利用乳酸菌發(fā)酵桑樹葉生產(chǎn)非常規(guī)飼料的研究

王熙濤 何連芳 張玉蒼

隨著人民物質(zhì)生活水平的提高，對動物蛋白質(zhì)的需求量越來越大，因而促進了養(yǎng)殖業(yè)和飼料工業(yè)的迅速發(fā)展。但目前常規(guī)飼料資源的不足，必將制約畜牧業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展。據(jù)各方面研究預測，我國到21世紀30年代，人口將由13億增加到16億，糧食總產(chǎn)量由5億噸增長到7.2億噸，其實際用于飼料量將由2.0億噸增長到3.6億噸。到2030年，按16億人口人均日消費動物性蛋白質(zhì)25 g計算，屆時，全國至少約需消費1460萬噸飼用蛋白質(zhì)，其中尤其是賴氨酸、蛋氨酸等限制性氨基酸缺口更大。我國飼料工業(yè)和畜牧業(yè)要走可持續(xù)、穩(wěn)定、快速發(fā)展之路，必須重視非常規(guī)飼料資源的開發(fā)利用[1]。

桑樹屬?？疲∕oraceae）桑屬（Morus）的落葉喬木，是多年生深根性植物。桑樹對土壤酸堿度適應性較強，在pH值4.5～9.0范圍內(nèi)都能生長[2]。桑樹是目前木本葉用植物中產(chǎn)量最高的樹種之一,其營養(yǎng)成分高于一般牧草,是木本植物中含量較高的樹種。我國地域遼闊，氣候溫和，桑樹分布遍及全國，面積達到100萬公頃左右。農(nóng)民向來以桑葉只是作為蠶的飼料，少數(shù)地方當有桑葉剩余時，桑葉也用來飼養(yǎng)家畜和塘魚。隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，草地資源的減少，利用桑葉作為畜禽飼料已經(jīng)引起畜牧業(yè)生產(chǎn)者的重視。桑樹葉蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸、維生素、碳水化合物、微量元素等營養(yǎng)成分豐富，經(jīng)科學加工后是很好的全價畜禽飼料。蛋白質(zhì)中賴氨酸含量是衡量產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標。當食物中賴氨酸含量不足時，就會限制其它氨基酸的利用。研究表明在谷物糧食中加入1 g賴氨酸就相當于10 g可利用的蛋白質(zhì)。桑樹葉中賴氨酸含量較高，可代替精飼料，是理想的非常規(guī)飼料[3]。

乳酸菌是一種可以分解糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌，厭氧或者兼性厭氧生長。不耐高溫，經(jīng)80℃處理5 min，損失70%～80%。但耐酸，在pH值為3.0～4.5時仍可生長，對胃中的酸性環(huán)境有一定的耐受性。在動物體內(nèi)通過生物拮抗、降低pH值、阻止和抑制致病菌的侵入和定植，降解亞硝氨、氨、吲哚、糞臭素等有害物質(zhì)，維持腸道中正常的生態(tài)平衡，活菌體內(nèi)和代謝產(chǎn)物中含有較高的SOD，能增強體液免疫和細胞免疫。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在魚體腸道系統(tǒng)定植，可以抵抗革蘭氏陰性致病菌，增強抗感染能力，增加腸系膜的免疫調(diào)節(jié)活性，促進生長?？稍诓溉槠诤蛿嗳槠趧游镏惺褂肹4]。本試驗利用乳酸菌對桑樹葉進行發(fā)酵，通過研究原料組成、接菌量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度，無機氮源等因素對乳酸菌數(shù)量的影響，得出最佳工藝條件，生產(chǎn)出富含較多乳酸菌利于牲畜吸收消化的非常規(guī)生物飼料。

1 試驗材料

1.1 桑樹葉

大連工業(yè)大學資源開發(fā)利用研究所收集，產(chǎn)自云南自然風干的桑樹葉。

1.2 菌種

大連工業(yè)大學資源開發(fā)利用研究所實驗室保藏的乳酸菌。

1.3 其它原料

餐廚廢棄物、麩皮、玉米面、豆粕、尿素，均為市售。

2 測定方法

2.1 桑樹葉中營養(yǎng)成分的測定

水分(GB/T6435—94)、粗蛋白(GB/T6432—94)、粗脂肪(GB/T6433—94)、粗纖維(GB/T6434—94)、粗灰分(GB/T6438—94)、鈣(GB/T6436—94)。

2.2 菌數(shù)的測定

本試驗采用平板菌落計數(shù)法計算菌數(shù)含量，即通過不斷的稀釋手段使被分離的樣品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，培養(yǎng)一段時間后，計算平板上的菌落數(shù)量[5]。

3 試驗過程

3.1 桑樹葉成分分析

對桑樹葉主要成分進行分析，其結(jié)果如表1所示。

表1 桑樹葉主要營養(yǎng)成分(%)

從表1可以看出，桑樹葉營養(yǎng)成分豐富,粗蛋白、粗脂肪、粗纖維含量均較高,作為飼料有一定的利用價值，可與其它常規(guī)飼料混合使用。

3.2 發(fā)酵工藝流程

桑樹葉發(fā)酵生產(chǎn)微生物飼料的主要工藝流程如圖1所示。

圖1 桑樹葉固態(tài)發(fā)酵飼料工藝流程

3.3 菌數(shù)的檢測

平板菌落計數(shù)法是微生物菌數(shù)測定常用的基本方法,具有直觀性效果。將發(fā)酵后的飼料樣品稱取1 g,攪碎，于100 ml容量瓶中定容。在無菌室中將樣品不斷稀釋至最低的濃度梯度，取0.1 ml至已冷卻的倒入了麥芽汁培養(yǎng)基的平皿中，用涂布器涂均勻。然后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4 h觀察，待長出菌落后計數(shù)，并做平行試驗3組，取平均值（見圖2）。

3.4 試驗設(shè)計及結(jié)果分析

本試驗先將發(fā)酵原料與乳酸菌的初始發(fā)酵條件定為原料配比3：1、接菌量6%、發(fā)酵時間60 h、無機氮源添加量1.5%、發(fā)酵溫度34℃、pH值6，含水量80%。然后對每個因素單獨進行考察，進而確定單因素的最佳發(fā)酵條件。

3.4.1 發(fā)酵原料配比對乳酸菌生長數(shù)量的影響

選取常規(guī)飼料玉米面、豆粕、麩皮（比例為3：1.5：1）與粉碎過篩的桑樹葉混合，在初始條件下進行發(fā)酵，改變常規(guī)飼料與桑樹葉的比例，其配比對乳酸菌生長數(shù)量的影響如圖3所示，當常規(guī)飼料與桑樹葉比例為4：1時，乳酸菌的生長數(shù)量達到最大值，是發(fā)酵原料的最佳配比。

圖3 發(fā)酵原料配比對乳酸菌生長數(shù)量的影響

3.4.2 接菌量對乳酸菌生長數(shù)量的影響

接菌量對菌數(shù)影響如圖4所示。隨接菌量的增多，發(fā)酵后乳酸菌數(shù)量也逐漸升高，但是當接菌量高于8%時，發(fā)酵后菌數(shù)反而降低，因此接菌量在8%時最為適宜。

圖4 接菌量對乳酸菌生長數(shù)量的影響

3.4.3 發(fā)酵時間對乳酸菌生長數(shù)量的影響

發(fā)酵時間對菌數(shù)影響如圖5所示。菌種在60 h之前生長迅速，在60 h時達到最大值，之后數(shù)量逐漸遞減，84 h之后數(shù)量變化趨于平穩(wěn)。

圖5 發(fā)酵時間對乳酸菌生長數(shù)量的影響

3.4.4 無機氮源添加量對乳酸菌生長數(shù)量的影響

無機氮源對菌數(shù)影響如圖6所示。本試驗選取添加尿素作為無機氮源，從圖6可以看出，開始隨著尿素的增加，菌數(shù)也逐漸升高，在尿素添加量為2.0%時，菌數(shù)達到最大值，之后隨著尿素的進一步增加,菌數(shù)又逐漸降低，說明過量的無機氮源抑制了菌種的生長。

3.4.5 發(fā)酵溫度對乳酸菌生長數(shù)量的影響

圖6 無機氮源添加量對乳酸菌生長數(shù)量的影響

發(fā)酵溫度對乳酸菌生長數(shù)量影響如圖7所示，由圖7可知菌種生長的最適溫度是36℃。

3.4.6 pH值對乳酸菌生長數(shù)量的影響

發(fā)酵原料的pH值對菌數(shù)影響如圖8所示，由圖8可知菌種生長的最適pH值為5.5。

3.4.7 含水量對乳酸菌生長數(shù)量的影響

圖7 發(fā)酵溫度對乳酸菌生長數(shù)量的影響

圖8 pH值對乳酸菌生長數(shù)量的影響

圖9 含水量對乳酸菌生長數(shù)量的影響

原料中含水量對菌數(shù)影響如圖9所示。發(fā)酵時含水量在85%～100%變化時，對菌數(shù)影響相對較小，特別是在含水量大于90%之后，菌數(shù)無明顯變化，因此以含水量在90%時為宜。

3.5 正交試驗

為進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，在單因素基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接菌量、尿素添加量4個因素做4因素3水平（L934）正交試驗，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)計算各列極差R可知，影響發(fā)酵條件的主要因素為接菌量，其次是尿素添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度。最佳發(fā)酵條件為：接菌量9%，發(fā)酵時間60 h，尿素添加量2.0%，發(fā)酵溫度36℃。經(jīng)凱氏定氮法測定，此工藝條件下微生物飼料粗蛋白含量為29.56%，

4 結(jié)論

①桑樹葉營養(yǎng)成分豐富，蛋白質(zhì)含量較高，特別是含有必需氨基酸——賴氨酸，可取代部分常規(guī)飼料與乳酸菌一起發(fā)酵制備微生物飼料。

②在單因素試驗基礎(chǔ)上進行正交試驗，得出發(fā)酵的最佳工藝條件為：接菌量9%，發(fā)酵時間60 h，尿素添加量2.0%，發(fā)酵溫度36℃。

[1]吳萍，李龍.桑樹用作畜禽飼料的開發(fā)前景 [J].中國蠶業(yè)，2006，27：91-93.

[2]葉志毅,劉紅.利用桑樹葉資源發(fā)展畜牧業(yè)生產(chǎn)的可行性分析[J].中國畜牧雜志,2003,39(1):43-44.

[3]李勇,苗敬芝.桑葉的功能性成分及保健制品的開發(fā)[J].中國食物與營養(yǎng),1999(3):25.

[4]李維炯.微生態(tài)制劑的應用研究[M].北京：化學工業(yè)出版社，2008:65-70.

[5]劉國生.微生物學實驗技術(shù)[M].北京：科學出版社，2007:125-127.