馬紅霞,周運(yùn)恒,范列英,安玉會(huì)

1)同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗(yàn)科上海 200120 2)武警上?？傟?duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科上海 201103 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 鄭州 450001

△女,1975年11月生,碩士,主管技師,研究方向:老年癡呆的分子生物學(xué)及藥物治療,E-mail:mahx2004@126.com

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以老年斑、神經(jīng)細(xì)胞纖維纏結(jié)和神經(jīng)細(xì)胞丟失為主要病理改變[1],其病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前尚缺乏有效的治療手段。神經(jīng)肽是具有神經(jīng)信息傳遞和調(diào)控作用的一類物質(zhì),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布廣泛,參與機(jī)體多種功能的調(diào)節(jié)。An等[2-3]從牛腦組織中首次分離出一種新的酸性牛神經(jīng)肽,并發(fā)現(xiàn)其可通過增加腦內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,提高腦內(nèi)抗氧化能力,減少腦內(nèi)一氧化氮(NO)的生成,改善腦內(nèi)能量代謝障礙,對(duì)血管性癡呆模型小鼠和 AD模型大鼠有良好的治療效果。作者觀察了酸性肽對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(Sigma公司),乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(北京中生北控公司),MTT(Sigma公司),二甲基亞砜、胰酶和多聚賴氨酸(Sigma公司),臺(tái)盼藍(lán)(鄭州陽(yáng)光公司), DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),胎牛血清(鄭州真科生物有限公司)。

1.2 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定[4-5]取出生后2 d內(nèi)的SD大鼠(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),無菌條件下斷頭取出大腦皮質(zhì)部分,投入PBS中,仔細(xì)剔除中腦、嗅球、海馬、腦膜及毛細(xì)血管等結(jié)構(gòu),進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。取第 2代的星形膠質(zhì)細(xì)胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞,接種于預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上,3 d后,先用 0.01 mol/L PBS漂洗,再用PBS配制的40 g/L多聚甲醛固定,經(jīng)含體積分?jǐn)?shù)3%H2O2和體積分?jǐn)?shù)10%甲醇的0.01mol/LPBS處理后,按照免疫細(xì)胞化學(xué)ABC染色方法進(jìn)行GFAP抗血清(工作濃度為1:500)反應(yīng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及樣品的制備 將純化培養(yǎng)的第 2代星形膠質(zhì)細(xì)胞用2.5 g/L的胰酶消化成單細(xì)胞懸液,以 5×105mL-1接種于 12孔培養(yǎng)板中,每孔 1 m L。實(shí)驗(yàn)分 5組,每組設(shè) 7個(gè)復(fù)孔。無血清組(只加培養(yǎng)基不加血清)、胎牛血清對(duì)照組(加入含體積分?jǐn)?shù) 20%的胎牛血清)、酸性肽低、中及高劑量組(分別加入37.5、75.0及150.0mg/L的酸性肽),分別培養(yǎng) 24、48及 72 h。實(shí)驗(yàn)終止后,分別將上清液移入無菌的EP管中,1 000 r/m in離心5 min,再將上清液分別移入另一無菌EP管,-20℃冷藏待測(cè)。底層細(xì)胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后用PBS配制成相同體積的細(xì)胞懸液。

1.4 細(xì)胞存活率檢測(cè) 用玻棒蘸 1滴培養(yǎng) 24、48和 72 h的上述細(xì)胞懸液,每組 7個(gè)復(fù)孔,滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,計(jì)算總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞用PBS輕洗2次,每孔滴PBS配制的4 g/L臺(tái)盼藍(lán)溶液200μL,混勻,滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,3 min左右在倒置顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù) 400個(gè)相鄰細(xì)胞中藍(lán)染細(xì)胞(死亡細(xì)胞)個(gè)數(shù)。細(xì)胞存活率=[(總細(xì)胞數(shù)-藍(lán)染細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)]×100%。

1.5 細(xì)胞上清液LDH含量測(cè)定 采用日立7170全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組細(xì)胞上清液中 LDH的含量。

1.6 細(xì)胞增殖率的檢測(cè) 采用MTT法[6]。將純化培養(yǎng)的第2代星形膠質(zhì)細(xì)胞用 2.5 g/L的胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液,以 5×105mL-1接種于 96孔板,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞后,每孔加入20μL 5 g/L的MTT,然后再放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL,振蕩10min,以不加細(xì)胞培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔調(diào)零,酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm的吸光度值,每組8個(gè)復(fù)孔。增殖率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-對(duì)照組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 15.0處理數(shù)據(jù)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞存活率、增殖率及上清液中LDH含量的比較行單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及其鑒定 見圖1。

圖1 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞及其鑒定A:傳1代的星形膠質(zhì)細(xì)胞;B:星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定(免疫細(xì)胞化學(xué)ABC,×200)。

2.2 各組細(xì)胞存活率比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率比較(n=7) %

2.3 各組細(xì)胞上清液中LDH含量比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中LDH含量比較(n=7) U/L

2.4 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后增殖率比較 見表3。

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后增殖率的比較 %

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)有一種特異性的標(biāo)志蛋白GFAP。該實(shí)驗(yàn)中作者提取的神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫細(xì)胞染色鑒定證明其純度大于 95%,能夠達(dá)到研究的要求。

該研究結(jié)果顯示,培養(yǎng) 24、48及 72 h后酸性肽各組細(xì)胞存活率幾乎均高于相同條件的無血清組和胎牛血清對(duì)照組。培養(yǎng) 72 h后酸性肽各組細(xì)胞增殖率均高于無血清組和胎牛血清對(duì)照組,說明酸性肽對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。

LDH是一種胞內(nèi)酶,廣泛存在于各種組織細(xì)胞中,正常情況下釋放很少,病理情況下細(xì)胞膜通透性增高或完整性喪失時(shí),LDH漏出增加。因此,測(cè)定胞外LDH含量可以衡量細(xì)胞損傷的程度[7]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,酸性肽各組培養(yǎng)上清中的 LDH含量都明顯低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的胎牛血清對(duì)照組,說明酸性肽對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體積分?jǐn)?shù)20%的胎牛血清。

綜上所述,酸性肽對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有一定的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。

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