郭志杰 李 杰 李 鑫 張德曉 王曉翠

乳酸菌在替代腹瀉、促生長、抗生素等綜合方面一定程度上起到良好的作用，被人們認(rèn)為是理想綠色添加劑。人們根據(jù)乳酸菌生理功能，將其應(yīng)用到仔豬腹瀉的防治上，起到了顯著降低腹瀉率，促生長的效果，提高了養(yǎng)豬的經(jīng)濟(jì)效益[1]。理想的益生素菌種最好來自同源動(dòng)物的腸道。Timmerman等（2006）研究表明，同源性乳酸菌對(duì)宿主的益生作用優(yōu)于異源菌株[2]。由于動(dòng)物種類和環(huán)境的不同定植腸道的種類和數(shù)量相差很大，定植的能力也不盡相同，相應(yīng)在糞便里也不盡相同[3]。然而得到并篩選出同源且抗逆性強(qiáng)的菌株尤為重要。故分離并篩選耐受性和抑菌效果良好的菌株為研究仔豬防腹瀉、促增長的微生態(tài)制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 病原指示菌

大腸桿菌和沙門氏菌均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體和固體培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、LB培養(yǎng)基。

1.1.3 生化鑒定試劑

5%過氧化氫（v/v）、奈示試劑、PY基礎(chǔ)培養(yǎng)液、檸檬酸鐵氨、v-p試劑、明膠、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離與命名

取28日齡新鮮斷奶仔豬糞便0.5 g置于4.5 ml滅菌生理鹽水中，搖勻。進(jìn)行梯度稀釋，稀釋至第7個(gè)梯度，吸取 10-5、10-6、10-7梯度稀釋液 200 μl于固體MRS培養(yǎng)基平板上均勻涂布。將上述平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2）培養(yǎng) 48 h，挑去健壯、活性高的單菌落30株。反復(fù)劃線純化到獲得純菌株為止。

進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。選擇革蘭氏陽性菌且無芽孢的菌株為后備菌株。將菌液與滅菌甘油按1：1混合置于-20℃冰箱進(jìn)行菌種保藏。

菌株的命名：以“乳酸菌”首字母與分離出菌株的順序來命名。如分離出的第1株乳酸菌命名為R1，分離出第8株則為R8。

方干又有七律詩《題龍泉寺絕頂》和《再題龍泉寺上方》。據(jù)嘉泰《會(huì)稽志》：“(龍泉寺)東晉咸康二年建。唐會(huì)昌五年廢，大中五年重建。咸通二年改今額?！盵10]卷八因而可以據(jù)此判斷在咸通二年(861)方干52歲之后至少曾經(jīng)兩次造訪會(huì)稽龍泉寺并且留下詩篇。

1.2.2 耐酸試驗(yàn)

將上述保藏菌株按5%（v/v）接種量接種，活化2到3代以保證菌株高活性，活化培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

將最后1次活化好的菌液按5%（v/v）接種量接入pH值2.5的MRS液體培養(yǎng)基，同時(shí)接入不加酸MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，2 h后，分別吸取酸處理和對(duì)照組菌液200 μl進(jìn)行涂板，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行平皿菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算酸處理過的存活率 A(%)=X1/X0×100,式中：A為酸處理后的存活率；X1為處理2 h后每毫升的活菌數(shù)（CFU）；X0為對(duì)照組2 h后每毫升的活菌數(shù)（CFU）。

1.2.3 耐膽鹽試驗(yàn)

在液體MRS加0.3%（m/v）豬膽鹽搖勻，方法同上述耐酸試驗(yàn)。計(jì)算膽鹽處理過的存活率B(%)=Y1/Y0×100。式中：B為膽鹽處理后的存活率；Y1為膽鹽處理2 h后每毫升的活菌數(shù)（CHU）；Y0為對(duì)照組2 h后每毫升的活菌數(shù)（CFU）。

1.2.4 抑菌試驗(yàn)

大腸桿菌、沙門氏菌按5%（v/v）接種量接入LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，涂板查數(shù)后調(diào)節(jié)原菌液107CFU/ml，同樣方法調(diào)節(jié)乳酸菌菌液濃度108CFU/ml。采用牛津杯法，吸取200 μl致病菌在營養(yǎng)瓊脂涂板，分別制成大腸桿菌板和沙門氏菌板，無菌條件下將牛津杯放在平板上然后吸取200 μl乳酸菌發(fā)酵液于杯中，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，平放37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測(cè)其抑菌直徑，每個(gè)抑菌圈測(cè)3個(gè)直徑，取其平均值。

目的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸驗(yàn)證。把每株菌都活化2次以達(dá)到高的活性，按5%（v/v）接種量接入100 ml的三角瓶中。每株菌做3個(gè)重復(fù)，即每株菌測(cè)得3個(gè)pH值，求其平均值。

1.2.6 鑒定試驗(yàn)

首先通過菌落形態(tài)特征與顯微鏡（10×100）觀察可初步判定球或桿狀。再通過過氧化氫試驗(yàn)、硝酸還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、pH值 9.2和 pH值 9.6生長試驗(yàn)、4%NaCI、16.5%NaCI生長試驗(yàn)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性（半固體穿刺）試驗(yàn)，做出關(guān)于桿菌與球菌屬的進(jìn)一步鑒別。再通過精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)和各類糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果與《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與試驗(yàn)方法》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)照進(jìn)行種的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

試驗(yàn)從新鮮斷奶仔豬糞便中分離出30株無芽孢乳酸桿菌，且30株都是革蘭氏陽性。其在MRS固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)也各異，多呈白色或乳白色還有呈半透明狀，表面大多光滑較多中央有隆起現(xiàn)象，邊緣大多整齊也有放射粗糙型。

2.2 耐酸試驗(yàn)

通過pH值2.5處理后存活率見表1。由表1可知，R9、R11、R12、R14、R15、R18、R23表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，酸處理2 h后存活率仍達(dá)到30%以上;R3、R21、R22對(duì)酸也有一定的耐受性，存活率超過20%;而R25、R30此條件下較為敏感，存活分別為10.0%、10.2%；其余菌株則受到強(qiáng)烈的抑制。最終以存活率10%為界限，選定R3、R9、R11等13株菌進(jìn)行下一步的篩選。

表1 pH值2.5條件下30株乳酸菌存活率

2.3 耐膽鹽試驗(yàn)

通過0.3%膽鹽濃度后存活率見表2。由表2可知，R11、R14、R15、R18、R22都表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性；R3、R30也有一定的耐受性，其余菌株則受到強(qiáng)烈的抑制。最終以存活率10%為界限，選定R3、R11等7株菌進(jìn)行下一步的篩選。

表2 9株菌在0.3%膽鹽濃度存活率

2.4 抑菌試驗(yàn)

大腸桿菌、沙門氏菌病原菌抑菌直徑見表3。由表3 可知，R11、R15、R18、R224 株菌對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌都有較強(qiáng)的抑菌作用，R14處于過渡期，R3、R30抑菌能力較弱，以18 mm為界，R18在抑制沙門氏菌時(shí)沒有達(dá)到18 mm，但在繁殖以及在其它耐性方面都有強(qiáng)的作用，故保留其菌株。選出 R11、R15、R18、R22為篩選目的菌種。

表3 對(duì)指示菌抑菌直徑測(cè)定（mm）

2.5 產(chǎn)酸試驗(yàn)

4株菌產(chǎn)酸能力見表4，由表4可知，4株菌產(chǎn)酸能力都很強(qiáng)，且3次重復(fù)測(cè)定pH值的變化都很小。只有R18的pH值超過4.00，雖超4.00但其產(chǎn)酸能力仍很強(qiáng)。其中R11產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，pH值達(dá)3.83。

表4 分離菌產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果

2.6 鑒定試驗(yàn)

對(duì)4株菌首先進(jìn)行屬的鑒定。通過菌落形態(tài)、鏡檢與進(jìn)一步通過生化鑒定不發(fā)生過氧化氫試驗(yàn)、不能硝酸還原、不能明膠液化、不能產(chǎn)生吲哚、不能產(chǎn)生硫化氫可初步判定R18、R22為乳酸桿菌屬。通過鏡檢觀察菌的排列狀態(tài)與進(jìn)一步的生理生化鑒定：發(fā)酵葡糖糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在15和45℃條件下可以生長，生長于6.5%NaCI與pH值9.6的環(huán)境可初步判定R11、R15是腸球菌屬。

表5 2株乳桿菌種鑒定結(jié)果

對(duì)4株菌再進(jìn)行種的鑒定。通過表5與《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與試驗(yàn)方法》對(duì)照可知，R18除了在利用核糖與鑒定特征有差別外，其余與嗜酸乳桿菌相符；R22除了利用棉籽糖與鑒定特征有差別外，其余與口乳桿菌相符。通過表6與《乳酸細(xì)菌的分類鑒定與試驗(yàn)方法》對(duì)照可知，R11為屎腸球菌、R15為雞腸球菌。

表6 2株乳球菌種鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 菌株的分離

根據(jù)微生態(tài)學(xué)原理從腸道或糞便中分離乳酸菌應(yīng)用于生產(chǎn)被認(rèn)為是一種可行的方法[4]。分離菌株的同源性很重要，有報(bào)道認(rèn)為，正常菌群在動(dòng)物體內(nèi)的定植是通過粘附來完成的，從某一類動(dòng)物分離到的乳酸菌只對(duì)這類動(dòng)物的消化道上皮表現(xiàn)出較強(qiáng)的粘附性，對(duì)其它動(dòng)物不粘附或低粘附，而這種粘附性是關(guān)系到微生物添加劑作用效果的關(guān)鍵問題[5]。許多從雞上分離的乳酸菌只對(duì)雞小腸粘膜上皮細(xì)胞有粘附力，而對(duì)大鼠和豬等則沒有粘附力，同樣從大豬上分離的乳酸桿菌對(duì)小豬的腸粘膜上皮細(xì)胞粘附力較差[6]。益生菌菌株定植的宿主特異性直接影響到益生素制劑的應(yīng)用效果，因而菌種的分離選擇必須注意到宿主特異性問題[7]。糞便里的活菌經(jīng)過胃腸道已經(jīng)經(jīng)過逆性環(huán)境的篩選為以后的體外篩選打下基礎(chǔ)。

試驗(yàn)采用MRS瓊脂作分離乳酸菌用培養(yǎng)基，它含有較高濃度的乙酸鹽離子并有刺激因子吐溫-80，可抑制其它許多微生物生長，起到選擇的作用[8]。試驗(yàn)不是在純厭氧條件下進(jìn)行，而是采用5%二氧化碳濃度培養(yǎng)，目的是得到對(duì)環(huán)境要求比較低，易分離、培養(yǎng)、保存的兼性厭氧菌，便于實(shí)際生產(chǎn)的應(yīng)用。

3.2 酸耐受性

幼齡動(dòng)物胃內(nèi)的pH值一般在3～4左右，小腸內(nèi)pH值為4～5，大腸內(nèi)pH值高達(dá)5.0以上[9]。乳桿菌要進(jìn)入仔豬消化道起作用，首先應(yīng)該能夠耐受較低pH值的酸性環(huán)境，因?yàn)槌跎胸i胃內(nèi)pH值為5.0，幾小時(shí)后降為3.0～4.0，5周齡時(shí)pH值為2～3.0，其后相對(duì)穩(wěn)定。這種酸度對(duì)許多乳桿菌來說都是不耐受的，從外界進(jìn)入的乳酸桿菌必須經(jīng)過胃的酸性環(huán)境，保持足夠的活菌數(shù)才能起作用，在本試驗(yàn)中將耐酸性作為乳酸桿菌篩選的首要指標(biāo)，既減少后期工作量，又保證篩選菌株能順利通過酸性胃環(huán)境，進(jìn)入腸道發(fā)揮功能。

3.3 膽鹽耐受性

有研究表明，由肝臟分泌到十二指腸的高濃度的膽鹽具有抗菌活性，它對(duì)細(xì)胞膜有很強(qiáng)的破壞力，它的疏水作用可導(dǎo)致膜蛋白離解和細(xì)胞膜破裂[10]。故益生菌要順利進(jìn)入動(dòng)物腸道，除具有可耐受胃中低pH值的能力外，還需具備耐受小腸中膽汁等形成的高滲透壓環(huán)境的能力。小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%之間波動(dòng)[11],故采用0.3%膽鹽作為篩選耐受腸道內(nèi)膽鹽的指標(biāo)。通過耐酸與耐膽鹽試驗(yàn)可知，膽鹽是比胃酸對(duì)乳桿菌更不利的因素，這與趙瑞香等[12]的報(bào)道一致。

3.4 抑菌試驗(yàn)

乳酸菌代謝產(chǎn)物抑制大腸桿菌和沙門氏菌的效果以抑菌圈的大小為指標(biāo)。牛津杯中的抗菌物質(zhì)能透過瓊脂來抑制大腸桿菌和沙門氏菌，離牛津杯越遠(yuǎn)，能滲透過去的抗菌物質(zhì)的濃度就越小，所以抑菌圈越大，說明效果越好。7株乳桿菌對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈從13～21 mm不等。作為益生菌的乳酸菌菌株在體外應(yīng)具有很好的抑菌作用，故以18 mm大小的抑菌圈為標(biāo)準(zhǔn)[13]。乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸、細(xì)菌素、過氧化氫等物質(zhì)對(duì)病原菌起到抑制或殺滅的作用。國內(nèi)外的研究報(bào)道表明，不同的乳桿菌菌株起抑菌作用的主要物質(zhì)不盡相同，有的主要是酸，有的主要是細(xì)菌素，有些是這些物質(zhì)的共同作用。與Vandenbergh報(bào)道的乳桿菌主要是通過代謝產(chǎn)生的乙酸、乳酸等抑制細(xì)菌生長的結(jié)果一致[14]。

3.5 產(chǎn)酸試驗(yàn)

乳酸菌產(chǎn)酸功能是一個(gè)很重要的指標(biāo)，酸可使胃內(nèi)蛋白酶原激活，同時(shí)酸具有強(qiáng)的殺菌作用，篩選出的菌都可以分泌出低的pH值。

3.6 鑒定試驗(yàn)

對(duì)菌進(jìn)行有效、準(zhǔn)確鑒定是開發(fā)和利用他們的前提條件。目前乳酸菌的分類鑒定方法很多，主要包括常規(guī)鑒定法、快速鑒定法以及分子生物學(xué)鑒定方法。而經(jīng)典鑒定法即生理生化鑒定是常規(guī)鑒定法的主要組成部分，同時(shí)也是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)菌種鑒定應(yīng)用最多的方法。各種細(xì)菌所具有的霉系統(tǒng)不盡相同，對(duì)營養(yǎng)基質(zhì)分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少各有區(qū)別，可供鑒別細(xì)菌用。

4 小結(jié)

R11、R15、R18、R22對(duì)酸、膽鹽、抑菌及產(chǎn)酸性能的綜合能力較好。在pH值2.5作用后存活率分別為32.1%、61.2%、32.5%、29.2%；在含0.3%豬膽鹽MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后存活率依次為40.1%、20.2%、22.1%、30.1%；且此4株菌株抑菌與產(chǎn)酸能力也較強(qiáng)；通過鑒定可知，R11為屎腸球菌、R15為雞腸球菌、R18嗜酸乳桿菌、R22為口乳桿菌。

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