吳曉光 陸宇 高孟秋 王子彤 韓鳴 馬麗萍

(北京胸科醫(yī)院 北京 101149)

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌引起的嚴(yán)重危害人民生命健康的慢性傳染性疾病。雖然人類發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌已有上百年的歷史,但對(duì)結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)本質(zhì)特別是結(jié)核分枝桿菌持留菌的認(rèn)識(shí)仍需不斷深入。臨床上需外科手術(shù)治療的結(jié)核病患者大多數(shù)曾長(zhǎng)期反復(fù)抗結(jié)核治療或未規(guī)律系統(tǒng)治療,術(shù)中病灶取材進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)對(duì)于術(shù)前化療的判斷以及持留菌的發(fā)現(xiàn)都將是很好的切入點(diǎn)。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上[1],對(duì)手術(shù)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)并探討其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 選取本院外科或骨科的住院肺結(jié)核、骨結(jié)核及淋巴結(jié)核患者,有不同療程的化療史,所接受化療方案均含有H RZ,因病程遷延或氣胸等原因行病灶切除治療。

1.1.2 培養(yǎng)基 稱取7H9培養(yǎng)基(美國(guó)Difico公司)4.7 g,溶于900 ml蒸餾水中,加入 2.0 ml甘油和0.5ml吐溫-80,121℃高壓10min,待使用前加入0.1體積分?jǐn)?shù)的 OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑(oleic acid albumin dextrose catalase)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 選取手術(shù)標(biāo)本中肉眼見(jiàn)纖維化、干酪樣病變連同邊緣組織楔形取材,即刻用組織磨碎器研磨,分別接種及-70℃保存待提取RNA用。

1.2.2 取上述處理后標(biāo)本0.1 ml,系列10倍稀釋后,分別接種到改良羅氏培養(yǎng)基斜面上,每一稀釋度接種 2支,置 37 ℃培養(yǎng),24 h、72 h、1周 、2周、4周、8周分別觀察生長(zhǎng)情況,以8周生長(zhǎng)為準(zhǔn)計(jì)算菌落數(shù)目(CFU)。

1.2.3 取0.1 ml接種到含有抗菌素(100 U/ml多黏菌素 B、5μg/ml兩性霉素 B 、25μg/ml羥氨芐青霉素)和0.05%吐溫-80的7H9液體培養(yǎng)基中,分別置37℃進(jìn)行有氧和低氧(培養(yǎng)基中氧濃度不超過(guò)1%)培養(yǎng) ,24 h 、72 h 、1 周 、2 周 、4 周、8 周定期觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4 mRNA的定量檢測(cè) 測(cè)定結(jié)核分枝桿菌異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)、小分子熱休克蛋白(alpha-crystalli,ACR)和 85B蛋白 mRNA：RNA提取方法與文獻(xiàn)[2]基本相同。ICL擴(kuò)增引物：上游 5′-CCATGCGCTGAACTACTCGAT-3′;下游5′-AGT TCGACATACGCGCTCATC 3-′,擴(kuò)增片段75 bp;結(jié)核分枝桿菌ACR和85B擴(kuò)增引物同文獻(xiàn)[7]。PCR 反應(yīng)體系 25 μ l,包括10 mmol/L T ris-HCl(pH 值為 8.3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 nmol/L 引物、250 nmol/L 探針、200 nmol/L dNTP、1 U Taq酶(美國(guó)Prommega公司)、DNA(cDNA)2 μ l。反應(yīng)參數(shù) ：95 ℃預(yù)變性 5 min,94℃變性30 s,54℃(Acr和85 B為60℃)復(fù)性30 s,40個(gè)循環(huán)。每次反應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照,未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的RNA同時(shí)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),監(jiān)測(cè)有無(wú)DNA污染。mRNA拷貝數(shù)/ml為cDNA拷貝數(shù)乘以用于RT及PCR反應(yīng)時(shí)標(biāo)本液稀釋倍數(shù)。不同時(shí)間的樣品分別分3份進(jìn)行mRNA檢測(cè),測(cè)定后取均值。

2 結(jié)果

2.1 入選病例概況 所選取的12例標(biāo)本手術(shù)前均經(jīng)一定時(shí)間化療后行外科手術(shù)治療。其中男性6例,女性6例,病程半年以上至40年不等,化療時(shí)間3～36個(gè)月,除病例4外其余患者均接受了含H RZ的治療方案3月以上,肺結(jié)核患者9例,骨結(jié)核患者2例,淋巴結(jié)核患者1例,手術(shù)前痰結(jié)核菌集菌及羅氏培養(yǎng)檢查均為陰性,具體情況見(jiàn)表1。

2.2 檢測(cè)結(jié)果 將手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行羅氏培養(yǎng)、7H9有氧、7H9低氧培養(yǎng),并檢測(cè)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌ICL、Acr、85B mRNA 的拷貝數(shù),結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論

本研究9例肺結(jié)核患者術(shù)前痰結(jié)核菌培養(yǎng)均陰性,術(shù)中病灶取材結(jié)核菌羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性7例,7H9有氧培養(yǎng)陽(yáng)性8例,痰標(biāo)本培養(yǎng)陰性,而手術(shù)標(biāo)本中培養(yǎng)陽(yáng)性,一方面說(shuō)明手術(shù)標(biāo)本結(jié)核菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率要高,因?yàn)榕囵B(yǎng)的結(jié)核菌直接來(lái)自于病變部位,而非經(jīng)呼吸道排出;另一方面說(shuō)明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間化療或較長(zhǎng)時(shí)間的臨床病情穩(wěn)定期(無(wú)癥狀、X線胸片顯示病灶穩(wěn)定)痰培養(yǎng)已陰性并不是真正意義上的結(jié)核菌已徹底消除,體內(nèi)很可能仍然存在具有活性病灶或存在不同代謝狀態(tài)的菌群,這樣的檢測(cè)對(duì)術(shù)后的化療起支持和指導(dǎo)作用。本研究因?yàn)槭浅醪窖芯?病例數(shù)較少而且我們的藥敏實(shí)驗(yàn)方法也在進(jìn)行之中,認(rèn)為對(duì)于手術(shù)標(biāo)本結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性者繼續(xù)行藥敏測(cè)定,將對(duì)術(shù)后制定個(gè)體化抗結(jié)核方案有指導(dǎo)意義。本項(xiàng)研究中的7H9有氧培養(yǎng)陰性病例的出現(xiàn)可能與取材或磨碎方法有關(guān),也可能是含菌量少受檢測(cè)的限制。

表1 入選病例概況及標(biāo)本培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果

一般認(rèn)為人體感染敏感結(jié)核分枝桿菌后,經(jīng)正規(guī)方案(含有HRZ)化療后,體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌一旦進(jìn)入持留狀態(tài),由于代謝途徑的轉(zhuǎn)變,使得原來(lái)對(duì)細(xì)菌敏感的藥物變得無(wú)效。一系列體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)顯示,在低氧、和高濃度藥物的誘導(dǎo)下,一部分結(jié)核分枝桿菌為適應(yīng)環(huán)境對(duì)其生存的不利影響(在體內(nèi)條件下還存在有機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌的影響),不但形態(tài)發(fā)生改變,代謝途徑也向乙醛酸支路轉(zhuǎn)換而進(jìn)入持留狀態(tài)[3-5]。本研究7H9低氧培養(yǎng)陽(yáng)性8例,其中固體培養(yǎng)陰性而有氧培養(yǎng)陽(yáng)性的1例(病例7,29歲女性,左上空洞型肺結(jié)核,雖經(jīng)12個(gè)月的抗結(jié)核治療,但仍有間斷咯血而采取手術(shù)治療)。其余均為固體、7H9培養(yǎng)同時(shí)陽(yáng)性,可能的原因是病灶中存在不同狀態(tài)的細(xì)菌,在體外適宜的條件下生長(zhǎng),也可能是液體培養(yǎng)基中含有復(fù)蘇因子使病灶中持留菌復(fù)蘇生長(zhǎng)[7-8]。

應(yīng)用定量RT-PCR檢測(cè)3種蛋白的mRNA表達(dá),結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果分析：有1例(病例8)是固體培養(yǎng)陰性,液體培養(yǎng)陽(yáng)性,3種mRNA均有表達(dá)且ICL,Acr高表達(dá),根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明持留菌的存在,85BmRNA的同時(shí)表達(dá)說(shuō)明在病灶中也同時(shí)存在活躍生長(zhǎng)的菌,該病例為15年前患胸壁結(jié)核,HRZE化療1年,13年前復(fù)發(fā)1次,繼續(xù)HRZE抗結(jié)核藥物治療2年,達(dá)到臨床痊愈;本次為第3次病灶復(fù)發(fā),對(duì)于這種反復(fù)復(fù)發(fā)的病例,一般常規(guī)抗結(jié)核藥物治療只能殺滅復(fù)發(fā)后活躍增殖的細(xì)菌,對(duì)于進(jìn)入持留狀態(tài)的細(xì)菌則無(wú)效,因此不能達(dá)到徹底治愈結(jié)核病的目的,應(yīng)該選用手術(shù)治療,徹底消滅體內(nèi)結(jié)核病灶。

臨床上對(duì)于結(jié)核病復(fù)發(fā)者,經(jīng)?？紤]可能存在對(duì)一線藥物耐藥,此時(shí)多改變方案而采用含左氧氟沙星等的二線藥物治療,但也有部分繼續(xù)采用原方案治療再次獲得痊愈的病例存在,根據(jù)結(jié)核菌持留狀態(tài)代謝的特點(diǎn),結(jié)核菌在持留狀態(tài)時(shí)對(duì)藥物不敏感,而一旦復(fù)發(fā),結(jié)核分枝桿菌又恢復(fù)了其活躍增殖的代謝途徑,因此,對(duì)結(jié)核一線藥物的敏感性也隨之恢復(fù),因此再次應(yīng)用一線抗結(jié)核藥物仍然是有效的,香港的一項(xiàng)臨床研究結(jié)果,也證實(shí)了結(jié)核菌持留狀態(tài)的這一特性。況且二線藥物比較一線藥物,價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)多,必然為患者帶來(lái)了巨大的身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

本研究結(jié)果表明手術(shù)標(biāo)本是結(jié)核菌培養(yǎng)及持留菌檢測(cè)的很好材料,對(duì)患者術(shù)后化療方案有指導(dǎo)意義。由于本研究例數(shù)較少和選材及方法的限制,有待進(jìn)行擴(kuò)大病例和改進(jìn)方法的進(jìn)一步研究,為探索新的抗結(jié)核治療提供細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)和幫助。

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