丁鳳菲,王偉

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院,武漢430030;2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢430030

腦卒中是世界上僅次于心臟病與癌癥的第三大殺手,其中缺血性腦卒中(ischemic stroke)占80%[1]。腦卒中的危險(xiǎn)因素多種多樣,非獲得性危險(xiǎn)因素有年齡、種族、性別等,獲得性危險(xiǎn)因素有高血壓、吸煙、房顫、肥胖等[2],但這些因素并不足以完全解釋腦卒中的易感性。

在動(dòng)物模型與臨床研究中,研究人員都發(fā)現(xiàn)了腦卒中的基因易感性。一項(xiàng)對(duì)家系、同胞之間的缺血性腦卒中的研究發(fā)現(xiàn),小部分腦卒中是單基因?qū)е录膊3]。但研究者更傾向于認(rèn)為腦卒中是一種多基因、多因子疾病[4]。為尋找與定位腦卒中易感基因,研究者們首先假設(shè)一個(gè)或多個(gè)基因?yàn)橹虏『蜻x基因,再對(duì)其進(jìn)行深入研究,即候選基因(candidate gene)與候選路徑(candidate pathway)研究[5]。隨著基因分型與基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study,GWAS)逐漸被廣泛運(yùn)用,它是經(jīng)典的病例-對(duì)照研究的延伸,通過分析病例組與對(duì)照組之間單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs)的差異,探索腦卒中的基因相關(guān)性[6,7]。若能精準(zhǔn)定位易感基因,將對(duì)預(yù)防和治療疾病有重要意義。但目前的研究仍有一定距離[2]。

1 腦卒中的流行病學(xué)研究

基于雙胞胎、同胞及家族的研究發(fā)現(xiàn),遺傳因素在腦卒中發(fā)生中有著重要作用,但其危險(xiǎn)程度尚不能確定。研究表明,同卵雙生雙胞胎的腦卒中一致發(fā)病率比異卵雙生雙胞胎高65%。有腦卒中家族史的人群中,發(fā)生缺血性腦卒中的危險(xiǎn)度比無家族史的人群高75%?；蛞赘行砸滥挲g和腦卒中類型的不同而有所差異[8]。Jood等[9]的雙胞胎與家系研究表明,70歲之前發(fā)生腦卒中的患者中,基因因素所占比重多于年老發(fā)病者。

2 與腦卒中相關(guān)的單基因遺傳病研究

臨床研究發(fā)現(xiàn),由單基因遺傳疾病引發(fā)的缺血性卒中約占1%。缺血性卒中可作為單基因遺傳病突出的臨床表現(xiàn),也可伴隨有全身系統(tǒng)的癥狀出現(xiàn),大多數(shù)單基因疾病都與特定卒中亞型相關(guān)[10]。累及大動(dòng)脈的常見單基因遺傳病有Moyamoya病,Kamada等[11]的研究認(rèn)為RNF213為第一個(gè)可能的致病基因。累及小血管的單基因遺傳病有伴皮質(zhì)下梗死和腦白質(zhì)病的常染色體顯性遺傳性腦動(dòng)脈病(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL),由 NOTCH3基因突變?cè)斐蒣12]。繼CADASIL后,研究又發(fā)現(xiàn)常染色體隱性遺傳動(dòng)脈病變并皮質(zhì)下梗死與腦白質(zhì)病(cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CARASIL),由 HT RA1 基因突變?cè)斐蒣13]。最新研究發(fā)現(xiàn),編碼膠原纖維IV α 1鏈的COL4A1基因也是致病的單基因突變位點(diǎn)[14]。法布里病(Fabry's disease)是α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-GLA)基因突變的X 染色體連鎖單基因遺傳病,既有大血管病變又有小血管病變[15]。馬凡綜合癥(Marfan's syndrome)由FBN1基因外顯子突變?cè)斐?病變累及心臟與彈性動(dòng)脈,與心源性腦卒中密切相關(guān)[16]。另外,鐮形細(xì)胞(貧血)癥(sickle-cell disease)是導(dǎo)致兒童中風(fēng)最常見的疾病。研究發(fā)現(xiàn)了12個(gè)基因中的31個(gè)SNPs,其中包括炎癥相關(guān)基因 P-selectin以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming grow th factor,TGF)-β途徑的一些基因,與鐮形細(xì)胞(貧血)癥的腦卒中發(fā)生有聯(lián)系[17]。此外,其它單基因遺傳病有高胱氨酸尿癥(homocystinuria),線粒體腦肌病、乳酸酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作綜合征(mitochondria encephalomyopathy lacticacidosis and stroke like episodes,MELAS),Ehlers-Danlos綜合征等[18]。

3 多基因、多因子所致腦卒中的基因研究

3.1 候選路徑和候選基因研究 雖然已發(fā)現(xiàn)許多單基因遺傳病與腦卒中密切相關(guān),但大多數(shù)腦卒中仍然被認(rèn)為是多基因源性的[18]。為尋找與定位腦卒中易感基因,人們首先在涉及炎癥、脂質(zhì)代謝、凝血與止血機(jī)制、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)等路徑中選出可能與缺血性腦卒中發(fā)生相關(guān)的基因,假設(shè)其為致病候選基因,再對(duì)其進(jìn)行深入研究,分析候選基因與腦卒中之間的關(guān)聯(lián)。Meta分析對(duì)相關(guān)性研究進(jìn)行了總結(jié)分析,結(jié)果顯示,與缺血性腦卒中具有顯著相關(guān)性的基因及其變異主要有:Gln506基因(編碼V Leiden因子),C677T基因(編碼MTHFR),G20210A基因(編碼促凝素),ACE基因I/D變異,PAI-1 5G以及糖蛋白IIIa基因 Leu33Pro多態(tài)性,β-Fg基因455A/G、148T/C多態(tài)性,ApoE基因 ε 2/ε 3/ε 4 多態(tài)性等[19,20]。

3.2 同型半胱氨酸代謝途徑 5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase,MT HFR)是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代謝中一種關(guān)鍵酶,其編碼基因C677T的變異,能升高血漿中Hcy濃度,從而提高腦卒中發(fā)生的危險(xiǎn)性,與小血管病變性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)。T T基因型存在于10%的人群中,可使血漿中Hcy升高20%左右。Meta分析顯示,TT基因型發(fā)生缺血性腦卒中的危險(xiǎn)性明顯高于CC基因型[21]。

3.3 RAAS 最早發(fā)現(xiàn)的是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)編碼基因的插入/缺失變異,DD基因型攜帶者的平均ACE活性濃度是II基因型攜帶者的近2倍,具有更高的缺血腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[22]。Rubattu等[23]報(bào)道血管緊張素Ⅱ受體的A1166C基因變異能增加患者的缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),尤其對(duì)于原發(fā)性高血壓病患者。Munshi等[24]的病例對(duì)照研究提示,人類醛固酮合成酶基因(CYP11B2)啟動(dòng)子區(qū)的變異-344C/T(rs179998)與缺血性腦卒中的發(fā)生有密切關(guān)系。針對(duì)中國(guó)漢族人的Meta分析證實(shí)了這一觀

點(diǎn)[25]。

3.4 凝血與止血系統(tǒng) 研究發(fā)現(xiàn),與高凝狀態(tài)相關(guān)的V Leiden因子基因的Arg506Gln變異,凝血素基因的G20210A變異,以及纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI1)基因的啟動(dòng)子4G/5G多態(tài)性能提高缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[26]。另外,Maguire等[27]認(rèn)為血小板糖蛋白1bα(glycoprotein1bα,GP1bα)基因的 Thr/Met變異在顯性遺傳模式中與缺血性腦卒中相關(guān)。組織因子(tissue factor,TF)基因的SNP rs1324214(C/T)及單體型H3與配對(duì)單倍體H3變異被認(rèn)為與意大利和德國(guó)青少年人群缺血性腦卒中的發(fā)生有顯著性關(guān)聯(lián)[28]。

3.5 脂質(zhì)代謝 對(duì)氧磷酶(paraoxonase,PON)1基因編碼位于高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL),PON1基因的rs662((p.Q192R)多態(tài)性被認(rèn)為與缺血性腦卒中的發(fā)生有一定相關(guān)性,且在白種人中關(guān)聯(lián)較為顯著,在東亞人種中關(guān)聯(lián)不顯著[29]。ApoE 基因 ε 2/ε 3/ε 4 多態(tài)性與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)。其中ApoE基因ε 3/3基因型在亞洲人群中最為常見[30],而與中國(guó)北方漢族人缺血性腦卒中發(fā)病顯著相關(guān)的是ApoE基因ε 2/ε 4多態(tài)性[31]。

3.6 磷酸二酯酶 4D(phosphodiesterase 4D,PDE4D)PDE 4D能降解第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP),與血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及炎癥細(xì)胞關(guān)系密切。通過全基因組連鎖分析(genome-wide linkage analysis),PDE 4D的編碼基因定位于5q12(STRK1區(qū))。對(duì)冰島人群研究中,該基因被認(rèn)為與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)。PDE 4D編碼基因的 260個(gè)SNPs被檢測(cè),其中6個(gè)與腦卒中有關(guān)聯(lián)[32]。針對(duì)報(bào)道的SNPs,許多后續(xù)研究在不同人群進(jìn)行驗(yàn)證。Anjana等[33]發(fā)現(xiàn)南印度人群中,SNPs83(rs966221)與大小動(dòng)脈型缺血性腦卒中有顯著關(guān)聯(lián)。Xu等[34]發(fā)現(xiàn)亞洲人群中,SNPs 83 C等位基因與SNPs 83 CC基因型和缺血性腦卒中最有關(guān)聯(lián)。

3.7 ALOX5AP基因與白三烯路徑 ALOX5AP

基因編碼的脂氧化酶活化蛋白(lipoxygenase activating protein,FLAP)是白三烯途徑中的重要物質(zhì)。在冰島人群中,ALOX5AP的一個(gè)單體型(HapA)變異可使腦卒中危險(xiǎn)度增加 1.8倍[35]。ALOX5AP基因的SNP變異SG13S114在伊比利亞人群中,能調(diào)控ALOX5AP的表達(dá)水平,是缺血性腦卒中的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素[36]。

3.8 其它候選路徑和候選基因 除此之外,還有許多關(guān)于其它一些候選基因和路徑與缺血性腦卒中關(guān)系的研究。但大多數(shù)研究無陽(yáng)性結(jié)果,或者不能被后續(xù)的研究所重復(fù)[2]。

4 全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association studies,GWAS)

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家們可更快、更經(jīng)濟(jì)地獲得大樣本、高通量的基因信息。GWAS就是以此為原料,運(yùn)用生物信息學(xué)研究方法,比對(duì)患者與正常對(duì)照者的基因信息,尋找復(fù)雜疾病相關(guān)的易感基因。最常以人類基因組中的SNPs為標(biāo)簽,運(yùn)用基因芯片技術(shù),進(jìn)行大規(guī)模的SNPs分型。與候選基因關(guān)聯(lián)分析策略明顯不同的是,GWAS不需要在研究之前構(gòu)建任何假設(shè),即假設(shè)某些特定的基因或位點(diǎn)與疾病相關(guān)聯(lián)[6]。

現(xiàn)有的關(guān)于缺血性腦卒中的GWAS數(shù)量并不多。Matarin等[7]最先進(jìn)行缺血性腦卒中的GWAS,以249名北美白人缺血性腦卒中患者為對(duì)象,篩選出幾百個(gè)有一定相關(guān)性的SNPs,相關(guān)性顯著的一些SNPs位于候選基因中或與之鄰近。雖然結(jié)果的變異性較大,但這一結(jié)果為后續(xù)的GWAS奠定了基礎(chǔ)。

研究顯示,大多數(shù)篩選出的SNPs與缺血性腦卒中發(fā)生的關(guān)聯(lián)較弱,或者其關(guān)聯(lián)性僅局限于特定人群或腦卒中的特定亞型。Hata等[37]以日本Hisayama地區(qū)的1112名患者為研究對(duì)象,進(jìn)行GWAS發(fā)現(xiàn),PRKCH基因(編碼 PKCη)中的 SNP(1425 G/A)與腔隙性腦梗死顯著性相關(guān)。隨后運(yùn)用2個(gè)獨(dú)立的隊(duì)列研究進(jìn)行了驗(yàn)證。Ikram等[38]的GWAS發(fā)現(xiàn),定位于染色體12p13,鄰近NINJ2基因(編碼膠質(zhì)細(xì)胞粘附分子)與WNK1基因(編碼絲/蘇氨酸激酶)的 2個(gè)SNPs(SNPs rs11833579與rs12425791)在大樣本的黑人人群和荷蘭人群研究中,與腦卒中有顯著性關(guān)聯(lián),并且在荷蘭人群中,與動(dòng)脈血栓性腦卒中亞型關(guān)聯(lián)性更加顯著。然而,SNP rs12425791在瑞典人群中并不與缺血性腦卒中相關(guān)[39]。另一 GWAS發(fā)現(xiàn),4q25上的SNP rs2200733與rs10033464,與缺血性腦卒中有顯著性關(guān)聯(lián),這結(jié)論在2個(gè)歐洲人群中得到驗(yàn)證[40]。另有研究顯示,位于9p21的CDKN2A與CDKN2B兩個(gè)候選基因鄰近區(qū)域的 SNP rs10757274與rs2383206,是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)變異[41]。Anderson等[42]報(bào) 道了 9p21的另 2個(gè) SNPs,rs1537378與rs10757278,與缺血性腦卒中顯著相關(guān),且對(duì)大血管性腦卒中影響更大。Cheong等[43]發(fā)現(xiàn)AdipoQ基因的6個(gè)SNPs與韓國(guó)人群缺血性腦卒中危險(xiǎn)性有關(guān)。Xu等[44]發(fā)現(xiàn)位于1p32上的SNP rs11206510與缺血性腦卒中有顯著性聯(lián)系。Yamada等[45]在日本人群中開展的GWAS發(fā)現(xiàn),CELSR1基因的SNP rs4044210與rs6007897與缺血性腦卒中的發(fā)生相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從而推斷CELSR1是缺血性腦卒中的可疑致病基因。Ding等[46]對(duì)之前Matarin等篩選出的與缺血性腦卒中可能相關(guān)的27個(gè)變異進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果提示SNP rs11052413、rs1048677、ZNF 650 rs10204475在中國(guó)漢族人中與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān),其中關(guān)聯(lián)最顯著的是SNP rs11052413。

目前,GWAS研究已成為復(fù)雜疾病基因研究的熱點(diǎn),但同時(shí)也帶來許多問題。比如,耗資巨大的研究篩選出的變異相關(guān)性不穩(wěn)定,所有報(bào)道的可疑位點(diǎn)都只能解釋疾病的一小部分。同時(shí),如果單個(gè)變異對(duì)缺血性腦卒中發(fā)生的影響力較小,其關(guān)聯(lián)性容易被誤差掩蓋。分析可能的原因是,存在一些目前的GWAS不能識(shí)別稀有變異,存在無法檢測(cè)到的罕見的結(jié)構(gòu)變異或表觀遺傳變異,存在難以檢測(cè)到的基因與基因之間和基因與環(huán)境之間的相互作用[6]。

5 現(xiàn)狀與展望

當(dāng)下,尚無以中國(guó)人群為對(duì)象的缺血性腦卒中的GWAS。目前的研究主要是根據(jù)其它群體的GWAS篩選出的基因多態(tài)性,在中國(guó)人群中驗(yàn)證其疾病相關(guān)性,并有許多研究者用Meta分析進(jìn)行總結(jié)。另外,也有研究著力于驗(yàn)證候選基因和候選路徑與中國(guó)人腦卒中發(fā)生之間的關(guān)系。然而,很少有研究挖掘出新的、有意義的基因變異。

中國(guó)的腦卒中發(fā)病率位于世界榜首,且疾病將帶來沉重的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)負(fù)擔(dān)。腦卒中的基因背景研究能為疾病預(yù)防與治療研究提供突破口,為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。同時(shí),中國(guó)人群基數(shù)大,發(fā)病率高,研究成本相對(duì)低廉等特點(diǎn),都有利于開展大規(guī)模中國(guó)人群基因背景研究。

隨著基因測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,腦卒中的基因背景研究將運(yùn)用全基因組測(cè)序技術(shù)、外顯子測(cè)序技術(shù)、RNA測(cè)序技術(shù)、表觀遺傳學(xué)研究方法,結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件技術(shù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法學(xué),研究復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,具有光明的臨床運(yùn)用前景。

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