蛋白酶預(yù)處理對(duì)玉米蛋白粉中葉黃素提取的影響

周海勝，蔣凌志，黃 梅*

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027)

蛋白酶預(yù)處理對(duì)玉米蛋白粉中葉黃素提取的影響

周海勝，蔣凌志，黃 梅*

(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027)

選用玉米蛋白粉為原料，通過(guò)蛋白酶預(yù)處理再進(jìn)行有機(jī)溶劑提取的方式制備葉黃素。與玉米蛋白粉中葉黃素的非酶解直接提取法相比，原料玉米蛋白粉采用最佳蛋白酶水解工藝預(yù)處理后(中性蛋白酶，酶用量為14000U/g玉米蛋白粉，液固比為20:1(mL/g)，溫度40℃，水解時(shí)間5h)，不但使葉黃素的提取量由非酶解直接提取的165.3μg/g提高到340.5μg/g，而且浸提時(shí)間由5h縮短為20min。

葉黃素；玉米蛋白粉；蛋白酶水解；提取

葉黃素(xanthophylls)又名“植物黃體素”，是一種“類(lèi)胡蘿卜素”族物質(zhì)，包括黃體素(lutein)、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)與β-隱黃質(zhì)(β-cryptoxanthin)等，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示[1]。葉黃素雖然不是VA前體，但對(duì)人體具有重要的生理功能。特別是在慢性疾病防治方面，黃體素和玉米黃質(zhì)具有區(qū)別于其他類(lèi)胡蘿卜素的特殊作用，如保護(hù)視力、預(yù)防心血管疾病和抗癌以及增強(qiáng)免疫力等[2-4]。

玉米蛋白粉(corn gluten meal，CGM)是生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)物，長(zhǎng)期以來(lái)主要作為廉價(jià)的畜禽飼料或隨廢液自然排放。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年隨廢液自然排放的玉米蛋白粉在8萬(wàn)t以上，不僅造成資源浪費(fèi)，而且還會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染[5]。通過(guò)對(duì)玉米蛋白粉進(jìn)行深加工處理得到天然葉黃素，能有效提高玉米和玉米蛋白粉的工業(yè)附加值，因此相關(guān)研究具有重要意義。

圖1 主要葉黃素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structures of xanthophylls

目前，從玉米蛋白粉中提取天然色素的方法主要是直接浸提法，采用70%～95%乙醇提取濃縮后得到葉黃素粗制品。由于直接浸提法只是將游離于蛋白粉顆粒表面的色素溶解，所以葉黃素的提取量普遍較低。選用蛋白酶水解以破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、切斷葉黃素與其他組分的連接，應(yīng)是增加葉黃素提取量的一種可行的方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行相關(guān)研究。另外，表征方面因采用HPLC法定量，通過(guò)使用YMC-C30類(lèi)胡蘿卜素專(zhuān)用色譜柱大大提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉 河北省唐山市燕山玉米淀粉廠；黃體素標(biāo)樣(質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%) 上海華震科技有限公司；玉米黃質(zhì)標(biāo)樣(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%) 陜西森弗生物有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶 龐博生物工程有限公司；蜜蜂牌酸性蛋白酶 北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司；四氫呋喃、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼砂等均為AR級(jí)試劑，未純化直接使用。

1.2 儀器與設(shè)備

7821型磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市江南儀器廠；DHG29070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE52299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DELTA320 pH計(jì)、電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TDL80-2B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Evolution RC離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；Spectrumlab53-54紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司； Waters高效液相色譜儀(Waters 515高效液相色譜單元泵，Waters 2487雙波段紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，Waters 717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器) 沃特世(Waters)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

以四氫呋喃為溶劑配制成360μg/mL黃體素溶液、1034μg/mL玉米黃質(zhì)溶液，使用時(shí)分別稀釋成系列質(zhì)量濃度。以葉黃素質(zhì)量濃度為例，稀釋成36、3.6、0.36、0.036μg/mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：YMC-Carotenoid液相色譜柱(C30，3μm，4.6mm×150mm)；流動(dòng)相：甲醇:四氫呋喃:水=95:2:3(V/V)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃。

1.3.3 游離類(lèi)胡蘿卜素總含量的測(cè)定

游離總類(lèi)胡蘿卜素含量測(cè)定采用AACC(American Association of Cereal Chemist)法[6]。精確稱(chēng)取3份1g左右玉米蛋白粉(精確到0.0002g)，各加入40mL水飽和正丁醇溶液，置于25℃恒溫振蕩箱內(nèi)避光輕微振蕩3h(80r/min)，經(jīng)布氏漏斗過(guò)濾得濾液，量取濾液體積。以水飽和正丁醇溶液為空白，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)435.8nm處測(cè)定濾液的吸光度，再根據(jù)吸光系數(shù)計(jì)算每克玉米蛋白粉中游離的總類(lèi)胡蘿卜素含量，3次平均即得最后結(jié)果。

式中：A為樣品吸光度；V為提取液體積/mL；為檢測(cè)波長(zhǎng)下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的溶液在光程1cm的比色皿中的吸光度(水飽和正丁醇中m為樣品質(zhì)量/g。

游離黃體素與玉米黃質(zhì)：由上述所得水飽和正丁醇濾液取樣進(jìn)HPLC分析，用外標(biāo)法計(jì)算游離的黃體素和玉米黃質(zhì)的含量。

1.3.4 提取溶劑的選擇

取5g左右玉米蛋白粉置于100mL具塞錐形瓶中，分別加入50mL甲醇、乙醇、工業(yè)酒精、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃、正己烷、石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯和乙醚，避光提取6h，經(jīng)布氏漏斗過(guò)濾得濾液，量取濾液體積后分別取樣進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定葉黃素的含量，并計(jì)算葉黃素提取量。

式中，葉黃素含量=黃體素含量+玉米黃質(zhì)含量(其他葉黃素含量低，忽略不計(jì))。

1.3.5 酶活力及剩余酶活力的測(cè)定

酶活力根據(jù)參考文獻(xiàn)采用福林法測(cè)定[7]。配制質(zhì)量濃度25μg/mL的酶溶液250mL，放在40℃恒溫箱中，按時(shí)段取出1mL測(cè)酶活力，再與初始酶活力相比、取百分?jǐn)?shù)，即可得剩余酶活力。

1.3.6 蛋白酶水解

稱(chēng)取5.000g玉米蛋白粉置于250mL錐形瓶中，加入蛋白酶溶液，攪拌混勻，恒溫振蕩箱中水解指定時(shí)間，棄去上清液。再加入50mL無(wú)水甲醇避光提取0.5h，收集濾液并進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

經(jīng)紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)掃描，四氫呋喃溶液中黃體素和玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)為450nm，因此選擇液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。圖2為黃體素和玉米黃質(zhì)混合標(biāo)樣的液相色譜圖。

黃體素和玉米黃質(zhì)的混合標(biāo)樣采用等強(qiáng)梯度洗脫，只需26min即可將黃體素和玉米黃質(zhì)洗脫出來(lái)，兩者分離度為4.4。與一般類(lèi)胡蘿卜素梯度洗脫的HPLC分析結(jié)果相比，不但達(dá)到基線(xiàn)分離且峰形對(duì)稱(chēng)無(wú)明顯拖尾，表明該條件能進(jìn)行黃體素和玉米黃質(zhì)的有效分析。以峰面積-質(zhì)量濃度作圖，得出黃體素和玉米黃質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：黃體素，lgY=－4.97136+0.99699lgX，R=0.99998，最低檢測(cè)限(RSN=2)為0.0104μg/mL；玉米黃質(zhì)，lgY=－4.46959＋0.97756lgX，R=0.99988，最低檢測(cè)限(RSN=2)為0.0395μg/mL。

圖2 葉黃素和玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of lutein and zeaxanthin standards

圖3為原料玉米蛋白粉經(jīng)有機(jī)溶劑直接(非酶解)提取濃縮液的色譜圖，可以看出產(chǎn)物中除黃體素和玉米黃質(zhì)這兩種葉黃素外，還有其他類(lèi)胡蘿卜素物質(zhì)。2～5min對(duì)應(yīng)的是極性較強(qiáng)的雜質(zhì)，35min后出現(xiàn)的物質(zhì)為胡蘿卜素等弱極性物質(zhì)，如β-胡蘿卜素。由于β-隱黃質(zhì)分子只有一個(gè)羥基，極性介于胡蘿卜素與玉米黃質(zhì)之間，故推測(cè)保留時(shí)間為31min左右的是β-隱黃質(zhì)[8]。通過(guò)計(jì)算可知，主要葉黃素質(zhì)量濃度為黃體素95.8μg/mL、玉米黃質(zhì)310.9μg/mL，即玉米蛋白粉中玉米黃質(zhì)的含量是黃體素含量的3倍左右。

圖3 玉米蛋白粉提取樣品的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of the extract from corn gluten meal

2.2 游離類(lèi)胡蘿卜素的測(cè)定

通過(guò)AACC法測(cè)定，原料玉米蛋白粉中游離總類(lèi)胡蘿卜素含量為228.3μg/g。由HPLC法測(cè)得原料玉米蛋白粉中游離葉黃素含量為203.6μg/g，其中，黃體素46.2μg/g，玉米黃質(zhì)157.4μg/g，原料玉米蛋白粉中游離的葉黃素約占游離總類(lèi)胡蘿卜素的89%。因?yàn)橛袡C(jī)溶劑直接(非酶解)提取中葉黃素最大提取量為203.6μg/g，所以通過(guò)對(duì)原料的預(yù)處理，使部分處于絡(luò)合狀態(tài)的葉黃素游離出來(lái)，是進(jìn)一步提高其提取量的有效途徑。

2.3 非酶解提取葉黃素

保持提取溫度25℃、提取時(shí)間6h和液固比10:1(mL/g)不變，考察不同溶劑對(duì)葉黃素直接提取效果的影響。如圖4所示，無(wú)水甲醇對(duì)葉黃素提取效果最好，提取量可達(dá)165.3μg/g，約占游離葉黃素總量的81.2%。其次是工業(yè)酒精、二氯甲烷和乙醇，葉黃素提取量分別為40.9、32.0、27.5μg/g；其他溶劑的提取效果相對(duì)較差，如丙酮、四氫呋喃、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醚等的葉黃素提取率分別只有11.8、11.8、3.5、3.3、5.9、8.6μg/g。

圖4 不同溶劑直接提取對(duì)葉黃素提取量的影響Fig.4 Effect of organic solvents on the direct extraction of xanthophylls without pre-treatment

不同有機(jī)溶劑的提取效果相差很大，與目標(biāo)物的溶解度、分子極性、材料的親和性等因素有關(guān)[9-10]。甲醇和乙醇提取葉黃素效果最好，是因?yàn)榧状己鸵掖紭O性較強(qiáng)、親水性好的特點(diǎn)使它們更容易滲透到玉米蛋白粉顆粒內(nèi)部，將大部分葉黃素溶解出來(lái)，故后續(xù)工藝中確定均以甲醇作為葉黃素的提取溶劑。

2.4 玉米蛋白粉酶解預(yù)處理工藝

2.4.1 蛋白酶的選擇

在40℃條件用福林法測(cè)定，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和酶堿性蛋白酶活力分別為0.5、55.5、25.5萬(wàn)U/g。

保持酶解溫度40℃、酶解時(shí)間5h不變，分別在酶用量11000U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)(條件1)；酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比10:1(mL/g)(條件2)；酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)(條件3)3種不同情況下處理玉米蛋白粉，再以甲醇提取葉黃素，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，所有實(shí)驗(yàn)條件下經(jīng)中性蛋白酶處理后提取葉黃素均能獲得最高的提取量，堿性蛋白酶次之，酸性蛋白酶最低，這與中性蛋白酶的活力最高、相同條件下水解玉米蛋白粉充分有關(guān)。此外，中性蛋白酶處理后葉黃素的提取量均高于非酶解甲醇直接提取的提取量(165.3μg/g)。而且在酶用量11000U/g玉米蛋白粉、液固比20:1(mL/g)的條件下，提取量超過(guò)了原料玉米蛋白粉中游離的葉黃素總含量(203.6μg/g)，達(dá)到了328.6μg/g，說(shuō)明經(jīng)中性蛋白酶酶解處理后，一部分絡(luò)合的葉黃素被釋放出來(lái)。而堿性蛋白酶和酸性蛋白酶預(yù)處理后葉黃素的提取量偏低，可能是由于葉黃素在酸堿環(huán)境中不穩(wěn)定造成的，已有研究表明在酸性環(huán)境中，類(lèi)胡蘿卜素容易發(fā)生由H+或路易斯酸親電試劑引發(fā)的加成反應(yīng)而導(dǎo)致降解[11]。由此確定中性蛋白酶為玉米蛋白粉預(yù)處理的最佳蛋白酶。

條件1：酶用量11000U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)；條件2：酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比10:1(mL/g)；條件3：酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)；水解時(shí)間和溫度均為5h、40℃。

2.4.2 酶解時(shí)間對(duì)葉黃素提取量的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)葉黃素提取量的影響Fig.6 Effect of hydrolysis duration on extraction efficiency of xanthophylls

固定酶用量11000U/g玉米蛋白粉，溫度40℃，液固比20:1(mL/g)，控制酶解時(shí)間分別為0、1、2、3、5、7、9h。結(jié)果如圖6所示，可以看出酶解反應(yīng)比較耗時(shí)，酶解1h內(nèi)葉黃素的提取量變化不大，2～5h之間隨著時(shí)間增大提取量顯著增大，是酶解反應(yīng)控制階段。5h后提取量不再顯著增加。測(cè)定40℃下中性蛋白酶剩余酶活力隨時(shí)間的變化(圖7)，可以看出5h時(shí)蛋白酶活力已不足初始活力的30%，造成5h后對(duì)玉米蛋白粉的水解效果變小。綜合考慮生產(chǎn)效率與葉黃素提取量，選取酶解時(shí)間為5h。

圖7 中性蛋白酶的穩(wěn)定性Fig.7 Storage stability of the neutral protease used in this study

2.4.3 液固比對(duì)葉黃素提取量的影響

固定酶用量11000U/g玉米蛋白粉、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間5h不變，分別以液固比5:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1(mL/g)對(duì)原料玉米蛋白粉進(jìn)行酶解反應(yīng)，再用甲醇提取葉黃素后計(jì)算葉黃素提取量。由圖8可知，在液固比5～20mL/g范圍內(nèi)時(shí)，隨著液固比加大，葉黃素提取量也隨之增大，這是由于在此范圍內(nèi)加大液固比可以使酶分子和酶解產(chǎn)物更容易分散，從而加快了酶解速度[12]，相同時(shí)間內(nèi)使更多的處于絡(luò)合狀態(tài)的葉黃素被釋放出來(lái)。當(dāng)液固比增大到一定程度時(shí)，再增加液固比對(duì)酶解反應(yīng)影響不大，反而會(huì)增加生產(chǎn)成本。當(dāng)液固比為20:1(mL/g)時(shí)葉黃素提取為328.6μg/g，已接近最大值，因而選擇液固比為20:1(mL/g)。

圖8 液固比對(duì)葉黃素提取量的影響Fig.8 Effect of liquid/solid ratio on extraction efficiency of xanthophylls

2.4.4 酶解溫度對(duì)葉黃素提取量的影響

酶反應(yīng)對(duì)溫度要求比較苛刻。固定酶用量11000U/g玉米蛋白粉、液固比20:1(mL/g)、以及酶解時(shí)間5h，考察酶的最佳反應(yīng)溫度。30、40、50℃時(shí)處理玉米蛋白粉，所得葉黃素提取量分別為211.1、328.5、350.7μg/g。在30～50℃時(shí)，升高溫度能提高葉黃素的提取量，但環(huán)境溫度超過(guò)40℃就會(huì)對(duì)葉黃素的穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響[13]，而且過(guò)高的溫度會(huì)加速蛋白酶的失活，為了減少這兩方面的影響，選擇40℃作為酶解最佳溫度。結(jié)果如圖9所示。

圖9 酶解溫度對(duì)葉黃素提取量的影響Fig.9 Effect of hydrolysis temperature on extraction efficiency of xanthophylls

2.4.5 酶用量對(duì)葉黃素提取量的影響

固定液固比20:1(mL/g)、酶解溫度40℃、酶解時(shí)間5h，考察中性蛋白酶用量對(duì)葉黃素提取量的影響，結(jié)果如圖10所示?？梢钥闯?，在底物(玉米蛋白粉)濃度相同的條件下，酶用量在0～14000U/g玉米蛋白粉范圍內(nèi)，隨著酶用量的增加相同時(shí)間內(nèi)對(duì)等量的玉米蛋白粉的水解作用將增大，從而使葉黃素的提取量也隨之增大。當(dāng)中性蛋白酶用量為14000U/g玉米蛋白粉時(shí)，葉黃素提取率達(dá)到了340.5μg/g，因此取14000U/g玉米蛋白粉作為中性蛋白酶的最佳用量。

圖10 酶用量對(duì)葉黃素提取量的影響Fig.10 Effect of enzyme load on extraction efficiency of xanthophylls

2.5 酶解與非酶解法提取葉黃素

分別取非酶解處理的樣品和經(jīng)最佳酶解工藝處理過(guò)的樣品9個(gè)，其葉黃素提取量和萃取時(shí)間的關(guān)系如圖11所示?？梢钥闯?，非酶解處理的玉米蛋白粉經(jīng)甲醇浸提，大約5h后葉黃素提取量達(dá)到最大值(165μg/g左右)；而經(jīng)最佳酶解工藝處理過(guò)的玉米蛋白粉，只需20min即可獲得最大提取量(340μg/g左右)，提取效率獲得極大地提高。其原因之一是蛋白酶的水解作用破壞了蛋白質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使絡(luò)合的葉黃素呈游離態(tài)而進(jìn)入提取液中，已有研究表明葉黃素(包括黃體素和玉米黃質(zhì))確實(shí)和蛋白質(zhì)以復(fù)合物的形式存在于天然產(chǎn)物中[14-15]。原因之二是酶解作用使玉米蛋白粉顆粒尺寸變小，增大了固相的比表面積，液固萃取的傳質(zhì)效率提高，以致葉黃素提取量比非酶解時(shí)提高將近一倍的同時(shí)提取時(shí)間大為降低。

圖11 蛋白酶水解對(duì)葉黃素浸提時(shí)間的影響Fig.11 Time courses of extraction efficiency of xanthophylls with and without proteolytic pre-treatment

3 結(jié) 論

結(jié)合AACC法，采用C30-HPLC測(cè)出原料玉米蛋白粉中的類(lèi)胡蘿卜素主要為兩種葉黃素，游離葉黃素的含量大約為203.6μg/g。運(yùn)用蛋白酶水解預(yù)處理玉米蛋白粉的方法提取葉黃素，其提取量可達(dá)340.5μg/g，比非酶解直接提取的165.3μg/g提高了106%，說(shuō)明玉米蛋白粉中確實(shí)有一部分葉黃素與蛋白質(zhì)等其他組分呈絡(luò)合狀態(tài)，直接有機(jī)溶劑提取無(wú)法將這部分葉黃素提取出來(lái)；而采用蛋白酶水解預(yù)處理原料的方式可以有效地將這一部分葉黃素釋放出來(lái)，從而極大地提高葉黃素的得率。

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Effect of Proteolytic Pre-treatment on the Extraction of Xanthophylls from Corn Gluten Meal

ZHOU Hai-sheng，JIANG Ling-zhi，HUANG Mei*
(Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

After being pre-treated with protease, corn gluten meal

organic solvent extraction to obtain xanthophylls.Neutral protease was selected out of three commercially available proteases to pretreat corn gluten meal due to the highest extraction efficiency of xanthophylls, and methanol was found to be the best solvent for the extraction of xanthophylls among the ten solvents tested. The optimal conditions for neutral protease hydrolysis were determined to be: enzyme load, 14000 U/g substrate, liquid/solid ratio, 20:1; reaction temperature 40 ℃; and reaction duration, 5 h. Compared with direct extraction without proteolytic pre-treatment, the optimized neutral protease hydrolysis resulted in an increase of extraction efficiency of xanthophylls from 165.3 to 340.5 μg/g and a reduction of extraction duration from 5 hour to 20 min.

xanthophylls；corn gluten meal；proteolytic hydrolysis；extraction

TS202.3

A

1002-6630(2010)20-0052-06

2010-01-06

周海勝(1984—)，男，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物分離研究。E-mail：20709327@zju.edu.cn

*通信作者：黃梅(1969—)，女，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物分離和功能高分子材料合成研究。

E-mail：huangm@zju.edu.cn