黃河，李建芳，古秀雯，湯耀卿

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，山西太原030001；2.上海消化外科研究所，上海200025；3.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院外科ICU，上海200025）

年齡或性別對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的影響

黃河1，李建芳2，古秀雯3，湯耀卿3

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，山西太原030001；2.上海消化外科研究所，上海200025；3.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院外科ICU，上海200025）

目的：研究年齡或性別對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（cEPCs）數(shù)量的影響。方法：220例符合標(biāo)準(zhǔn)的健康成年志愿者均來自上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院體檢中心。所有志愿者根據(jù)年齡分為四組：＜30歲組（n=54）；30～49歲組（n=62）；50～69歲組（n=59）；＞69歲組（n=45）。每個(gè)年齡組志愿者按性別再分組。以CD34+、CD133+、VEGFR-2+為表型標(biāo)志，采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)并對(duì)比志愿者cEPCs數(shù)量。結(jié)果：220例志愿者cEPCs數(shù)量不符合正態(tài)分布，因而取相應(yīng)的自然對(duì)數(shù)值，使其符合正態(tài)分布。相同性別志愿者或全部志愿者的cEPCs數(shù)量自然對(duì)數(shù)值在不同年齡組組間無顯著性差異（男性：F=1.234，P=0.301；女性：F=0.274，P=0.844；全部：F=1.078，P=0.359）。同時(shí)，在各年齡組或全部志愿者，男性和女性的cEPCs數(shù)量自然對(duì)數(shù)值之間無顯著性差異（＜30歲組：t=0.699，P=0.488：30～49歲組：t=0.772，P= 0.443；50～69歲組：t=-0.516，P=0.608；＞69歲組：t=-0.480，P=0.634；全部：t=0.216，P=0.829）。結(jié)論：年齡或性別對(duì)cEPCs數(shù)量沒有影響。

循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞；年齡；性別

1997年，在成年人外周血中發(fā)現(xiàn)EPCs[1]以來，越來越多的研究顯示，EPCs在機(jī)體出生后血管ECs損傷修復(fù)和新生血管形成中起重要作用[2-3]。近來的研究提示，循環(huán)中骨髓來源的EPCs可以修復(fù)內(nèi)皮的損傷[2，4]。Hill等[5]總結(jié)了已有的研究后認(rèn)為，cEPCs數(shù)量的變化可以反映血管內(nèi)皮損傷的程度，對(duì)心血管疾病的預(yù)后具有重要預(yù)測(cè)意義，其預(yù)測(cè)價(jià)值甚至優(yōu)于Framingham危險(xiǎn)因素評(píng)分；但是，目前對(duì)EPCs如何發(fā)揮上述作用的機(jī)制還不清楚，甚至關(guān)于年齡或性別對(duì)cEPCs數(shù)量是否存在影響還存在爭(zhēng)論。

研究顯示，引起心血管疾病的危險(xiǎn)因素，如高血壓和吸煙可以使cEPCs的數(shù)量減少以及功能活性降低[6-7]。高齡也是心血管疾病的顯著危險(xiǎn)因素，但是關(guān)于年齡對(duì)cEPCs數(shù)量的影響還未達(dá)成一致的認(rèn)識(shí)。有研究報(bào)道，隨著年齡的增高，cEPCs的數(shù)量減少[6，8-9]；也有研究顯示，年齡和cEPCs的數(shù)量沒有相關(guān)性[10-11]。同樣由于缺少系統(tǒng)研究，另一個(gè)危險(xiǎn)因素性別對(duì)cEPCs數(shù)量的影響也沒有明確。

為了更好地了解EPCs在不同生理或病理?xiàng)l件下的作用，筆者通過對(duì)健康成年人群外周血EPCs數(shù)量的觀察，來明確上述基本問題。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

均來自于上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院體檢中心的健康成年體檢者。本次體檢各項(xiàng)指標(biāo)均正常，并除外有以下情況者：心血管疾病、高脂血癥、糖尿病、急/慢性呼吸系統(tǒng)疾病、急/慢性炎癥、自身免疫性疾病、腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、器官移植受者、月經(jīng)期女性，使用他汀類、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、激活蛋白C、雌激素或皮質(zhì)醇類藥物者，以及一年內(nèi)有吸煙、手術(shù)或創(chuàng)傷及其后遺癥者。

符合標(biāo)準(zhǔn)的志愿者（n=220，男女比例為110∶110）分為四個(gè)年齡組：＜30歲組，n=54，男女比例為25∶29；30～49歲組，n= 62，男女比例為29∶33；50～69歲組，n=59，男女比例為31∶28；＞69歲組，n=45，男女比例為25∶20。同時(shí)每個(gè)年齡組按性別再分組。

1.2 血樣采集

入選體檢志愿者，由肘靜脈采集3 ml外周靜脈血（普通肝素鈉60 U/ml抗凝）用于EPCs檢測(cè)。

1.3 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)

檢測(cè)步驟與Neysan Rafat的敘述類似[12]。所有血樣均在采集后4 h內(nèi)處理。通過梯度離心法收集PBMCs；加入FcRblocking試劑孵化10 min，封閉非特異性結(jié)合；加入PECD133，PerCP-cy5.5-CD34和APC-VEGFR-2三種抗體，于4°C避光孵育30 min；相應(yīng)同型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照；將細(xì)胞洗滌3次，去除未結(jié)合抗體，重新懸浮細(xì)胞于200 μl 1%多聚甲醛溶液中。FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）檢測(cè)。每份樣本收集950 000個(gè)細(xì)胞。CD34+、CD133+、VEGFR-2+細(xì)胞為EPCs13，以個(gè)/106PBMCs為單位，表示cEPCs數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

柯爾莫哥諾夫-斯米爾諾夫方法（Kolmogorov-Smirnov Test）檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布。如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布數(shù)據(jù)（通過取其自然對(duì)數(shù)的方法），再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。方差分析或t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析組間差異。以P＜0.05為有顯著性差異。采用SAS 8.2軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性檢驗(yàn)和數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換

柯爾莫哥諾夫-斯米爾諾夫檢驗(yàn)顯示入選志愿者cEPCs數(shù)量數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布（Z=2.113，P＜0.01），見圖1。將數(shù)據(jù)分別取相應(yīng)的自然對(duì)數(shù)值，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布（Z=0.572，P=0.899），見圖2。

2.2 年齡對(duì)cEPCs數(shù)量的影響

相同性別志愿者或全部志愿者的cEPCs數(shù)量自然對(duì)數(shù)值在不同年齡組組間無顯著性差異（男性：F=1.234，P=0.301；女性：F=0.274，P=0.844；全部：F=1.078，P=0.359），見圖3。

2.3 性別對(duì)cEPCs數(shù)量的影響

在各年齡組或全部志愿者，男性和女性的cEPCs數(shù)量自然對(duì)數(shù)值間無顯著性差異（＜30歲組：t=0.699，P=0.488；30～49歲組，t=0.772，P=0.443；50～69歲組：t=-0.516，P=0.608；＞69歲組：t=-0.480，P=0.634；全部：t=0.216，P=0.829），見圖4。

3 討論

在筆者的研究中，排除已知對(duì)cEPCs數(shù)量有影響的因素后，年齡成為唯一的影響因素。通過對(duì)大樣本（220例）健康成年人的觀察，筆者發(fā)現(xiàn)，cEPCs數(shù)量并沒有隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生變化；而早期的一些研究[6，8-9]認(rèn)為，高齡是使cEPCs數(shù)量減少的因素之一，但是隨后的一些研究結(jié)果卻與之相矛盾。Rebecca的研究發(fā)現(xiàn)，健康年輕人[（33±8）歲,n=9]與健康老年人[（66±8）歲，n=13]cEPCs數(shù)量無顯著性差異。Yamada等[10]在肺炎患者研究中也顯示年齡和cEPCs的數(shù)量無顯著相關(guān)性（r=20.255，P=0.101 6）。這些研究的樣本例數(shù)都有限，因而結(jié)論出現(xiàn)矛盾卻說服力不足。

對(duì)于上述矛盾的結(jié)果，有學(xué)者提出假設(shè)，年齡增長(zhǎng)可能影響的是cEPCs功能，而不是cEPCs數(shù)量[13]。然而，Morrison等[14]研究顯示衰老的骨髓細(xì)胞仍然具有在衰竭骨髓居住和分化傳代的能力，這就表明老化骨髓來源祖細(xì)胞仍然保持著全部功能。為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，Chang等[15]進(jìn)行了深入研究，結(jié)果顯示年輕人（n=18，18～35歲）和老年人（n=21，68～95歲）的cEPCs數(shù)量及功能（分化、遷移和增殖）無顯著性差異。但是，眾所周知，高齡是血管內(nèi)皮損傷的確切危險(xiǎn)因素，那么，隨著年齡增加內(nèi)皮修復(fù)功能是如何減弱的呢？近來，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性內(nèi)皮修復(fù)功能減弱是由于損傷組織無法釋放引起EPCs動(dòng)員的信號(hào)分子，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stroma-cell derived factor-1α，SDF-1α）[15-16]或VEGF[8，17]，而不是直接影響EPCs的數(shù)量或功能。此外，Hattiangady等[18]證實(shí)，高齡不會(huì)使神經(jīng)干/祖細(xì)胞（neural stem/progenitor cell，NSC）的數(shù)量減少，但可以改變NSC所處的環(huán)境，使處于靜止期的NSC數(shù)量增加，進(jìn)而抑制神經(jīng)發(fā)生。這一結(jié)果提示，年齡增長(zhǎng)可能也會(huì)使更多的EPCs停留于靜止期而無法參與血管內(nèi)皮修復(fù)和新生血管形成。這些研究提示，老年人血管內(nèi)皮修復(fù)功能減弱是因?yàn)橛泄δ艿腸EPCs數(shù)量減少，而不是cEPCs的總數(shù)量減少。該結(jié)論間接支持了本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果。

至于性別對(duì)cEPCs數(shù)量的影響，目前還沒有專門的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，不論是不同年齡組還是所有志愿者中，男性與女性之間的cEPCs數(shù)量沒有差異，結(jié)果表明性別也不影響cEPCs的數(shù)量。Hoetzer等[19]發(fā)現(xiàn)中年女性[（58±1）歲，n=25]的EPCs功能（克隆形成能力：16±3 vs 7±1；遷移能力：729±74 vs 530±67）高于中年男性[（59±1）歲，n=25]。這些結(jié)果提示，性別影響EPCs的功能，而不影響EPCs的數(shù)量。

目前，EPCs作為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，已經(jīng)從心血管疾病擴(kuò)展到組織工程、炎癥性血管內(nèi)皮損傷和修復(fù)等廣泛的研究與應(yīng)用領(lǐng)域。本研究組通過年齡和性別對(duì)cEPCs數(shù)量的影響入手，闡明了EPCs的眾多研究所涉及但未系統(tǒng)觀察和分析的一個(gè)基本問題，也為筆者在炎癥領(lǐng)域開展關(guān)于EPCs研究奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，年齡或性別對(duì)健康成年人的cEPCs數(shù)量無影響。筆者的研究為進(jìn)一步理解EPCs在生理或病理?xiàng)l件下的作用奠定了重要基礎(chǔ)。

[1]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.

[2]Shi Q,Rafii S,Wu MH,et al.Evidence for circulating bone marrowderived endothelial cells[J].Blood,1998,92(2):362-367.

[3]Schatteman GC,Dunnwald M,Jiao C.Biology of bone marrow-derived endothelial cell precursors[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007,292(1):H1-18.

[4]Wang HY,Gao PJ,Ji KD,et al.Circulating endothelial progenitor cells, C-reactive protein and severity of coronary stenosis in Chinese patients with coronary artery disease[J].Hypertens Res,2007,30(2):133-141.

[5]Hill JM,Zalos G,Halcox JP,et al.Circulating endothelial progenitor cells,vascular function,and cardiovascular risk[J].N Engl J Med, 2003,348(7):593-600.

[6]Vasa M,Fichtlscherer S,Aicher A,et al.Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease[J].Circ Res,2001,89(1):E1-7.

[7]Kondo T,Hayashi M,Takeshita K,et al.Smoking cessation rapidly increases circulating progenitor cells in peripheral blood in chronic smokers[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(8):1442-1447.

[8]Scheubel RJ,Zorn H,Silber RE,et al.Age-dependent depression in circulating endothelial progenitor cells in patients undergoing coronary artery bypass grafting[J].J Am Coll Cardiol,2003,42(12):2073-2080.

[9]Eizawa T,Ikeda U,Murakami Y,et al.Increase in circulating endothelial progenitor cells after aortic aneurysm repair[J].Heart Vessels,2004,19(3):107-110.

[10]Yamada M,Kubo H,Ishizawa K,et al.Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with bacterial pneumonia:evidence that bone marrow derived cells contribute to lung repair[J].Thorax,2005,60 (5):410-413.

[11]Shaffer RG,Greene S,Arshi A,et al.Flow cytometric measurement of circulating endothelial cells:the effect of age and peripheral arterial disease on baseline levels of mature and progenitor populations[J]. Cytometry B Clin Cytom,2006,70(2):56-62.

[12]Rafat N,Hanusch C,Brinkkoetter PT,et al.Increased circulating endothelial progenitor cells in septic patients:correlation with survival[J]. Crit Care Med,2007,35(7):1677-1684.

[13]Schmidt-Lucke C,Rossig L,Fichtlscherer S,et al.Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events:proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair[J].Circulation,2005,111(22):2981-2987.

[14]Morrison SJ,Wandycz AM,Akashi K,et al.The aging of hematopoietic stem cells[J].Nat Med,1996,2(9):1011-1016.

[15]Chang EI,Loh SA,Ceradini DJ,et al.Age decreases endothelial progenitor cell recruitment through decreases in hypoxia-inducible factor 1 alpha stabilization during ischemia[J].Circulation,2007,116(24):2818-2829.

[16]Hiasa K,Ishibashi M,Ohtani K,et al.Gene transfer of stromal cellderived factor-1 alpha enhances ischemic vasculogenesis and angiogenesis via vascular endothelial growth factor/endothelial nitric oxide synthase-related pathway:next-generation chemokine therapy for therapeutic neovascularization[J].Circulation,2004,109(20):2454-2461.

[17]Rivard A,Berthou-Soulie L,Principe N,et al.Age-dependent defect in vascular endothelial growth factor expression is associated with reduced hypoxia-inducible factor 1 activity[J].J Biol Chem,2000,275 (38):29643-29647.

[18]Hattiangady B,Shetty AK.Aging does not alter the number or phenotype of putative stem/progenitor cells in the neurogenic region of the hippocampus[J].Neurobiol Aging,2008,29(1):129-147.

[19]Hoetzer GL,MacEneaney OJ,Irmiger HM,et al.Gender differences in circulating endothelial progenitor cell colony-forming capacity and migratory activity in middle-aged adults[J].Am J Cardiol,2007,99(1): 46-48.

Effect of age or gender on circulating endothelial progenitor cells number

HUANG He1,LI Jianfang2,GU Xiuwen3,TANG Yaoqing3
(1.Department of Surgery,the First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China;2.Institute of Digest Surgical Research of Shanghai City,Shanghai200025,China;3.Department of Surgery Intensive Care Unit,Ruijin Hospital Affiliated of Shanghai Jiaotong University,Shanghai200025,China)

Objective:To study the effect of age or gender on circulating endothelial progenitor cells(cEPCs)number.Methods: 220 standards-compliant healthy adult Chinese people were selected from the Health Examination Center of Ruijin Hospital Affiliated of Shanghai Jiaotong University.All subjects were divided into four different groups based on age(＜30 years group of 54 cases;30-49 years group of 62 cases;50-69 years group of 59 cases;and＞69 years group of 45 cases.Meanwhile,subjects were subdivided by gender in each age group.The numbers of cEPCs(identified by flow cytometry as CD133+,CD34+and VEGFR-2+cells)were detected and contrasted among different groups.Results：Data of cEPCs counts of 220 subjects were not in normal distribution,so data transformation was undertaken with calculating the corresponding natural logarithm.The natural logarithms of cEPC counts showed no notable difference among age group in male subjects(F=1.234,P=0.301),female subjects(F=0.274,P=0.844)and all subjects(F=1.078,P=0.359).Meanwhile,there was no significant difference of cEPCs counts′natural logarithms between two genders in each age group and in all sub jects(＜30 years group:t=0.699,P=0.488;30-49 years group:t=0.772,P=0.443;50-69 years group:t=-0.516,P=0.608;＞69 years group:t=-0.480,P=0.634;all subjects:t=0.216,P=0.829).Conclusion:Age or gender are not associated with the level of cEPCs.

Circulating endothelial progenitor cells;Age;Gender

R363

A

1673-7210（2010）12（c）-013-03

2010-11-22）

黃河（1975.4-），男，山西神池人，博士研究生學(xué)歷，主治醫(yī)師；研究方向：外科危重癥。