彭立強(qiáng) 謝 云 任濤濤 陳五嶺

飼料添加劑是添加在飼料中的一種可食性物質(zhì)，以提高動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)水平及補(bǔ)充足夠的營(yíng)養(yǎng)。最初，飼料添加劑使用最普遍的主要是抗生素。但抗生素進(jìn)入動(dòng)物腸道后，除了殺死致病菌，還會(huì)破壞腸道正常菌群，致使動(dòng)物免疫力下降，而且抗生素還存在殘留和抗藥性等問(wèn)題。為此，抗生素在飼料中的使用受到了嚴(yán)格的限制。微生態(tài)制劑是一種新型飼料添加劑，又叫微生物飼料添加劑，它能很好地克服抗生素的不足。微生物飼料添加劑是以微生態(tài)調(diào)控理論為指導(dǎo)，利用動(dòng)物體內(nèi)正常微生物及其代謝產(chǎn)物或生長(zhǎng)促進(jìn)物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵、干燥、加工等特殊加工工藝制成的可直接飼喂動(dòng)物的活菌制劑。微生物飼料添加劑具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫功能、防治疾病、提高生產(chǎn)性能的作用，既能確保食品安全，改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)，又能減少畜禽排泄物的臭氣，改善養(yǎng)殖場(chǎng)生態(tài)環(huán)境。

作為微生物飼料添加劑的核心組成成分，微生物菌種的優(yōu)劣是決定后期發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品最終應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素。在菌種篩選過(guò)程中，應(yīng)著重考察其耐酸、耐膽鹽的能力，以及對(duì)胃腸道環(huán)境的抵抗能力。而此過(guò)程中活菌計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，決定著我們對(duì)試驗(yàn)菌耐受能力的判斷，關(guān)系到該微生物飼料添加劑的應(yīng)用價(jià)值。通常，活菌計(jì)數(shù)的方法主要是平板稀釋法、比濁法、菌體干重法等，但這些方法都不夠理想，存在諸如工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)、誤差大、不能區(qū)分死活細(xì)胞等缺點(diǎn)。本試驗(yàn)采用MTT比色法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。該方法是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將外源性的MTT還原為難溶性的紫藍(lán)色結(jié)晶物甲瓚(Formazan)，用二甲基亞礬將其溶解釋放，再用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD值，OD值的高低可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。MTT法簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好、能夠較準(zhǔn)確地區(qū)分死活菌體細(xì)胞。

目前公認(rèn)能作為微生態(tài)制劑的菌種包括：乳酸菌類、芽孢桿菌類、酵母類、霉菌類及光合細(xì)菌等。本文的目的是根據(jù)微生態(tài)理論，選用嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母作為試驗(yàn)菌株，研制能應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)高效的復(fù)合微生物飼料添加劑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌：嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），為本實(shí)驗(yàn)室自天津?qū)毜暇┴S養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病豬體內(nèi)分離鑒定的菌株。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

①嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基；②納豆芽孢桿菌培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；③釀酒酵母培養(yǎng)基：豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基；④指示菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2.2 主要試劑和儀器

豬膽鹽（上海源聚生物科技有限公司生產(chǎn)）；胃蛋白酶、胰蛋白酶(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供)；MTT（噻唑藍(lán)）(北京伯樂(lè)泰克生物有限公司生產(chǎn))；DMSO(二甲基亞礬)(上海菲達(dá)工貿(mào)有限公司和橋分公司生產(chǎn))；超凈工作臺(tái)(SXK-103)；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司生產(chǎn)）；多孔板分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀，BIO-RAD-550，美國(guó)生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的篩選活化及菌懸液的制備

①取出冷凍保藏的8株嗜酸乳桿菌經(jīng)MRS固體培養(yǎng)基連續(xù)活化3～4次后，分別測(cè)量pH值和活菌數(shù)，初篩出產(chǎn)酸和生長(zhǎng)較快的菌株，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水稀釋成菌數(shù)為107CFU/ml的菌懸液作為試驗(yàn)菌液A。

②納豆芽孢桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基中，活化3～4次，鏡檢后挑選生長(zhǎng)旺盛、芽孢產(chǎn)生正常的菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后用無(wú)菌生理鹽水稀釋為菌數(shù)107CFU/ml的實(shí)驗(yàn)菌液B。

③釀酒酵母先在豆芽汁蔗糖固體培養(yǎng)基活化3～4次，再接種到以淀粉為唯一碳源的平板上，根據(jù)透明圈大小，從中挑選淀粉酶活性最強(qiáng)的菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后制成的實(shí)驗(yàn)菌液C，菌數(shù)為107CFU/ml。

④大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，活化3～4次后，制成菌數(shù)為107CFU/ml的指示菌液D、指示菌液E。

1.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法，以大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌作指示菌，對(duì)試驗(yàn)菌株嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌的抑菌效果進(jìn)行檢測(cè)（釀酒酵母對(duì)腸道病原菌的抑制效果不明顯，在抑菌實(shí)驗(yàn)部分不予討論）。自指示菌液D、指示菌液E中分別取0.4 ml加入培養(yǎng)基中，加入15 ml放冷至50℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，作為菌層，置于37℃干燥冷卻30 min，待其充分凝固。在無(wú)菌條件下，將3個(gè)無(wú)菌不銹鋼牛津杯等距放置于培養(yǎng)基表面，分別吸取0.25 ml實(shí)驗(yàn)菌液A、實(shí)驗(yàn)菌液B和AB混合液（每個(gè)試驗(yàn)菌3個(gè)重復(fù)）37℃恒溫培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)量抑菌圈的直徑，計(jì)算其平均值。

1.3.3 耐酸實(shí)驗(yàn)

將上述實(shí)驗(yàn)篩選出的菌株活化后，分別以2%的接種量，依次接種于pH值為2.0、3.0、4.0、5.0的3種實(shí)驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基（MRS液體培養(yǎng)基、豆芽汁蔗糖液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基）中，37℃培養(yǎng)16 h，用MTT比色法測(cè)其活菌濃度。

1.3.4 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

初篩：將上述實(shí)驗(yàn)篩選出的3種菌株按點(diǎn)種法分別接入到對(duì)應(yīng)的3種固體培養(yǎng)基（加豬膽鹽0.3%）中，37℃恒溫培養(yǎng)3～4 d后觀察(重復(fù)3次)。挑選生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

復(fù)篩：在3種液體培養(yǎng)基中分別依次加入0.1、0.2、0.3、0.4 的豬膽鹽(w/v，%)，121 ℃滅菌 15 min。將初篩獲得的3種菌株接入上述已處理好的液體培養(yǎng)基中，同時(shí)接種不含豬膽鹽的培養(yǎng)基中作為對(duì)照。37℃，140 r/min搖床培養(yǎng)18 h，用MTT比色法測(cè)其活菌濃度。

1.3.5 人工模擬豬體胃腸道耐受性實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 人工胃液的耐受性實(shí)驗(yàn)

人工胃液的配制：NaCl 0.2%、胃蛋白酶0.35%，用1 N HCl調(diào)整pH值為3.0后，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后備用。

將試驗(yàn)菌液A、B、C以10%的接種量接入到人工胃液中，37℃、140 r/min搖床培養(yǎng)，以0 min時(shí)為對(duì)照，分別于 60、90、120 min取樣，MTT法測(cè)其活菌數(shù)，并計(jì)算存活率，重復(fù)3次取平均值。

1.3.5.2 人工腸液的耐受性試驗(yàn)

人工腸液的配制：將下述a液和b液以2：1混合即為人工腸液。

a胰腺液：NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、胰蛋白酶1%，調(diào)整pH值為3.0后，過(guò)濾除菌后備用。

b膽液：豬膽鹽1.2% ，調(diào)整pH值為8.0后，過(guò)濾除菌備用。

將試驗(yàn)菌液A、B、C以10%的接種量接入到模擬腸液中，37 ℃，140 r/min搖床培養(yǎng)，分別于 0、60、120、240 min取樣，MTT法測(cè)其活菌數(shù)，并計(jì)算存活率（重復(fù)3次，取平均值）。

1.4 分析方法

1.4.1 MTT法測(cè)活菌數(shù)

此法是通過(guò)檢測(cè)光密度值變化來(lái)間接反映菌體活細(xì)胞數(shù)量的變化，只有在一定細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，甲瓚生成量才與活細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)。因此，比色前必須對(duì)培養(yǎng)液中菌體濃度進(jìn)行處理：菌液濃度過(guò)低時(shí)，濃縮后再測(cè)定；若過(guò)高時(shí)，先稀釋，使其OD值在0.2～1.0的范圍后，再測(cè)定。魏鴻剛等認(rèn)為：當(dāng)樣品中活菌濃度在1×107～1.4×108CFU/ml范圍內(nèi)時(shí)，光吸收值與待測(cè)樣品的活菌濃度之間的線性關(guān)系較好。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

①PBS溶液配制：8 g NaCl、1.15 g磷酸氫二鉀，0.2 g磷酸二氫鉀去離子水定容至1 000 ml，用pH計(jì)調(diào)節(jié)pH值7.2，溶液濃度為0.01 mol/l。121℃滅菌15 min，室溫保存。

②MTT溶液配制：稱取100mgMTT于小燒杯中，加 20 ml PBS(0.01 mo/l，pH 值 7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔過(guò)濾器除菌，分裝于1.5 ml的EP管中，4℃棕色瓶中避光保存。兩周內(nèi)使用有效。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取3種實(shí)驗(yàn)菌的菌液，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，選擇10個(gè)合適的濃度，分別對(duì)其做MTT比色實(shí)驗(yàn)和平板菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)OD值和活菌數(shù)作出3種實(shí)驗(yàn)菌各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。

④MTT比色實(shí)驗(yàn)：A：將培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮或稀釋，使其活菌濃度滿足比色要求；B：吸取處理好的培養(yǎng)液100 μl，加入96孔酶標(biāo)板中，每個(gè)樣液做5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照；C：用微量吸樣器在96孔酶標(biāo)板中含有樣品的各孔分別加入20 μl的MTT溶液，37℃恒溫培養(yǎng)1.5 h后取出，向各孔分別加入100 μl的DMSO，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定OD值，測(cè)量前振動(dòng)60 s。所得OD值代入回歸方程計(jì)算出活菌數(shù)。

1.4.2 pH值的測(cè)定

用ORION RESEARCH model 221型酸度計(jì)測(cè)pH值。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)方法

為了便于進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將活菌數(shù)CFU/ml換算成對(duì)數(shù)值。

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用Excel2007和SPSS17.0進(jìn)行計(jì)算和分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±sd)的形式給出。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表1）

表1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果（mm）

從表1可以看出，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌這兩種實(shí)驗(yàn)菌對(duì)指示菌均具有一定的抑制活性。其中，對(duì)大腸桿菌抑菌活性最好的是納豆芽孢桿菌，其抑菌圈直徑為15.67 mm；對(duì)鼠傷寒沙門氏菌抑菌能力最好的也是納豆芽孢桿菌，其次是嗜酸乳桿菌，兩種菌抑菌圈大小分別為14.95和13.67 mm；混合菌液對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌也均具有抑菌作用，其抑菌圈直徑分別為14.91和13.33 mm。說(shuō)明各實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)指示菌均有一定的抑菌效果，且兩菌種混合后對(duì)病原菌仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌作用。

2.2 耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

因飲食結(jié)構(gòu)等的狀況的不同，動(dòng)物胃液pH值的波動(dòng)較大，如豬胃中的pH值常在2.0～7.0之間，但一般在3.0左右，因此，以此pH值作為菌株篩選的標(biāo)準(zhǔn)。

由圖1可知，隨著培養(yǎng)基pH值的逐漸降低活菌含量也隨之下降。在pH值5.0時(shí)，各試驗(yàn)菌均表現(xiàn)出較好的增殖現(xiàn)象，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值達(dá)到了7.35。pH值4.0時(shí)，3種菌的活菌數(shù)有所下降，活菌數(shù)均小于107；當(dāng)pH值下降至3.0時(shí)，3種試驗(yàn)菌仍然表現(xiàn)一定的耐受能力，活菌數(shù)均在106左右。其中，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌的存活能力比釀酒酵母要好。在pH值為2的強(qiáng)酸性條件下，納豆芽孢桿菌的存活能力較其余兩菌要好，活菌數(shù)在105以上。由此，說(shuō)明篩選出的3種試驗(yàn)菌（尤其是納豆芽孢桿菌）均具有較好的抗酸能力，能順利通過(guò)高酸性胃液環(huán)境進(jìn)入腸道。

圖1 不同pH值對(duì)菌數(shù)含量的影響

2.3 耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

微生物飼料添加劑對(duì)膽鹽的耐受性是決定其進(jìn)入豬體內(nèi)能否發(fā)揮生理功能的又一關(guān)鍵因素。膽鹽是由肝臟合成的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合形成的鈉鹽或鉀鹽，經(jīng)膽道分泌進(jìn)入小腸，動(dòng)物腸道中的膽汁鹽含量是不斷變化的，一般在0.3～3.0 g/kg，通常情況下其平均含量為0.3 g/kg，所以通常將0.3 g/kg作為篩選耐膽汁鹽菌體的標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 不同膽鹽濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)菌活菌數(shù)的影響

由圖2可知，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母在膽鹽濃度為0.1%、0.2%時(shí)均能很好的生長(zhǎng)繁殖，其中納豆芽孢桿菌的耐膽鹽能力較強(qiáng)，活菌數(shù)均大于107CFU/ml；當(dāng)豬膽鹽濃度增加為0.3%時(shí)，3種試驗(yàn)菌都表現(xiàn)出較好的增殖現(xiàn)象，其中納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖較明顯，活菌數(shù)都在106以上；當(dāng)膽鹽濃度為0.4%時(shí)，納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)狀況一般，而嗜酸乳桿菌和釀酒酵母的生長(zhǎng)受到較明顯抑制，但活菌數(shù)仍大于104。說(shuō)明嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母對(duì)膽鹽均具有一定的耐受力。

2.4 人工模擬豬體胃腸道耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 人工胃液的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物胃液的成分主要有：鹽酸、胃蛋白酶原、粘蛋白等。胃蛋白酶原在HCl激活下轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘奈傅鞍酌福澄?。流體食物在胃內(nèi)經(jīng)階段性運(yùn)動(dòng)消化一般需要1～2 h。菌株對(duì)胃酸及胃蛋白酶的耐受性越強(qiáng)，能夠到達(dá)腸道的活菌數(shù)越多，則越能最大限度地發(fā)揮效應(yīng)。人工模擬豬體胃液實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2所示，在人工豬體胃液中，3種實(shí)驗(yàn)菌在人工胃液中的活菌數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，作用2 h活菌存活率均在70%以上，即大部分試驗(yàn)菌耐受人工胃液環(huán)境的時(shí)間超過(guò)2 h。說(shuō)明篩選出來(lái)的3種實(shí)驗(yàn)菌通過(guò)豬體胃液環(huán)境進(jìn)入腸道的可能性較大。

2.4.2 人工模擬腸液的耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

豬體消化道腸液中含有胰蛋白酶和膽汁鹽，對(duì)菌株的存活有很大的影響。小腸液是一種弱堿性液體，pH值約為7.6。食物在小腸內(nèi)停留時(shí)間較長(zhǎng)，約3～5 h。另外，膽汁鹽具抗菌性，可溶解細(xì)菌細(xì)胞，活菌進(jìn)入腸道后，要對(duì)環(huán)境具有一定的持續(xù)耐受能力，才能保證其正常發(fā)揮作用。人工模擬豬體腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，實(shí)驗(yàn)菌對(duì)人工豬體腸液具有較強(qiáng)的耐受能力，3種實(shí)驗(yàn)菌的存活率都在80%以上，耐受時(shí)間可超過(guò)5 h。其中，納豆芽孢桿菌經(jīng)人工胃液處理5 h后的存活率仍大于85%。由此說(shuō)明3種實(shí)驗(yàn)菌通過(guò)豬體腸液環(huán)境存活的可能性較大。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

多數(shù)報(bào)道表明，甲瓚在570 nm下的光吸收值與細(xì)胞活性正比關(guān)系最佳，本文選取570 nm測(cè)定OD值。此外，不同益生菌的琥珀酸脫氫酶的活性各不相同，為了更精確的反映培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，本文準(zhǔn)確地繪制了3種實(shí)驗(yàn)菌各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以MTT比色法所得OD值為X軸，以平板稀釋法所得活菌數(shù)為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3、圖4、圖5，3種菌的線性回歸方程為：

①嗜酸乳桿菌：線性回歸方程：y=1.497 3x+0.001 7，R2=0.984 7；

②納豆芽孢桿菌：線性回歸方程：y=1.380 5x+0.017 4，R2=0.986 7；

③釀酒酵母：線性回歸方程：y=1.484 2x+0.009 3，R2=0.985 5。

表2 實(shí)驗(yàn)菌的人工胃液實(shí)驗(yàn)（pH值為3.0）

表3 實(shí)驗(yàn)菌的人工腸液實(shí)驗(yàn)

圖3 嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)與OD570 nm的關(guān)系

圖4 納豆芽孢桿菌的活菌數(shù)與OD570 nm的關(guān)系

圖5 釀酒酵母的活菌數(shù)與OD570 nm的關(guān)系

3 討論與結(jié)語(yǔ)

由于豬體胃腸消化道不斷分泌胃液、膽汁、胰液等消化液，對(duì)微生物構(gòu)成一道酶和低pH值的屏障。復(fù)合益生菌需對(duì)胃腸道較強(qiáng)的酸性環(huán)境、較高濃度的膽鹽和各種消化酶具有一定的耐受能力，這樣才能保證其進(jìn)入消化道，并定植于腸道內(nèi)，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的作用。

所選3種試驗(yàn)菌：嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌及其混合菌液對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌均具有明顯的抑制作用，在pH值3.0時(shí)，3種實(shí)驗(yàn)菌的活菌數(shù)均在106左右，其中，嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌的酸性環(huán)境存活能力比釀酒酵母要好。在0.3%豬膽鹽的環(huán)境中，3種實(shí)驗(yàn)菌都表現(xiàn)出較好的增殖現(xiàn)象，其中納豆芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的增殖較明顯，活菌數(shù)都在106以上。另外，人工胃腸道實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：3種實(shí)驗(yàn)菌通過(guò)豬體胃液環(huán)境存活的可能性較大，3種實(shí)驗(yàn)菌在人工胃液中作用2 h活菌存活率均在70%以上；3種實(shí)驗(yàn)菌對(duì)人工豬體腸液具有較強(qiáng)的耐受能力，存活率都在80%以上，耐受時(shí)間可超過(guò)5 h。其中，納豆芽孢桿菌經(jīng)人工胃液處理5 h后的存活率仍大于85%。

由本實(shí)驗(yàn)所篩選的3種實(shí)驗(yàn)菌（嗜酸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、釀酒酵母）均可以通過(guò)胃液到達(dá)小腸發(fā)揮作用。所選菌株對(duì)病原菌、尤其是豬體高致病菌有較強(qiáng)的抑制作用，具備了優(yōu)良益生菌的條件，我們將進(jìn)一步摸索發(fā)酵實(shí)驗(yàn)條件、研究生產(chǎn)制備工藝，制成固體微生物飼料添加劑，并將其應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，進(jìn)行豬的飼喂實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)其應(yīng)用效果。

13篇，刊略，需者可函索）