋凍融抗原致敏DC治療，實驗組2行RFA＋熱休克凍融抗原致敏DC治療。治療前及治療后第4天分別測量各組大鼠外周血中CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD8+ T淋巴細(xì)胞及CD4+ /CD8+比值，記錄大鼠的荷瘤生存期。結(jié)果 治療后各組荷瘤大鼠外周血中CD8+T細(xì)胞均呈下降改變，其中，下降的程度為實驗組2>實驗組1>對照組（P<0．05）；CD4+/CD8+比值的變化，實驗組2的升高與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0．05)；實驗組1的升高與對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。荷瘤生存期：實驗組2>實驗組1>對照組（P<0．05）。 結(jié)論 在RFA后應(yīng)用不同抗原致敏的DC可不同地程度改善大鼠的抗腫瘤免疫，凍融熱休克抗原致敏DC較未熱休克凍融抗原致敏DC能更有效地激發(fā)荷瘤大鼠的抗腫瘤免疫機(jī)能。

【關(guān)鍵詞】樹突狀細(xì)胞；射頻消融；免疫お

Immunological influence of different pulsed dendritic cells on rats after radiofrequency ablation

WEN Yan-Ling, LUO Bao-Ming, ZHI Hui, et al.

Department of Ultrasound, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangdong 510120， China

【Abstract】 Objective Dendritic cell (DC) lose the nomal function in tumor host. The tumor-antigen pulsed DCs obtained in vitro can effectively improve the immulogical state. The purpose of this study is to invest the immunological influence of different pulsed dendritic cells (DCs) on rats after radiofrequency ablation (RFA) of the tumor.Methods 38 rats with Walker 256 solid tumor were divided into four groups: control groupwas treated with RFA only; experimental group 1was treated with un-heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs after RFA; experimental group 2was treated with heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs after RFA. Before treatment and 4 days after treatment, the CD4+ T cell and CD8+ T cell were checked with cytometric analysis, and CD4+/CD8+ were evaluated. The suvival duration of the rats were recorded. Results After treatment, For the degree of the decrease of CD8+ T cell, there were significant difference between the different group with the degree of group 2 > group 1 > control (P<0．05). The survival duration of the rats in group 2 is the longest and then that of group 1 (P<0．05). Conclusion Using different antigen-pulsed DCs can improve the antitumor immunological function of the rats after RFA. Heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs can more effectively do that than un-heat-shocked freeze-thraw antigen pulsed DCs.

【Key words】Dendritic cell; Radiofrequency ablation; Immunology

在腫瘤治療當(dāng)中進(jìn)一步激發(fā)、增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的主動免疫反應(yīng)，有可能在延緩腫瘤生長、殺滅體內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶或殘留癌細(xì)胞、防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面起到重要的作用^[1-2]。樹突狀細(xì)胞（DCs）是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，具有強(qiáng)大的激活初始型T細(xì)胞的能力，是目前腫瘤免疫治療的研究熱點之一。本研究在荷瘤大鼠實體瘤經(jīng)射頻消融（RFA）治療后應(yīng)用不同抗原致敏的DC瘤苗，旨在探討不同的DC瘤苗對荷瘤大鼠抗腫瘤免疫機(jī)能的影響。

1 資料與方法

1．1 實驗動物及實體瘤模型的制備

1．1．1 實驗動物 SD大鼠38只，體質(zhì)量80~100 g，雌雄不限，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1．1．2 實體瘤模型的制備 將Walker 256細(xì)胞（購自第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院）懸液注入大鼠腹腔，約7 d后獲得大鼠Wakler 256腹水型腫瘤模型；抽取約1 ml 腹水（血性為佳）注入大鼠右側(cè)腋窩皮下，5 d后獲得大鼠Walker 256實體瘤模型。

1．1．3 實驗分組 將成瘤大鼠隨機(jī)分成3組： 對照組（n =10），行RFA治療；實驗組1（n =10），行RFA＋凍融抗原致敏DC治療；實驗組2（n=18），行RFA＋熱休克凍融抗原致敏DC治療。

1．2 DC瘤苗的制備

1．2．1 DC的培養(yǎng)及鑒定 斷頸處死大鼠后，以75 ％酒精浸泡10 mim，取大鼠后腿股骨及脛骨，PBS液沖洗骨髓腔，經(jīng)離心及紅細(xì)胞裂解液等處理分離獲骨髓單核細(xì)胞，培養(yǎng)液加入細(xì)胞因子rGM-CSF 5 ng/ml和IL-4 5 ng/ml（R＆D 公司），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天進(jìn)行半量換液。收集培養(yǎng)8 d的DC行Giemsas染色光鏡下觀察；同時收集DC進(jìn)行流式細(xì)胞免疫學(xué)檢測表面特異性抗原OX6、OX62和細(xì)胞因子CD86、CD80。

1．2．2 DC瘤苗的制備和檢驗 Walker 256細(xì)胞株離心后42 ℃溫浴1 h（熱休克）,反復(fù)凍融，或未經(jīng)熱休克處理的Walker 256 細(xì)胞反復(fù)凍融后，離心，取上清，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩C培養(yǎng)第7 天加入預(yù)先制備的腫瘤抗原，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天收集。體外進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗和MTT法淋巴細(xì)胞殺傷試驗。

1．3 實驗方法

1．3．1 治療 10%水合氯醛腹腔注射（0．25 ml/100 g體質(zhì)量）麻醉大鼠，冷循環(huán)射頻治療系統(tǒng)（Radionics Co． 美國）治療實體瘤，發(fā)射功率60 W，治療時間2 min。治療后于實體瘤旁皮下分別注入不同DC，注射細(xì)胞數(shù)為1×106個，單純射頻組同樣方法注入等量生理鹽水。

1．3．2 觀察指標(biāo) 治療前及治療后第4天分別測量各組大鼠外周血中CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD8+ T淋巴細(xì)胞及CD4+ /CD8+比值，記錄大鼠荷瘤生存期。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果均采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，以 Log-rank test 進(jìn)行組間比較，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

骨髓來源大鼠DC培養(yǎng)8 d 后收集，Giemsas染色可見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面具有DC的特征性突起，流式細(xì)胞儀檢測：經(jīng)凍融抗原致敏DC其OX6+表達(dá)率為78．25％、OX62+表達(dá)率為86．36％，CD80⁺為61．52％，CD86+為69．08%。經(jīng)熱休克凍融抗原致敏DC其OX6+表達(dá)率為86．24％、OX62+表達(dá)率為92．17％，CD80⁺為70．16％，CD86+為86．21%。

混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗表明DC可以誘導(dǎo)同種異體淋巴細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖，其中熱休克凍融抗原致敏DC瘤苗的作用明顯高于未熱休克凍融抗原致敏DC（P<0．05）；同時，DC瘤苗能誘導(dǎo)有效的CTL反應(yīng)，其中熱休克凍融抗原致敏DC組的細(xì)胞毒作用較強(qiáng)，與凍融抗原致敏DC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．05）。

腋下接種5 d后大鼠實體瘤二維超聲顯示為低回聲結(jié)節(jié)，邊界清，長徑平均約9．47 mm；治療前各組大鼠實體瘤體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。

治療前后各組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及CD4+/CD8+比值的變化見表1。實驗組2外周血CD4+T細(xì)胞的升高較實驗組1及對照組顯著（P<0．05）；實驗組1外周血CD4+T細(xì)胞的升高較對照組比稍明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）；治療后各組荷瘤大鼠外周血中CD8+T細(xì)胞均呈下降改變，其中，下降的程度為實驗組2>實驗組1>對照組（P<0．05）；CD4+/CD8+比值的變化，實驗組2的升高與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．05）；實驗組1的升高與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0．05）。

大鼠荷瘤生存期：對照組：（9．0±1．4）d，實驗組1：（13．1±2．8）d，實驗組2：（16．6±5．4）d。實驗組2>實驗組1>對照組（P<0．05）。

3 討論

DCs的功能失常在腫瘤對宿主的免疫逃避中起重要作用，通過體外途徑獲得功能正常的DCs并應(yīng)用于治療是當(dāng)前生物治療的研究熱點之一。既往的研究當(dāng)中，利用各種技術(shù)在體外培養(yǎng)并獲得對特殊抗原致敏的DC瘤苗，該類DCs瘤苗在回輸體內(nèi)后，能有效地刺激機(jī)體的T細(xì)胞增殖，從而在惡性黑色素瘤、肝癌等腫瘤的治療中取得了一定的療效^[3-4]。其中采用全腫瘤細(xì)胞凍融產(chǎn)物在體外致敏DC因其含腫瘤抗原全面，無須知道特殊的抗原表位，成功地制備了能刺激T淋巴細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL應(yīng)答的DC瘤苗^[5]。

熱休克蛋白（heat shock protein， HSP）是一組特殊的腫瘤抗原，此組蛋白具有較強(qiáng)的抗原性，能被DCs表面的特殊HSP受體和MHC-I類分子識別并遞呈給T淋巴細(xì)胞，從而強(qiáng)烈地刺激DCs成熟并誘發(fā)特異而強(qiáng)大的抗腫瘤免疫^[6]，本研究結(jié)果表明，由經(jīng)熱休克處理的凍融腫瘤抗原致敏DCs后，DC表面特異性抗原和MHC分子的表達(dá)上調(diào)，并可以進(jìn)一步激發(fā)DCs的免疫功能，從而誘導(dǎo)出了較單純凍融腫瘤抗原致敏DCs更強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)和特異性CTL應(yīng)答。

近年，RFA在肝腫瘤等方面的應(yīng)用取得了較好的近期和中遠(yuǎn)期療效，在RFA治療過程中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)熱效應(yīng)和空化效應(yīng)的作用發(fā)生凝固性壞死并導(dǎo)致腫瘤抗原暴露的增加和大量熱休克蛋白的產(chǎn)生，從而可以在一定程度上刺激機(jī)體的抗腫瘤免疫機(jī)能^[2]。本研究中熱休克凍融抗原致敏DC瘤苗在抗原處理過程中進(jìn)行了熱休克處理，模擬RFA治療過程腫瘤蛋白變性的過程；在RFA治療后使用經(jīng)熱休克凍融抗原致敏的DC可特異性識別熱休克蛋白并將之遞呈給T淋巴細(xì)胞，從而激發(fā)出較單純凍融抗原致敏DC更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

在T淋巴細(xì)胞群中，CD4+T輔助細(xì)胞參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，并對B淋巴細(xì)胞的活化增殖具有重要輔助作用，同時在調(diào)節(jié)記憶性CD8+T細(xì)胞的分化增殖中起重要輔導(dǎo)作用；而在腫瘤機(jī)體中，CD8+T細(xì)胞可以通過與DC的直接接觸改變DC共刺激分子的表達(dá)或通過分泌IFN-γ、IL-6、IL-10等而發(fā)揮免疫抑制作用。多項對腫瘤患者外周血的研究表明^[7-8]，腫瘤機(jī)體中CD4+T輔助細(xì)胞明顯下降，而CD8+T細(xì)胞比例異常升高，CD4+/CD8+比值顯著低于正常機(jī)體。本研究結(jié)果表明RFA治療后應(yīng)用DC瘤苗能有效地刺激荷瘤大鼠外周血CD4+T細(xì)胞的上升、CD4+/CD8+比值的上升、以及CD8+T細(xì)胞的下降，其中經(jīng)熱休克凍融抗原致敏DC瘤苗較單純凍融抗原致敏DC瘤苗效果更顯著（P<0．05），而該組大鼠實體瘤的生長速度明顯減慢，荷瘤大鼠生存期顯著延長，提示經(jīng)熱休克凍融抗原致敏DC瘤苗在改善機(jī)體免疫狀態(tài)，延緩腫瘤生長中較單純凍融抗原致敏DC具有更好的作用。

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