張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳制品加工研究室,呼和浩特 010018）

益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang從基礎研究到產(chǎn)業(yè)化開發(fā)

張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳制品加工研究室,呼和浩特 010018）

2001年-2009年，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學“乳品生物技術與工程”教育部重點實驗室從采集自中國西部7個省市及蒙古國14個省市不同少數(shù)民族地區(qū)951份自然發(fā)酵乳制品等樣品中分離鑒定出3 388株乳酸菌，建立了中國首個原創(chuàng)性乳酸菌菌種資源庫；從菌種庫中分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶（koumiss）的243株乳桿菌中篩選獲得1株性能優(yōu)良的乳酸菌—Lactobacillus casei Zhang（L.casei Zhang）。采用5種動物模型和人體試驗進行了功能評價，并利用基因組學和蛋白質(zhì)組學研究技術對L.casei Zhang益生分子機制進行了深入剖析。經(jīng)過多年系統(tǒng)的基礎研究，自主解決了其產(chǎn)業(yè)化的關鍵技術問題，包括其直投式發(fā)酵劑、發(fā)酵乳制品和發(fā)酵豆乳益生菌飲料的研發(fā)并實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。

益生菌Lactobacillus casei Zhang；基礎研究；產(chǎn)業(yè)化

0 引 言

近10年來，我國乳品工業(yè)進入了高速發(fā)展階段，特別是益生菌發(fā)酵乳制品的產(chǎn)銷售量逐年增加，年平均增長率達到20%以上。遺憾的是，目前乳品企業(yè)幾乎全部采用進口益生乳酸菌菌種和發(fā)酵劑，不僅生產(chǎn)成本高，更重要的是長此以往必將制約乳酸菌和發(fā)酵乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。解決這一問題的根本在于研究和開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的益生乳酸菌菌種和發(fā)酵劑的相關技術和產(chǎn)品。

在益生菌研究領域，日本及歐美發(fā)達國家通過廣泛深入地研究和多年的積累，都已開發(fā)出國際知名菌株及其產(chǎn)品，并進行了相應的專利保護。隨著“人類基因組計劃”的順利完成，該研究領域也逐漸深入到“組學”水平。我國在益生菌研究方面起步相對較晚，基礎研究不系統(tǒng)、不深入、無連續(xù)性、研究分散、也不集中。高校及其它研究機構都還沒有建立真正意義上的乳酸菌菌種資源庫，同時對益生菌的基礎研究也不系統(tǒng)，在基因組學和蛋白組學研究領域更是滯后于國際?；A研究的不足使得產(chǎn)業(yè)化嚴重滯后。

益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang是我國自主研發(fā)的、具有自主知識產(chǎn)權益生乳酸菌，經(jīng)過10多年的基礎研究積累,成功的進入了工業(yè)化生產(chǎn)。本文就益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang從基礎研究到產(chǎn)業(yè)化開發(fā)加以介紹。

1 乳酸菌資源的收集和菌種資源庫的建立［1-26］

2001年-2009年，分別從中國內(nèi)蒙古、新疆、西藏、青海、云南、四川、甘肅等少數(shù)民族居住地區(qū)以及蒙古國14個省市采集自然發(fā)酵酸馬奶、酸駝奶、酸牦牛奶、酸牛奶、酸山羊奶、乳扇、乳餅、酸乳清、鮮牛奶、曲拉、發(fā)酵奶油等傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品等計951份。依據(jù)乳酸菌鑒定技術規(guī)程，采用生理生化并結(jié)合分子生物學手段，從上述采集的樣品中分離、鑒定、保藏了7個屬，58個種和亞種的共3,388株乳酸菌，建成了中國最大的具有自主知識產(chǎn)權的乳酸菌菌種資源庫。同時完成了3,388株乳酸菌16S rRNA基因序列的測定和分析工作，數(shù)據(jù)已上傳到NCBI上（http：//www.nibi.nlm.nih.gov/，菌株編號：IMAU10001-IMAU80872）。

2 益生菌L.casei Zhang的篩選及功能評價［27-43,70-71］

2.1 益生菌L.casei Zhang的篩選

綜合耐酸性、耐膽鹽性能、牛磺膽酸鈉水解能力、模擬胃腸消化體系的轉(zhuǎn)運等指標，從菌種資源庫分離自傳統(tǒng)酸馬奶的243株乳桿菌中篩選獲得1株優(yōu)良潛質(zhì)的益生菌L.casei Zhang。L.casei Zhang在pH為3.0和2.5的人工胃液中消化3 h及在pH 8.0的人工模擬腸液中消化8 h后的存活率分別為為98.4%，69.4%，97.6%和95.37%，可耐受膽鹽的最大濃度為1.6 g/100 mL；其對Caco-2細胞的黏附率為4.31%；對?；悄懰徕c解共軛所產(chǎn)生的游離膽酸量2.28 mmol/L。

2.2 益生菌L.casei Zhang對高脂血癥模型大鼠脂質(zhì)代謝的影響

將L.casei Zhang菌體灌胃高脂血癥模型大鼠（2×108cfu/d），30 d后大鼠血液中的甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的含量分別下降了31.3%和30.8%；肝臟組織中的總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量下降了20.4%和17.5%。說明L.casei Zhang具有降血脂作用。

為了深入研究L.casei Zhang降血脂作用的分子機制，利用DNA芯片技術對大鼠肝臟組織的基因表達進行了檢測。研究表明：灌服L.casei Zhang大鼠肝臟組織中與脂肪酸-氧化相關的5個基因（包括長鏈脂肪酸連接酶、羥酰輔酶A脫氫酶、乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶、酰基輔酶A脫氫酶和戊二酰-輔酶A脫氫酶）的表達量顯著升高（P＜0.05），這表明L.casei Zhang可以加速脂肪酸的氧化進而促進TG的分解代謝從而達到降血脂的作用。

2.3 益生菌L.casei Zhang的免疫調(diào)節(jié)作用

用L.casei Zhang菌體灌胃小鼠 （2.5×108cfu/d和1×109cfu/d）， 結(jié)果表明：L.casei Zhang可明顯上調(diào)血液中IFN-γ和IL-12（P＜0.05），下調(diào)IL-1α和TNF-α水平 （P＜0.01），同時可顯著提高小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+的比例（P＜0.01），并可顯著增加小鼠血清IgG的含量和小鼠腸黏膜SIgA的含量（P＜0.01）；小鼠腸道粘膜相關淋巴組織中Peyer’s結(jié)計數(shù)、計分值顯著提高（P＜0.01）， 并可顯著提高腸黏膜內(nèi)CD3+、IgA+細胞數(shù)量及表達強度（P＜0.01）。這說明該菌株對小鼠的細胞免疫、體液免疫及腸黏膜局部免疫具有調(diào)節(jié)功能。

2.4 益生菌L.casei Zhang對病原性大腸桿菌的拮抗作用

用L.casei Zhang菌體飼喂小鼠（4×107cfu/d），然后分別用E.coli O157和K88進行攻毒,攻毒4 d后取對照組和實驗組未死亡小鼠的腸內(nèi)容物，用選擇性培養(yǎng)基分離純化大腸桿菌和乳酸菌，并進行基因組ERIC-PCR擴增分析。研究表明，灌服L.casei Zhang可以使攻毒后小鼠的死亡率由66.67%降低至5.56%，在停止飼喂L.casei Zhang的第4 d從小鼠腸道內(nèi)仍然能分離到L.casei Zhang，但未分離到E.coli O157和K88，同時飼喂L.casei Zhang可使小鼠腸道中大腸桿菌總數(shù)明顯低于對照組 （P＜0.01）,這一研究結(jié)果表明L.casei Zhang可以在小鼠腸道內(nèi)定殖并能起到拮抗病原菌的作用。

2.5 益生菌L.casei Zhang對大鼠抗氧化能力的影響

用L.casei Zhang菌體灌服大鼠28 d（4.0×109cfu/d），與對照組相比,L.casei Zhang可使大鼠肝臟組織勻漿中的過氧化物酶 （SOD）和谷胱苷肽過氧化物酶（GSH-Px）活力極顯著提高（P＜0.01），大鼠肝臟組織中的氧化產(chǎn)物-丙二醛（MDA）濃度極顯著降低（P＜0.01）。說明L.casei Zhang可提高大鼠體內(nèi)抗氧化作用。

2.6 益生菌L.casei Zhang對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用

以H22荷肝癌瘤小鼠為模型，用L.casei Zhang灌服小鼠12 d（5×108cfu/d和1×109cfu/d）。結(jié)果顯示：L.casei Zhang實驗組的巨噬細胞吞噬百分率、吞噬指數(shù)、小鼠血清中TNF-β含量與對照組比較均有顯著提高（P＜0.01，P＜0.05）；L.casei Zhang菌體對H22移植性腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，抑瘤率分別達到40.22%（P＜0.01）和41.90%（P＜0.01）；實驗組H22腫瘤細胞Bcl-2蛋白表達明顯降低，而Bax蛋白表達增強，與荷瘤對照組相比有顯著性差異（P＜0.01）。L.casei Zhang其抗腫瘤機制可能是通過增強荷瘤小鼠免疫功能及同時促進腫瘤細胞Bax蛋白表達，抑制Bcl-2表達，誘導腫瘤細胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

2.7 益生菌L.casei Zhang在人體腸道中的存活及對腸道菌群的影響

應用熒光定量PCR（RT-PCR）技術定量研究不同時期24個志愿者糞便中L.casei Zhang的數(shù)量,結(jié)果顯示：服用L.casei Zhang 28 d時，L.casei Zhang在志愿者糞便中平均為108.55 cfu/g。停止口服L.casei Zhang 14 d時為105.52 cfu/g,這說明L.casei Zhang不僅可以在人腸道中存活,而且可以在人腸道中定植并繁殖；應用種屬特異性引物對服用L.casei Zhang的志愿者腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群進行定量分析，結(jié)果表明口服該菌株可以有效增加腸道中雙歧桿菌（P＜0.01）和奇異菌群數(shù)量（P＜0.0001），梭菌屬的數(shù)量顯著減少（P＜0.0001），而擬桿菌數(shù)量變化并不顯著;焦磷酸測序（79%reads長度為270 bp；平均每個樣品測序20149條）結(jié)果表明L.casei Zhang對受試者腸道微生物豐度產(chǎn)生了顯著的影響，其中服用L.casei Zhang后宿主腸道中擬桿菌門數(shù)量顯著上升（P＜0.01），而酸桿菌門、綠彎菌門、脫鐵桿菌門、梭桿菌門、變形菌門等數(shù)量顯著下降（P＜0.01），放線菌門呈先上升后下降的趨勢。

3 益生菌L.casei Zhang基因組學和蛋白質(zhì)組學［44-53,72，73］

3.1 益生菌L.casei Zhang基因組學研究

采用全基因組鳥槍法測定益生菌L.casei Zhang全基因組序列并進行了功能基因組學分析。結(jié)果表明：該菌株的基因組由1條染色體（GenBank登錄號：NC_014334）和1個質(zhì)粒plca36（GenBank登錄號：NC_011352）組成。L.casei Zhang基因組富含雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、糖代謝相關基因，包括大量的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和一個在乳酸菌中獨有的肌醇代謝基因簇，且編碼一個典型relBE毒素-抗素系毒統(tǒng)，可能對該菌株適應復雜生存環(huán)境有重要作用。此外，L.casei Zhang還編碼2個特有胞外多糖合成基因簇和6個粘液結(jié)合相關蛋白，具備合成胞外多糖和黏附定植的遺傳學特點。

3.2 益生菌L.casei Zhang蛋白質(zhì)組學研究

利用蛋白質(zhì)組研究技術在國際上首次建立了干酪乳桿菌不同生長時期蛋白質(zhì)表達圖譜，獲得酸和膽鹽脅迫下差異表達蛋白質(zhì)圖譜。結(jié)果顯示：48種蛋白質(zhì)在L.casei Zhang不同生長階段的表達變化明顯，主要包括代謝及應激相關蛋白，可能有助于L.casei Zhang在穩(wěn)定期適應環(huán)境變化，增強其抗逆能力；在膽鹽脅迫下有26種蛋白表達發(fā)生顯著變化，主要包括分子伴侶、糖代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氨基酸代謝和氨基糖代謝相關蛋白；在酸脅迫下有15種蛋白表達發(fā)生顯著變化，主要包括分子伴侶、脂類代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關蛋白。兩種不同脅迫環(huán)境誘導部分類同蛋白表達發(fā)生變化，說明該菌株應對膽鹽和酸脅迫環(huán)境可能有共同的調(diào)控機制。

4 益生菌L.casei Zhang直投式發(fā)酵劑的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化［54-59］

采用RT-PCR技術系統(tǒng)的研究了L.casei Zhang在不同發(fā)酵條件和發(fā)酵不同階段16個關鍵酶基因表達模式的變化，包括葡萄糖激酶、β-葡萄糖苷PTS E II、磷酸-絲氨酸結(jié)合蛋白磷酸化酶等，建立了L.casei Zhang在高密度發(fā)酵過程中的代謝分子機制。根據(jù)L.casei Zhang的代謝分子機制和營養(yǎng)需求，對其增菌培養(yǎng)基成分和含量進行篩選和優(yōu)化，確定了L.casei Zhang的高密度發(fā)酵工藝，可獲得活菌數(shù)為4×1010cfu/mL以上的發(fā)酵液，經(jīng)冷凍干燥可得到2×1011cfu/g以上活菌數(shù)的高活力的發(fā)酵劑，可以滿足于益生菌制劑或益生菌發(fā)酵乳制品等生產(chǎn)。

在抗冷凍方面的研究中，研究發(fā)現(xiàn)冷凍干燥過程中糖類的添加對L.casei Zhang細胞膜的zeta電位、疏水性、流動性和完整性均有不同程度的影響，在此基礎上開發(fā)出了適合L.casei Zhang冷凍干燥過程中有效的抗凍保護劑。

2010年6月,合作企業(yè)—內(nèi)蒙古普澤生物制品有限責任公司投資6,000萬人民幣，成功的將L.casei Zhang發(fā)酵劑進行了工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品中活菌數(shù)達到2×1011cfu/g以上，達到國際同類產(chǎn)品的水平。

直投式發(fā)酵劑的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化過程中主要關鍵技術是創(chuàng)造性地將分子生物學技術和理論用于建立益生菌高密度培養(yǎng)的方法和理論開發(fā)出了適合用于L.casei Zhang的高密度發(fā)酵和抗冷凍干燥技術和工藝。

5 益生菌L.casei Zhang發(fā)酵乳制品和發(fā)酵豆乳制品的研究開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化［60-69,74，75］

5.1 益生菌L.casei Zhang在牛乳和豆乳中的發(fā)酵及貯藏特性的研究

研究結(jié)果顯示，接種量相同時，L.casei Zhang在豆乳中的生長速度快于牛乳；發(fā)酵結(jié)束后，豆乳中活菌數(shù)可達109cfu/mL，遠高于牛乳中的活菌數(shù)（108cfu/mL）；4℃貯藏28 d期間，L.casei Zhang在豆乳和牛乳中均可維持較高的活菌數(shù)（＞108cfu/mL）。說明L.casei Zhang適合用于發(fā)酵牛乳和豆乳制品的生產(chǎn)。

為了探明L.casei Zhang生長的分子機理，利用L.casei Zhang全基因組基因芯片對其在牛乳和豆乳發(fā)酵過程中的表達譜進行了比較分析。結(jié)果顯示：在牛乳中，差顯基因大都參于碳水化合物代謝、能量代謝、無機離子代謝；在豆乳中，除碳水化合物代謝、脂類代謝和無機離子代謝相關基因外，48.6%的上調(diào)控基因（＞3倍）與氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝關聯(lián)。這說明L.casei Zhang在牛乳、豆乳中有著類似的生長分子機制，但因為不同發(fā)酵乳體系在蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)組成方面不同而使其生長速率有所差異。

5.2 益生菌L.casei Zhang發(fā)酵乳和發(fā)酵豆乳益生菌飲料的產(chǎn)業(yè)化

根據(jù)上述分子機理，建立并優(yōu)化了L.casei Zhang發(fā)酵乳和發(fā)酵豆乳益生菌飲料的生產(chǎn)工藝。2010年，采用獨特的2段發(fā)酵工藝，L.casei Zhang益生菌發(fā)酵豆乳飲料—百益多（與我們實驗室開發(fā)的另一益生菌Bifidobacterium lactis V9共同發(fā)酵）在青島君益食品公司投產(chǎn)，產(chǎn)品中L.casei Zhang活菌達到5×1011cfu/mL以上，是目前我國市場上益生菌飲料中最高活菌數(shù)的5倍，且在貨架期內(nèi)活菌數(shù)一直保持不變。

2011年2月，L.casei Zhang成功地應用于內(nèi)蒙古伊利集團QQ星兒童益生菌乳飲料的生產(chǎn)，一舉打破了多年國外益生菌在我國乳品企業(yè)的壟斷局面。

6 結(jié)束語

本項目的研究開發(fā)不僅打破了多年國外產(chǎn)品和技術的壟斷，而且大大促進和提高了我國益生乳酸菌及其相關技術和產(chǎn)品的自主科技創(chuàng)新能力。該項目的實施和完成，將有助于我國乳酸菌和發(fā)酵乳制品產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時也可滿足人們?nèi)找嬖鲩L的健康需求。該項目的實施也可為培養(yǎng)我國微生物學、乳品科學、基因組學等領域的高級人才奠定了良好的基礎。

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Probitotic Lactobacillus casei Zhang from basic research to industrialization

ZHANG He-ping
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Education Ministry of China,Dairy Processing Laboratory of National Dairy Industry and Technology System,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China）

During 2001-2009,we have isolated,identified and collected 3,388 strains of lactic acid bacteria from 951 naturally fermented dairy products（including fermented cow milk,mare milk,goat milk,camel milk and yak milk）in Inner Mongolia,Xinjiang,Qinghai,Tibet,Yunnan,Ganshu and Sichuan of China and 17 provinces of Mongolia,and established the first LAB Collection Center（LABCC）with self-owned intellectual property in China.From 243 strains of lactobaclli isolated from naturally fermented mare milk（koumiss）collected in LABCC,a novel probiotic-Lactobacillus casei Zhang was screened out,and conducted extensive researches on it,including acid tolerance and bile resistance to the gastointestinal digestion,adhesion to Coco-2 human epithelial cells line in vitro,immunomodulatory properties,anti-tumor effects for H22 cancer cell line induced liver tumor,hypocholesterolemic effects,antagonistic to pathogenic Escherichia coli in intestine,anti-oxidative effect in vivo using mice or rat as models,and colonization of in human gut and regulation of gut microbiota for 24 volunteers.Using gemomics and proteomics,we elucidated its probiotic mechanism partially.Basic research about probiotic Lactobacillus casei Zhang promoted its application in industry,including industrialization of direct-to-vat starter culture,fermented milk drink and fermented probiotic soymilk drink.

Probiotic Lactobacillus casei Zhang,Basic research,Industrialization

TQ920.1

B

1001-2230（2011）10-0032-05

2011-08-29

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設項目（nycytx-0501）；國家高技術研究發(fā)展計劃（2011AA100901,2011AA100902）；國家杰出青年科學基金（31025019）；973計劃前期研究專項（2010CB134502）；教育部創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT0967）；“十一五”國家科技支撐計劃重點項目（2009BADC1B01）。

張和平（1965-），男，教授，研究方向為乳酸菌與發(fā)酵乳。