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      Lachnum YM 328多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及抗氧化性

      2011-03-15 14:30:38陳吳西蔡敬民張利兵
      關(guān)鍵詞:盤菌胞外氮源

      陳吳西, 蔡敬民, 邱 濤, 張利兵, 葉 明

      (1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽合肥 230009;2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系,安徽合肥 230022)

      0 引 言

      真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的,能夠控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長衰老的一類活性多糖[1]。大量研究表明,多糖具有免疫增強與調(diào)節(jié)、抗病毒、抗放射、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老以及抗氧化等作用[2-5],是公認(rèn)的安全低毒活性物質(zhì)。

      利用微生物生產(chǎn)多糖可以不受季節(jié)變化的影響,微生物多糖的收集與純化相對其它多糖而言更容易[6],微生物多糖越來越受到人們的關(guān)注。粒毛盤菌屬Lachnum Retz是晶杯菌科(H ya-loscyphaceae)真菌,其分布廣泛,通常腐生在各種植物基質(zhì)上。近十幾年來,我國學(xué)者在粒毛盤菌方面做過不少研究[7-10],人們發(fā)現(xiàn)粒毛盤菌屬中有的種能產(chǎn)生生物活性物質(zhì),說明粒毛盤菌具有重要的應(yīng)用前景[11-13]。本文對一株粒毛盤菌YM 328發(fā)酵條件以及其胞外多糖抗氧化活性進行了研究,以期為盤菌多糖的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 菌株及培養(yǎng)基

      粒毛盤菌(Lachnum)YM 328,合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離保藏菌種。

      發(fā)酵培養(yǎng)基:液體PDA培養(yǎng)基。

      1.2 YM 328胞外多糖的發(fā)酵、提取和測定

      搖瓶培養(yǎng)條件為溫度25℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,裝液量50 m L(容積為150 m L的三角瓶),在此條件下培養(yǎng)10 d。

      提取方法:將50m L發(fā)酵液過濾,濾液濃縮,加3倍體積的無水乙醇,4℃下醇沉。離心除去上清液,沉淀用蒸餾水溶解并定容至50 m L,加1m L 30%的H 2O2,50℃保溫脫色,Sevage法脫蛋白[14],得到胞外多糖溶液。

      采用苯酚-硫酸法測定多糖質(zhì)量濃度[15],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物,用721E型可見光光度計作比色分析。

      1.3 YM 328胞外多糖發(fā)酵條件

      1.3.1 碳、氮源對菌株YM 328多糖發(fā)酵的影響

      分別用20 g/LCMC-Na、蔗糖、淀粉、麥芽糖代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖配制不同碳源培養(yǎng)基各50 m L,裝入150 m L的錐形瓶中,用打孔器接入直徑為3mm的菌塊,25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)10 d,測定多糖質(zhì)量濃度。分別以5 g/L蛋白胨、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素、酵母膏為氮源[16],并選擇最適碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基,方法同上。

      1.3.2 金屬離子對YM 328多糖發(fā)酵的影響

      選擇最適碳氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基,分別添加0.01 g/L硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸鎂,以不加金屬離子的發(fā)酵液為對照。調(diào)節(jié)pH值為最適,接種菌齡相同菌塊裝于50m L不同生長因子發(fā)酵培養(yǎng)基的 150 m L錐形瓶中,25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng) 10 d,測定多糖質(zhì)量濃度。

      1.3.3 時間對YM 328多糖發(fā)酵的影響

      選擇最適碳氮源和最佳生長因子配制發(fā)酵培養(yǎng)基,并調(diào)節(jié)最適pH值,接入直徑3 mm的菌塊,25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)6、8、10、12、14 d,測定多糖質(zhì)量濃度。

      1.3.4 正交試驗

      在單因素試驗基礎(chǔ)上,以碳源、氮源、金屬離子為3因素,各取4個水平,選擇L16(45)正交表進行試驗。

      1.4 YM 328胞外多糖抗氧化活性測定

      1.4.1 胞外多糖對?OH的清除作用

      按照Sm irnoff的方法(有改動),利用H2 O2與Fe2+混合產(chǎn)生?OH,在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉?OH并產(chǎn)生有色物質(zhì),該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。反應(yīng)體系中含 8.8 mmo l/L H2O2、9mmol/L FeSO4、9mmol/L水楊酸/乙醇、不同質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50、60 mg/L)的多糖溶液各1 m L,最后加H2O2啟動反應(yīng),37℃反應(yīng)0.5 h,以蒸餾水為參比,在510 nm下測量不同質(zhì)量濃度下的吸光度。考慮到多糖本身的吸光值、以9 mm ol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸/乙醇、不同質(zhì)量濃度的多糖溶液和蒸餾水各1m L做為多糖的本底吸收值[17]。

      清除率計算公式為:

      其中,A0為空白對照液的吸光度;A x為加入多糖溶液后的吸光度;A x0為不加顯色劑H2 O2多糖溶液本底的吸光度。

      [18]的方法進行。取3m L不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)多糖溶液,2m L PBS溶液(pH值為 6.0)和 0.1 m L 200μg/m L NaNO2溶液于試管中,用水添加至10 m L后,將混合液置于37℃恒溫1 h。然后與等容積的G riess試劑(1%對氨基苯磺酸、0.1% N-1-萘基乙二胺、2.5%H3PO4)混合,靜置10 m in后,蒸餾水做參比,于538 nm處測其吸光度,同時測定對照樣(不含亞硝酸鈉,含有多糖)和空白樣(不含多糖,蒸餾水代替多糖)吸光度。VC作為樣品對照。亞硝酸鈉的清除活性公式為:

      其中,S a為亞硝酸鈉的清除率;ODs為空白樣品的OD值;ODp為試驗的OD值;ODc為對照的OD值。

      2 結(jié)果和分析

      2.1 碳、氮源對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

      當(dāng)以5 g/L蛋白胨為氮源,20 g/L麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖和CMC-Na為碳源時,YM 328胞外多糖產(chǎn)量如圖1a所示。從圖1a可看出,以葡萄糖為碳源時,YM 328胞外多糖產(chǎn)量最高,說明以葡萄糖為碳源便于菌株YM 328的利用和多糖的積累。氮源對菌株YM 328胞外多糖產(chǎn)量的影響較大。當(dāng)以葡萄糖為碳源,酵母膏為氮源時,YM 328胞外多糖的產(chǎn)量最高,達到1.841mg/m L,如圖1b所示。

      圖1 碳氮源對YM 328胞外多糖產(chǎn)量的影響

      2.2 金屬離子對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

      金屬離子對菌株YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響如圖2所示。由圖2可知,除Cu2+外,添加Mg2+、Fe2+、Zn2+、M n2+對YM 328胞外多糖的產(chǎn)量都有很大的影響,由此可以推測金屬離子對于多糖的合成起重要作用,具體機理尚待研究。

      圖2 金屬離子對胞外多糖產(chǎn)量的影響

      2.3 培養(yǎng)時間對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

      培養(yǎng)時間對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響如圖3所示。由圖3可知,YM 328胞外多糖發(fā)酵到10 d時,其產(chǎn)量達到1.548 mg/m L,隨著發(fā)酵時間的延長,多糖產(chǎn)量較穩(wěn)定,直到14 d后多糖產(chǎn)量有所下降。

      圖3 培養(yǎng)時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響

      2.4 正交試驗

      YM 328胞外多糖發(fā)酵的正交試驗極差分析結(jié)果見表1所列。

      表1 YM 328胞外多糖發(fā)酵正交試驗結(jié)果

      由表1可知,影響YM 328胞外多糖產(chǎn)量的因素依次是C(金屬離子)>B(氮源)>A(碳源)。由試驗結(jié)果可直接得其最佳組合為A3B3C2,最佳發(fā)酵條件為:ρ(葡萄糖)=20 g/L,ρ(酵母膏)= 5 g/L,ρ(硫酸錳)=0.075 g/L。這與直觀分析所得試驗多糖產(chǎn)量最大有差異,故進行驗證試驗。在此條件下進行驗證試驗得出胞外多糖最大產(chǎn)量為1.895m g/m L。

      2.3.1.2 術(shù)后6周后Harris髖關(guān)節(jié)功能評分 納入了4個研究,共179例(SuperPATH組89例,傳統(tǒng)入路組90例),經(jīng)χ2檢驗,研究間有異質(zhì)性 ( I2>50%),采用隨機效應(yīng)模型進行統(tǒng)一Meta 分析。結(jié)果顯示:SuperPATH組術(shù)后6周后Harris髖關(guān)節(jié)功能評分優(yōu)于傳統(tǒng)入路組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(WMD=7.62,95%CI=2.09~13.16,P=0.007)。見圖2。

      方差分析見表2所列。由表2可以看出,A因素對該多糖的產(chǎn)率沒有顯著影響,B因素對該多糖的產(chǎn)率具有顯著影響,C因素對其產(chǎn)量具有高度顯著影響。

      表2 方差分析

      2.5 YM 328胞外多糖對?OH的清除作用

      YM 328胞外多糖對?OH的清除如圖4所示,由圖4可知,YM 328多糖對?OH有清除作用,而且隨著質(zhì)量濃度的增加,對?OH的清除作用增強,且清除能力均高于等質(zhì)量濃度的VC。

      圖4 YM 328胞外多糖對?OH的清除作用

      2.6 YM 328胞外多糖對亞硝基的清除作用

      YM 328胞外多糖對亞硝基的清除如圖5所示,由圖 5可知,隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,YM 328胞外多糖對亞硝基的清除作用逐漸增強,但清除能力均弱于等質(zhì)量濃度的VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時,兩者對亞硝基的清除能力差異較大,分別為51.07%和65.32%。

      圖5 YM 328胞外多糖對亞硝基的清除作用

      3 結(jié)束語

      本研究表明,碳源、氮源、金屬離子及培養(yǎng)時間對 YM 328胞外多糖產(chǎn)量都有不同程度的影響。在最佳發(fā)酵條件下,多糖產(chǎn)量比在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 d的產(chǎn)量提高了36.27%,說明發(fā)酵條件對YM 328多糖代謝具有重要的調(diào)控作用。

      YM 328胞外多糖對?OH和亞硝基離子的清除作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,呈增強的趨勢。?OH是生物體內(nèi)主要的活性自由基,由它引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過氧化是機體衰老、心血管病及腫瘤發(fā)生的重要原因[19]。文獻[20]報道大球蓋菇多糖(質(zhì)量濃度為583.1 mg/L)對?OH的清除率為50%,而在本研究中40 mg/L的YM 328胞外多糖對?OH的清除率就已達到50.98%,這說明粒毛盤菌胞外多糖對?OH的清除作用較強,是一種很有開發(fā)潛力的抗氧化、防衰老的活性物質(zhì)。

      [參 考 文 獻]

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