顏亞暉 錢(qián)燕春

(中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 湖南長(zhǎng)沙410078;1湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 永州425006)

乳腺癌組織中FOXO1蛋白表達(dá)與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的相關(guān)性

顏亞暉 錢(qián)燕春1＊

(中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 湖南長(zhǎng)沙410078;1湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 永州425006)

目的 研究乳腺癌組織中FOXO1蛋白表達(dá)與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。方法 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)60例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、21例導(dǎo)管內(nèi)癌、30例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及15例正常乳腺組織中 FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果 FOXO1及活化Caspase-3蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均顯著低于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織。Ki-67蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織;浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度與癌組織的病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān);在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中,FOXO1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與 Ki-67呈顯著負(fù)相關(guān),而與活化Caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)。結(jié)論 FOXO1蛋白的表達(dá)下調(diào)可能與乳腺導(dǎo)管癌的發(fā)生密切相關(guān);該蛋白可能是一種細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,同時(shí)亦是一種細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子,FOXO1基因有可能成為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌基因治療的有效靶點(diǎn)。

乳腺癌;FOXO1;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡機(jī)制異常密切相關(guān)。FOXO1(Forkhead transcription factors)蛋白作為FOXO轉(zhuǎn)錄因子亞家族中的一員,在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和代謝等多種生理效應(yīng)中扮演了重要的角色,也是胰島素信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子[1-3]。本研究利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤、導(dǎo)管內(nèi)癌及浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3蛋白的表達(dá),并探討其相關(guān)性。

材料和方法

1.標(biāo)本 所有標(biāo)本均為2009年2月-2010年2月湘雅醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的標(biāo)本。浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌60例,平均年齡41.8(37-61)歲,按WHO標(biāo)準(zhǔn)分級(jí),其中I級(jí)18例,Ⅱ級(jí)32例,Ⅲ級(jí)10例;導(dǎo)管內(nèi)癌21例,平均年齡38.4(31-41)歲,導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤30例,平均年齡31.3(28--43)歲,其中有非典型增生者12例;乳腺根治手術(shù)切除的正常乳腺組織15例作正常對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)10%Formalin固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,病理學(xué)確診。

2.試劑 抗FOXO1蛋白多克隆抗體系美國(guó)Abgent公司產(chǎn)品;Ki-67、活化Caspase-3抗體及EliVisionTM二步法免疫組化染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

3.免疫組化染色 石蠟切片脫蠟水化;用3% H202封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;PBS洗后,EDTA溶液微波修復(fù) 6 min,滴加一抗 37℃孵育 1 h;PBS洗后,滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃孵育45 min;PBS洗后,DAB顯色;蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以 PBS替代一抗或二抗作陰性對(duì)照。

4.結(jié)果判斷 采用Bresalier[4]半定量公式判斷染色結(jié)果。每張切片中隨機(jī)選取10個(gè)視野,根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí),并分別計(jì)分:(0)陰性,細(xì)胞無(wú)著色;(1)弱陽(yáng)性,細(xì)胞著淺黃色;(2)中度陽(yáng)性,細(xì)胞著棕黃色;(3)強(qiáng)陽(yáng)性,細(xì)胞著棕褐色。計(jì)數(shù)每一強(qiáng)度的視野數(shù),根據(jù)下列公式計(jì)算每張切片的平均染色強(qiáng)度:IS(intensity score) =∑{(0×F0) +(1×F1) +(2×F2) +(3×F3)},F=%×10視野。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)及卡方檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3陽(yáng)性信號(hào)定位 FOXO1和 Ki-67陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核,活化Caspase-3陽(yáng)性信號(hào)主要位于細(xì)胞漿,少許為核陽(yáng)性(圖1-3)。

圖1浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中FOXO1蛋白的表達(dá)。二步法,×400 圖2浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Ki-67蛋白的表達(dá)。二步法?！?00圖3浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中活化caspase-3蛋白的表達(dá)。二步法,×400Fig.1 Expression of FOXO1 protein ininfiltrating duct carcinomas,Elivision,×400.Fig.2 Expression of Ki-67 protein in infiltrating duct carcinomas,Elivision,×400.Fig.3 Expression of activated-caspase-3 protein in infiltrating duct carcinomas,Elivision,×400

2.FOXO1蛋白在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率及陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度 FOXO1在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 20%(12/60)、38.1%(8/21)、80%(24/30)及100%(15/15),其陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度分別為0.64±0.28、0.75±0.31、2.12±0.47和2.51 ±0.41,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示FOXO1蛋白在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度顯著低于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織(P<0.01);在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中FOXO1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異(P>0.05);導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤中FOXO1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度與正常乳腺組織亦未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)(表1)。FOXO1蛋白在具有非典型增生的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯低于無(wú)非典型增生者(P<0.05)。

3.Ki-67蛋白在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率及陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度 Ki-67蛋白在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為95%(57/60)、85.7%(18/21)、40%(12/30)和 20%(3/15);陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度分別為2.21±0.49、1.94±0.81、0.51±0.42和0.33± 0.17。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示 Ki-67蛋白在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度顯著高于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織(P<0.01);Ki-67在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異(P>0.05);導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤內(nèi) Ki-67蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度與正常乳腺組織亦未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)(表1);Ki-67蛋白在具有非典型增生的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度明顯高于無(wú)非典型增生者(P<0.05)。

4.活化 caspase-3在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率及陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度 活化caspase-3在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為35%(21/60)、47.6%(10/ 21)、83.3%(25/30)及93.3%(14/15),其陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度分別為 0.72±0.38、0.95±0.43、2.31±0.57和2.41±0.33。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示活化caspase-3在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度顯著低于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織(P<0.01);活化caspase-3在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌和導(dǎo)管內(nèi)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異(P>0.05);導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤中活化caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度與正常乳腺組織亦未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)(表1);活化caspase-3在具有和不具有非典型增生的導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差別(P>0.05)。

5.浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中 FOXO1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與Ki-67蛋白與活化Caspase-3表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中FOXO1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與 Ki-67蛋白的表達(dá)強(qiáng)度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),而與活化caspase-3表達(dá)強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)(P<0.01)(表2, 3)。

6.FOXO1、Ki-67及活化caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理學(xué)分級(jí)的關(guān)系 在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中FOXO1、Ki-67及活化caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度與癌組織病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)(P>0.05)(表4)。

表1 FOXO1、Ki-67及活化caspase-3蛋白在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中的表達(dá)強(qiáng)度Table 1 THE expression intensity of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins in breast infiltrating duct carcinomas,intraductal carcinomas,intraductal papillomas and normal breast tissues

討 論

FOXO家族是PI3k/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶點(diǎn),由功能相關(guān)的 FOXO1、FOXO3a和FOXO4三個(gè)成員組成,該家族蛋白是保守的基因轉(zhuǎn)錄激活因子,參與細(xì)胞周期的抑制、細(xì)胞凋亡調(diào)控、抗氧化應(yīng)激、DNA修復(fù)等[5-7]。在子宮內(nèi)膜癌中 FOXO1蛋白表達(dá)顯著降低[7-9];Guttilla等[10]研究顯示乳腺癌組織中FOXO1 mRNA表達(dá)下調(diào),體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在FOXO1低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中,利用反義寡核苷酸抑制miR-27a, miR-96 and miR-182可顯著提升FOXO1蛋白的表達(dá),從而降低細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程,并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系 HEC-1B和Ishikawa中亦獲得相似的結(jié)果[8]。認(rèn)為 FOXO1蛋白可能是一種候選的抑癌基因,參與腫瘤的發(fā)生。

表2 浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中FOXO1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與Ki-67蛋白表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性Table 2 The relationship of expression intensities of FOXO1 and Ki-67proteins in breast infiltrating duct carcinomas,intraductal carcinomas,intraductal papillomas and normal breast tissues

表3 浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中FOXO1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性Table 3 Relationship of expression intensities of FOXO1 and activated Caspase-3 proteins in breast infiltrating duct carcinomas,intraductal carcinomas,intraductal papillomas and normal breast tissues

表4 FOXO1、Ki-67及活化caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌病理學(xué)分級(jí)的關(guān)系Table 4 The relationship of expression intensity of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins with pathological grades of infiltrating duct carcinomas

本文結(jié)果顯示浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中FOXO1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性強(qiáng)度均顯著低于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織,而與導(dǎo)管內(nèi)癌比較未見(jiàn)明顯差異;FOXO1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān),表明FOXO1的表達(dá)下調(diào)可能與乳腺導(dǎo)管癌的發(fā)生密切相關(guān)。

Ki-67和活化Caspase-3蛋白是分別與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)的標(biāo)記物,其表達(dá)水平的高低能反映細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的水平。本研究結(jié)果顯示浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中Ki-67蛋白的陽(yáng)性率和陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度顯著高于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織,而Caspase-3蛋白的陽(yáng)性率和陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度顯著低于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤和正常乳腺組織;但兩者的陽(yáng)性率和陽(yáng)性強(qiáng)度與導(dǎo)管內(nèi)癌比較均未見(jiàn)明顯差異,且在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中 Ki-67及活化Caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度與癌組織的分化程度無(wú)關(guān),進(jìn)一步表明在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的異常起著十分重要的作用。

相關(guān)性分析顯示,浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤及正常乳腺組織中FOXO1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度與 Ki-67蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈顯著負(fù)相關(guān),而與活化Caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈顯著正相關(guān),提示FOXO1蛋白是一種細(xì)胞增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,同時(shí)亦是一種細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子,故該基因有可能成為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌基因治療的有效靶點(diǎn)。

[1]Barthel A,Schmoll D,Unterman TG.FoxO proteins in insulin action and metabelism.Trends Endoerinol Metab,2005,16(4):183-189

[2]甘立霞.FoxO轉(zhuǎn)錄因子在代謝調(diào)節(jié)及腫瘤抑制中的作用.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(12):1347-1350

[3]盧忠燕,甘立霞,王喆,等.Ad-siRNA-FoxO1腺病毒載體的構(gòu)建及對(duì)人肝癌細(xì)胞系增殖的影響.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2008,5(6):488-492

[4]Bresalier RS,Ho SB,Schoeppner HL,et al.Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis.Gastroenterol,1996, 110(5):1354-1367

[5]Grinius L,Kessler C,Schroeder J,et al.Forkhead transcription factor FOXO1 is critical for induction of human decidualization.J Endocrinol,2006,189:179-187

[6]Alikhani M,Alikhani Z,Graves D.FOXO1 functions as a master switch that regulates gene expression necessary for tumor necrosis factor-induced fibroblast apoptosis.J Biol Chem,2005,280:12096-12102

[7]Ward EC,Hoekstra AV,Blok LJ,et al.The regulation and function of the forkhead transcription factor,Forkhead box O1,is dependent on the progesterone receptor in endometrial carcinoma.Endocrinology.2008,149(4):1942-1950

[8]Myatt SS,Wang J,Monteiro LJ,et al.Definition of microRNAs that repress expression of the tumor suppressor gene FOXO1 in endometrial cancer.Cancer Res, 2010,70(1):367-377

[9]Goto T,Takano M,Albergaria A,et al.Mechanism and functional consequences of loss of FOXO1 expression in endometrioid endometrial cancer cells.Oncogene,2008,27(1):9-19

[10]GuttillaIK,White BA.Coordinate regulation of FOXO1 by miR-27a,miR-96,and miR-182 in breast cancer cells.J Biol Chem,2009,284(35):23204-23216

RELATIONSHIP BETWEEN EXPRESSION OF FOXO1 PROTEIN AND CELLPROLIFERATION AND APOPTOSIS IN BREAST CANCER

Yan Yahui Qian Yanchun1＊
(Department ofPathology,B asic Medical College,Central South University,Hunan Changsha4100781Yongzhou Occupational and Technological College,Yongzhou425006,China)

Objective To investigate the relationship between the expression of FOXO1 protein and the cell proliferation and apoptosis in breast cancer.Methods Immunohistochemistry was used to detect expressions of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins in 60 breast infiltrating duct carcinomas,21 intraductal carcinomas,30 intraductal papillomas and 15 normal breast tissues.Results The positive rates and expression intensity of FOXO1 and activated caspase-3 proteins in breast infiltrating duct carcinomas and intraductal carcinomas were significantly lower than those in intraductal papillomas and normal breast tissues.The positive rates and expression intensity of Ki-67 protein in breast infiltrating duct carcinomas and intraductal carcinomas were significantly higher than those in intraductal papillomas and normal breast tissues.The expression strength of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins were no related to the pathological grade of cancer tissues in breast infiltrating duct carcinomas.The expression intensity of FOXO1 protein was significantly negatively correlated with that of Ki-67 protein,and positively correlated with that of activated caspase-3 protein in all the cases.Conclusion The down regulation of FOXO1 protein expression may be related to breast carcinogenensis.The FOXO1 protein may be a down-regulator of cell proliferation and promoter of apoptosis.FOXO1 gene may become an effective target for the gene therapy of breast cancer.

Breast cancer;FOXO1;Cell proliferation;Apoptosis

R329

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.015

2010-01-05

2010-03-01

顏亞暉,女(1971年),漢族,實(shí)驗(yàn)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)