李麗華 劉文泰 戴 軍 竇玉紅 王 茹 劉艷臣 彭 洋 （河北醫(yī)科大學(xué),石家莊 050091）

大黃素-BSA不同表位構(gòu)型的免疫原性和特異性研究

李麗華 劉文泰 戴 軍 竇玉紅 王 茹 劉艷臣 彭 洋 （河北醫(yī)科大學(xué),石家莊 050091）

目的:研究不同偶聯(lián)法制備大黃素-BSA的大黃素表位構(gòu)型及其免疫原性和特異性。方法:用重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法和琥珀酸酐偶聯(lián)法制備兩種不同表位構(gòu)型的大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗原,免疫小鼠制備抗血清,用醋酸纖維素膜雙向免疫擴(kuò)散法檢測免疫原性及其抗體特異性。結(jié)果:大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗血清與大黃素反應(yīng)的抗體效價分別為1∶144 0±357.771和1∶440±219.089,二者有極顯著性差異（P=0.006）。分別與大黃素等五種蒽醌類化合物反應(yīng),前者對大黃素有較高特異性,抗原結(jié)合效價可達(dá)1∶1 843.2±457.947。后者對大黃素的特異性較低,結(jié)合效價僅為1∶8.8±4.382。結(jié)論:兩種偶聯(lián)法制備大黃素-BSA的表位構(gòu)型不同,其免疫原性和特異性存在著顯著差異。重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法制備大黃素-BSA的免疫原性較高、大黃素特異性較強(qiáng)。

抗原抗體反應(yīng);雙向免疫擴(kuò)散法;大黃素;半抗原-載體偶聯(lián)法;表位

制備抗中藥成分抗體,運(yùn)用抗原抗體檢測技術(shù)定性或定量測定中藥成分,對于鑒定中藥材品質(zhì)和控制中藥制劑質(zhì)量,具有廣闊的應(yīng)用前景。中藥的有效或標(biāo)志性成分,多數(shù)是小分子半抗原,須與大分子載體偶聯(lián)成半抗原-載體復(fù)合物,才具免疫原性,方能制備抗體。在制備半抗原-載體復(fù)合物時,選擇中藥小分子成分（半抗原）與蛋白載體連接的偶聯(lián)方法,決定著半抗原的表位構(gòu)型,直接影響著其免疫原性和特異性。

大黃素為蒽醌類化合物,是蓼科中藥材中常見的有效成分和標(biāo)示性成分。蒽醌母核上6號位酚羥基,是大黃素區(qū)別于大黃素甲醚和大黃酚的特征性結(jié)構(gòu),因此,大黃素是研究半抗原-載體復(fù)合物表位構(gòu)型及其特異性的理想實驗材料[1]。本文以大黃素酚羥基與載體連接的琥珀酸酐偶聯(lián)法和以酚羥基鄰位或?qū)ξ慌c載體連接的重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法,制備了兩種不同表位構(gòu)型的大黃素-牛血清蛋白（BSA）抗原,通過免疫小鼠制備抗血清,研究了兩種抗原的免疫原性和特異性[2,3]。并依據(jù)實驗結(jié)果和大黃素化學(xué)結(jié)構(gòu),探討分析了兩種抗原的大黃素表位構(gòu)型與免疫原性和特異性關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與器材 大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品（DELTA天然有機(jī)化合物信息中心）;小牛血清白蛋白、EDCI（Sigma公司）;透析袋（上海華美生物工程有限公司）;醋酸纖維素膜（浙江四青生化材料廠）;紫外分光光度計（λ-2,1 100 nm,美國PE公司）;其他試劑均為分析純。

1.2 大黃素-BSA的偶聯(lián)方法

1.2.1 重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法[4]取對氨基苯甲酸800mg,亞硝酸鈉400mg溶于三蒸水10ml中,置冰浴中攪拌20分鐘,加少量尿素得重氮鹽溶液。取大黃素140mg溶于2%碳酸鈉溶液（pH9.0）10m l,在不斷攪拌下逐滴加入到重氮鹽溶液中,室溫攪拌25分鐘。然后逐滴加入BSA溶液（BSA 500 mg溶于pH7.4 0.01mol/L PBS 25m l溶液）和EDCI 91mg,避光攪拌20小時。最后將其置于透析袋中,4℃用PBS液透析兩天,期間多次換液,至透析袋外液幾乎無色為止,取透析袋內(nèi)容物,用PBS液調(diào)至50m l,即為大黃素-BSA1,分裝后冷凍保存。

1.2.2 琥珀酸酐偶聯(lián)法[5]取琥珀酸酐80 mg溶于二氧六環(huán)10m l后,加入大黃素140 mg,攪拌溶解,再加入三乙胺0.25m l,置30℃攪拌1小時,待溶液冷卻至室溫后,同1.2.1法制得大黃素-BSA 2。

1.2.3 大黃素-BSA結(jié)合比的測定與計算[2]大黃素-BSA結(jié)合比,即每分子BSA所結(jié)合大黃素的分子數(shù)。用紫外分光光度計對大黃素、BSA、大黃素-BSA和末次透析外液,從波長200 nm到600 nm進(jìn)行掃描,取 450 nm 處吸光度 ,依公式 N=（E半抗原-載體復(fù)合物-E載體）/E半抗原,計算大黃素-BSA 結(jié)合比。E=（A/CL）×M/10（L為測定時液層厚度,M為吸光物質(zhì)的摩爾質(zhì)量,A為所測吸光度,C為被測物濃度,C大黃素-BSA以CBSA為準(zhǔn)）。第一次計算時,因尚不清楚每分子BSA所結(jié)合大黃素的分子數(shù),故取BSA的M值作為大黃素-BSA的估算值,所得結(jié)合比需進(jìn)行再次回歸計算,再次回歸計算時M大黃素-BSA=68000+270×N。

1.3 抗血清的制備

1.3.1 實驗動物及其分組 雌性昆明小鼠,6周齡,體重20克,清潔級,購于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,合格證號903041,自行飼養(yǎng)。隨機(jī)分成大黃素-BSA1組、大黃素-BSA2組、實驗對照組,每組5只。

1.3.2 免疫小鼠制備抗血清 初次免疫取抗原0.3 ml與等量不完全弗氏佐劑混合乳化后,多點皮下注射0.1 ml/只。兩周后同上法加強(qiáng)免疫一次,免疫劑量為0.08ml/只。再間隔兩周,用不加佐劑的抗原皮下注射0.05m l/只。實驗對照組分別用PBS液取代抗原,同法皮下注射免疫。末次免疫后第4天,球后動脈放血制血清,-20℃冷凍保存。

1.4 大黃素-BSA的免疫原性及特異性檢測

1.4.1 抗原反應(yīng)液的制備 分別取大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸的標(biāo)準(zhǔn)品各1mg,溶于1.5 ml無水乙醇,加 PBS液至2.5 ml,制成60%乙醇溶解的抗原反應(yīng)液。

1.4.2 大黃素-BSA的免疫原性檢測 用醋酸纖維素膜雙向免疫擴(kuò)散法,在96孔板的一排各孔中,分別依次加入用 PBS稀釋的抗血清 1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 和 PBS 對照各 0.2 ml;間隔兩排的對應(yīng)各孔,加入大黃素抗原反應(yīng)液（0.4mg/ml）各0.2ml,每組設(shè)3個同水平復(fù)孔。將醋酸纖維素膜剪成55mm×5mm小條,小條兩端分別插入抗血清和大黃素抗原的對應(yīng)孔內(nèi),置于濕盒內(nèi)室溫擴(kuò)散2小時。取出醋酸纖維素膜條,依次用0.5%氨基黑蛋白染液染色1分鐘、PBS漂洗2次、2%冰醋酸水溶液脫色。肉眼觀察醋酸纖維素膜條中段形成沉淀線情況,取最大稀釋度抗血清仍能形成沉淀線作為抗體效價。用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,取本組5只鼠抗血清抗體效價的對數(shù)值,進(jìn)行秩和檢驗,判定各組抗原的免疫原性。

1.4.3 大黃素-BSA的特異性檢測 分別取五種蒽醌類化合物的抗原反應(yīng)液,在96孔板一排的各孔中分別依次加入用60%乙醇稀釋的1∶2、1∶4、1∶8、1∶16直至1∶4 096的倍比稀釋液和空白對照（60%乙醇液）0.2m l,間隔兩排的對應(yīng)孔加入抗血清（用PBS液稀釋成1∶200）0.2 ml,每組設(shè)3個同水平復(fù)孔。同1.4.2法進(jìn)行醋酸纖維素膜雙向免疫擴(kuò)散,取最大稀釋度抗原仍可見沉淀線作為抗原結(jié)合效價。用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,取本組5只鼠抗血清與五種蒽醌類化合物反應(yīng)的抗原結(jié)合效價對數(shù)值,進(jìn)行秩和檢驗,判定各組抗血清抗體的特異性。

2 結(jié)果

2.1 不同偶聯(lián)法的大黃素-BSA結(jié)合比 大黃素在450 nm處有典型吸收,而 BSA在此處幾乎沒有吸收。紫外掃描發(fā)現(xiàn)兩組大黃素-BSA均在450 nm處有明顯吸收,而經(jīng)反復(fù)換液透析后的最終透析外液在450 nm處吸收峰極低,表明透析袋內(nèi)容物的450 nm吸收,主要來自大黃素-BSA,而不是游離大黃素所致。取450 nm所測各物質(zhì)的A值,經(jīng)兩次回歸計算,得大黃素-BSA 1和大黃素-BSA2的結(jié)合比分別為12和13,二者結(jié)合比相近。

2.2 兩種偶聯(lián)法制備大黃素-BSA的免疫原性 大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗血清與大黃素反應(yīng)形成的沉淀線見圖1,其抗體效價見圖2,二者有極顯著性差異（P=0.006）。實驗對照組均未見沉淀線形成,大黃素-BSA 1的免疫原性顯著高于大黃素-BSA2。

圖1 兩種偶聯(lián)法大黃素-BSA醋酸纖維素膜雙向免疫擴(kuò)散沉淀線Fig.1 Precipitation of the two Emodin-BSA with doub le immunodiffusion on cellu lose acetatemembrane

圖2 大黃素-BSA1和大黃素-BSA2的大黃素免疫原性Fig.2 Immunogenicity of Emodin of Emodin-BSA1 and E-modin-BSA2

圖3 五種蒽醌類化合物結(jié)構(gòu)圖[1]Fig.3 Five anthraquinone compounds structures

2.3 不同偶聯(lián)法制備大黃素-BSA的特異性 結(jié)果見表1。重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法制備大黃素-BSA1的抗血清,與大黃素結(jié)合效價較高,與大黃素甲醚和大黃酚呈低度結(jié)合,統(tǒng)計學(xué)有極顯著性差異（P=0.007）。琥珀酸酐偶聯(lián)法制備大黃素-BSA2的抗血清,與大黃素甲醚結(jié)合效價較高,而與大黃素和大黃酚的結(jié)合效價較低,統(tǒng)計學(xué)有極顯著性差異（P=0.009）。兩種抗血清均不與大黃酸、蘆薈大黃素結(jié)合,實驗對照組均未見沉淀線形成。

大黃素-BSA1抗血清中以抗大黃素抗體為主,并對大黃素有較強(qiáng)的特異性;大黃素-BSA2抗血清則以抗大黃素甲醚抗體為主,對大黃素的特異性較差,二者有極顯著性差異（P=0.006）。

表1 大黃素-BSA1和大黃素-BSA2抗血清與蒽醌類化合物反應(yīng)的抗原結(jié)合效價Tab.1 Fiveanthraquinone compoundsantigens titer in anti-E-modin-BSA1 serum and anti-Emodin-BSA2 serum

圖4 重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法連接大黃素-BSA1的結(jié)構(gòu)圖Fig.4 The Emodin-BSA1 structures from p-am inobenzoic acid diazotizition coupling reaction

3 討論

影響半抗原免疫原性的因素,除了結(jié)合比外,還與偶聯(lián)方法密切相關(guān)。重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法大黃素-BSA1與琥珀酸酐偶聯(lián)法大黃素-BSA2的結(jié)合比分別為12和13。因為半抗原與BSA連接的結(jié)合比在5～20較為適宜,故二者無明顯差異[6]。但實驗結(jié)果顯示這兩種抗原對小鼠的免疫原性具有顯著性差異,這可能與不同偶聯(lián)法連接大黃素-BSA所形成的半抗原表位構(gòu)型有關(guān)。

重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法,是先將大黃素與重氮化對氨基苯甲酸反應(yīng),在大黃素酚羥基的鄰位或?qū)ξ灰媵然?再用碳二亞胺法與BSA偶聯(lián)[3]。根據(jù)大黃素結(jié)構(gòu)（見圖3）及其與重氮鹽偶合反應(yīng)原理推測:在大黃素2、4、5、7號位均可發(fā)生反應(yīng),分別生成大黃素-BSA1-1、大黃素-BSA1-2、大黃素-BSA1-3、大黃素-BSA1-4（見圖4）及其兩個或兩個以上部位同時發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物。這些產(chǎn)物均保留了大黃素6號位酚羥基的特征性結(jié)構(gòu)。因此,用該法制備大黃素-BSA1的大黃素免疫原性較強(qiáng),主要誘導(dǎo)產(chǎn)生抗大黃素特異性抗體。

圖5 琥珀酸酐偶聯(lián)法連接大黃素-BSA2的結(jié)構(gòu)圖Fig.5 The Emodin-BSA2 structures from succinic anhyd ride coup ling reaction

大黃素-BSA1的抗血清中,尚存在少量能與大黃素、大黃素甲醚、大黃酚共同結(jié)合的抗體?？赡苁且虼簏S素-BSA1-1和大黃素-BSA1-3產(chǎn)物與BSA連接的部位距6號位酚羥基較近,掩蓋了大黃素特征性結(jié)構(gòu),而表達(dá)了大黃素、大黃素甲醚、大黃酚的共同表位構(gòu)型（見圖3）所致。

琥珀酸酐偶聯(lián)法,是先將大黃素的酚羥基與琥珀酸酐反應(yīng),生成帶有羧基的大黃素琥珀酸單酯,再用碳二亞胺法與BSA偶聯(lián)[2]。大黃素的1、6、8號位酚羥基均可與琥珀酸酐發(fā)生反應(yīng),分別生成大黃素-BSA2-1、大黃素-BSA2-2、大黃素-BSA2-3（見圖5）及其兩個或三個酚羥基共同發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物。因1號位和8號位的酚羥基可與羰基形成分子內(nèi)氫鍵,加上空間位阻效應(yīng),使反應(yīng)活性降低,所以6號位酚羥基最為活潑[1],故推測大黃素-BSA2-1的產(chǎn)量最大。而大黃素-BSA2-1正是利用大黃素6號位酚羥基與BSA連接,即破壞了大黃素6號位酚羥基的特征結(jié)構(gòu)。其表位構(gòu)型是大黃素、大黃素甲醚、大黃酚的共同結(jié)構(gòu)（見圖3）。因此,用大黃素-BSA2免疫小鼠產(chǎn)生的抗體,主要是能與大黃素、大黃素甲醚、大黃酚共同結(jié)合的抗體,對大黃素的特異性不強(qiáng)。

本實驗提示:選擇合適的偶聯(lián)方法制備半抗原-載體復(fù)合物,是制備抗半抗原特異性抗體的關(guān)鍵所在。不同偶聯(lián)方法因選擇半抗原的連接基團(tuán)或部位不同,決定了半抗原表位構(gòu)型的表達(dá),不僅影響半抗原的免疫原性,更決定其免疫抗體的特異性。在選擇半抗原-載體偶聯(lián)法時,首先應(yīng)保留半抗原的特征性結(jié)構(gòu),其次還應(yīng)注意選擇在遠(yuǎn)離半抗原特征性結(jié)構(gòu)的部位進(jìn)行連接,防止半抗原的特征性結(jié)構(gòu)被破壞或被屏蔽而失去特異性。

制備抗大黃素抗體,宜選用重氮化對氨基苯甲酸偶聯(lián)法制備大黃素-BSA作免疫原,這樣不僅能提高大黃素的免疫原性,而且還可制備出較高特異性的抗大黃素抗體。

1 匡海學(xué).中藥化學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:74-78.

2 劉文泰.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2009:219-226.

3 方 渡.有機(jī)化學(xué)[M].北京:學(xué)苑出版社,2002:384-385.

4 徐修遠(yuǎn),滑 靜,胡建民.氯霉素人工抗原的合成及其結(jié)合比的測定[J].中國畜牧獸醫(yī),2005;32（2）:24-25.

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[收稿2010-11-24 修回2011-01-26]

（編輯 張曉舟）

Study on the immunogenicity and specificity of different epitope configuration Emodin-BSA

LILi-Hua,LIUWen-Tai,DAIJun,DOUYu-Hong,WANGRu,LIUYan-Chen,PENGYang.HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050091,China

Objective:To study the immunogenicity and specificity of differentepitope configuration Emodin-BSA preparedwith different coupledmethods.Methods:Emodin-BSA1 was synthesizedwith p-aminobenzoic acid diazotizition coupling reaction and Emodin-BSA2 was synthesized with succinic anhydride coupling reaction.Anti-Emodin-BSA sera wereobtained from immunizedm iceusing Emodin-BSA1 and E-modin-BSA2,respectively.The immunogenicity and antibody specificity of anti-Emodin were tested by doub le immunodiffusion on cellulose acetatemembrane.Results:The anti-Emodin antibody titers in anti-Emodin-BSA1 and anti-Emodin-BSA2 serum were 1∶144 0±357.771 and 1∶440±219.089 respectively（P=0.006）.The former combinative titer with Emodin were 1∶184 3.2±457.947,the latter were 1∶8.8±4.382.Conclusion:The epitope configurations of two Emodin-BSA were strikingly different,immunogenicity and specificity existed significant difference.Emodin-BSA1 was ont on ly high immunogenicity but specificity for Emodin aswell.

Antigen-antibody reaction;Double immunodiffusion;Emodin;Hapten-carrier coupling;Epitope

R392.33

A

1000-484X（2011）05-0419-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.008

李麗華（1960年-）,女,學(xué)士,教授,主要從事中藥成分分析研究;

及指導(dǎo)教師:劉文泰（1958年-）,男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事免疫學(xué)與中醫(yī)藥研究。