宮艷格,劉德夢(mèng)

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所,天津 300211)

尿道致病性大腸埃希菌是引起泌尿系統(tǒng)感染常見(jiàn)且重要的致病菌。黏附素在介導(dǎo)泌尿系統(tǒng)感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在目前發(fā)現(xiàn)的大腸埃希菌多種黏附素中,Afa/Dra家族黏附素中的 Dra黏附素與30%～50%膀胱炎、青年女性復(fù)發(fā)性泌尿系統(tǒng)感染密切相關(guān),攜帶Dra黏附素的大腸埃希菌有形成慢性和復(fù)發(fā)性感染的傾向[1,2]。2008年 7月～2009年7月,我們對(duì)大腸埃希菌Afa/Dra家族黏附素進(jìn)行研究,為大腸埃希菌的生物學(xué)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 尿道致病性大腸埃希菌及受體菌來(lái)源 收集我院近 1年反復(fù)發(fā)作性泌尿系統(tǒng)感染患者尿標(biāo)本中分離出的大腸埃希菌 50株,經(jīng)常規(guī)生化及血清學(xué)鑒定確定為尿道致病性大腸埃希菌。afa/draC基因陽(yáng)性對(duì)照菌株AAEC191A(pCC90)由美國(guó)華盛頓大學(xué) Steve Moseley教授惠贈(zèng),克隆受體菌 E.Coli DH5a由揚(yáng)州大學(xué)畜禽病原微生物研究室朱國(guó)強(qiáng)教授惠贈(zèng)。

1.1.2 PCR引物 afa-f:CGGCTTTTCTGCTG AACTGGCAGGC,afa-r:CCGTCAGCCCCCACGGCAG ACC[3]。引物序列由上海生物工程公司合成。

1.1.3 主要儀器及試劑 Mastercycler personal PCR儀(eppendorf公司),GELDOG-200型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)B IO-RAD公司),Taq DNA聚合酶 (大連TaKaRa生物工程公司)。選擇培養(yǎng)基為在LB固體培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素 (終濃度 100 mg/ml)、5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷 (X-gal,終濃度 40 mg/ ml)、異丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG,終濃度 24 mg/ml)制成,PCR產(chǎn)物純化試劑盒及 T(pUCm-T載體)-A克隆試劑盒(上海生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 ①煮沸法制備基因組 DNA。②PCR擴(kuò)增:10×PCR buffer 2.5 ml,dNTP 250 mmol/ ml,afa-f 30 pmol/L,afa-r 30 pmol/L,Taq DNA聚合酶 0.025 U/ml,DNA模板 2 ml,去離子水 16.875 ml。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃4 min,變性 94℃30 s,退火 53℃30 s,延伸 72℃1 min,共 30個(gè)循環(huán),延伸 72℃8 min,4℃保存。③PCR產(chǎn)物分析: 1%瓊脂糖凝膠電泳,如果出現(xiàn)明顯的 672 bp亮帶可能為陽(yáng)性菌株。

1.2.2 克隆 ①感受態(tài)細(xì)胞的制備:用 0.1 mmol/ L的 CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞。②純化:按照 PCR產(chǎn)物純化試劑盒步驟對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。③PCR產(chǎn)物與 T-載體連接反應(yīng)體系:1 ml 10×Ligation Buffer,1 ml 50%PEG,1 ml pUCm-T載體,2 ml純化后的 PCR產(chǎn)物,4 ml無(wú)菌水,1 ml T4 DNA Ligase。19℃水浴過(guò)夜。④轉(zhuǎn)化受體菌 E.ColiDH5a:取 8 ml PCR產(chǎn)物與 T-載體連接混合物至新制備的 100 μl感受態(tài)細(xì)胞中,冰上放置 30 min后迅速轉(zhuǎn)移至42℃水浴 1.5 min,冰上放置 5 min,加入 400 ml LB培養(yǎng)基,37℃下 250 r/min離心 60 min。⑤篩選重組子:將恢復(fù)正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化后細(xì)菌 4 000 r/min離心 5 min,棄上清 400 ml,利用剩余培養(yǎng)基重懸細(xì)菌后取 70 ml涂布于含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上,過(guò)夜培養(yǎng),觀察結(jié)果,白色菌落為陽(yáng)性重組子,藍(lán)色菌落為陰性重組子。⑥鑒定重組子:分別將白、藍(lán)色菌落接種于含有氨芐青霉素 (100 mg/ml)的 LB液體培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng) 16～18 h后,用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,并在 2%瓊脂糖凝膠上電泳分析,觀察兩種顏色細(xì)菌質(zhì)粒大小的差別,以所提取質(zhì)粒為DNA模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,并對(duì)白色菌落的質(zhì)粒及其 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果由上海生物工程有限公司提供。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增結(jié)果 有 20株菌瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)單一條帶基因片段,大小同陽(yáng)性對(duì)照菌的 afa/draC基因片段大小(672 bp)相符。

2.2 克隆結(jié)果 將以上陽(yáng)性菌株的 PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行 T-A克隆后篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出藍(lán)色、白色菌落。T-A克隆所用pUCm質(zhì)粒的大小為2 773 bp,克隆后質(zhì)粒的大小為 3 445 bp。白色菌落和藍(lán)色菌落的質(zhì)粒所在凝膠的位置分別與 3 445 bp和 2 773 bp的位置相符。

2.3 測(cè)序結(jié)果 以上述 20株 afa/draC基因片段的陽(yáng)性克隆菌的質(zhì)粒為模板的 PCR產(chǎn)物純化后送上海生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。與 GenBank AF329316.1的基因序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性對(duì)照菌pCC90的該段基因序列與 GenBank所示完全一致; 20株臨床分離株的 afa/draC基因序列與陽(yáng)性對(duì)照株 pCC90對(duì)比具有高度同源性 (大于 99%),其中分別存在 3～4處點(diǎn)突變,分別在第 284(2 837)、第308(2 861)、第 600(3 153)、第 620(3 173)位點(diǎn)。應(yīng)用 Primer Premier 5軟件,將菌株 E.Coli329 afa/ draC基因片段測(cè)序所得基因序列翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列并與標(biāo)準(zhǔn)菌株 pCC90的氨基酸序列比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的氨基酸部分發(fā)生改變,其中第 284(2 837)位點(diǎn) (G變?yōu)?T)與 第 308 (2 861)位點(diǎn)(T變?yōu)?C)的突變并沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變,而第 600(3 153)位點(diǎn) (T變?yōu)?C)與第 620(3 173)位點(diǎn) (C變成 G)的突變則分別導(dǎo)致氨基酸序列第 184位絲氨酸(Ser)被脯氨酸(Pro)取代,第 206位組氨酸 (His)變成谷氨酰胺 (Gln或Q)。

3 討論

Afa/Dra家族黏附素是大腸埃希菌的主要黏附素之一,在介導(dǎo)大腸埃希菌與宿主細(xì)胞之間的黏附過(guò)程中發(fā)揮重要作用。攜帶Dra黏附素的大腸埃希菌對(duì) HeLa細(xì)胞具有很強(qiáng)的侵襲力[4]。其特異性受體包括衰變加速因子、Ⅳ型膠原和癌胚抗原及癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子,該家族黏附素即通過(guò)與相應(yīng)特異性受體的結(jié)合而使細(xì)菌定植于表面并由細(xì)胞的內(nèi)攝作用進(jìn)入宿主細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)。該家族黏附素基因至少有 5個(gè)基因片段組成,其中 C基因長(zhǎng)2 580 bp,編碼引導(dǎo)蛋白,與周漿蛋白一起輔助黏附蛋白到達(dá)細(xì)菌表面 (即周漿—伴侶途徑)。鑒于afa/draC基因片段具有高度的同源性,故該實(shí)驗(yàn)針對(duì) afa/draC基因片段設(shè)計(jì)引物,并對(duì) PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行克隆子序列分析。

本試驗(yàn)從 50株臨床分離的尿道致病性大腸埃希菌中篩選出 20株 afa/draC基因陽(yáng)性菌,PCR擴(kuò)增后進(jìn)行克隆測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示臨床分離菌株的afa/draC基因序列與 GenBank及陽(yáng)性對(duì)照株 pCC90對(duì)比具有高度同源性,所測(cè)菌株均存在 3～4個(gè)點(diǎn)突變,由于該擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 (672 bp)只占 afa/draC全基因序列長(zhǎng)度 (2 580 bp)的 26.05%,據(jù)此推測(cè) afa/ draC全基因序列內(nèi)可能還存在其他位點(diǎn)突變。本次測(cè)序菌株的該基因片段突變位點(diǎn)高度一致,應(yīng)用Primer Premier 5軟件分析比對(duì)上述測(cè)序結(jié)果與所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的氨基酸部分發(fā)生改變。

由于上述基因片斷點(diǎn)突變的高度一致性及所對(duì)應(yīng)的氨基酸部分發(fā)生改變,推測(cè)大腸埃希菌 afa/ draC基因位點(diǎn)的突變極有可能由于地區(qū)差異所致的基因位點(diǎn)變異,這種變異可能不會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。但這一推測(cè)有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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