張銘杰,何偉,張慶文,李勇,歐志學

(1.廣州中醫(yī)藥大學,廣東廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)一科,廣東廣州 510405)

股骨頭壞死是由于不同病因破壞股骨頭的血液循環(huán),最終導致股骨頭塌陷、髖關(guān)節(jié)功能障礙的一種慢性、致殘性疾病,嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有強大的自我增殖和多向分化潛能,可通過誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及肌細胞等多種細胞譜系。隨著對MScs研究的不斷深入,對非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病理機制有了新的認識,同時為骨壞死的治療提供了嶄新的思路。本文就M SCs的生物學特性及其在骨壞死領(lǐng)域中的研究和應用進展作一概述。

1 骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性與鑒定

M SCs來源于中胚層,具有干細胞的共同特性,能夠自我增殖并具有多向分化潛能[1]。研究顯示在體外培養(yǎng)中M SCs每傳代一次,細胞數(shù)增加約2.2倍,且在體外分裂38次以上仍保持干細胞多向分化潛能。M SCs中約有20%處于靜止期(G0期),即足以維持增殖分化所需的細胞供給,且在經(jīng)體外傳代20～25代后,細胞形態(tài)、生長曲線、免疫表型仍無明顯變化,在多代培養(yǎng)后仍能保持染色體核型和端粒酶活性不變[2]。對細胞周期的研究顯示,只有少數(shù)M SCs正在活躍地復制(約 10%處于 S+G2/M期),而大多數(shù)細胞處于 G0/G1期。細胞周期每個階段的監(jiān)控點和時間跨度均不明確,高比例的 G0/G1期細胞暗示著M SCs具有高度分化潛能[3],在特定的理化條件與細胞因子誘導下,M SCs可以分化為中胚層的成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等,也可跨越胚層的界限,向外胚層的神經(jīng)元樣細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及內(nèi)胚層的肝細胞分化[4,5]。

通過光學顯微鏡觀察,在培養(yǎng)液中 M SCs顯示出類似成纖維細胞外觀,并與成纖維細胞有一定同源性的特征。目前常用干細胞的表面標志來鑒定M SCs,干細胞的表面標志是指覆蓋在細胞表面的受體,它能選擇性地結(jié)合或黏附其他信號分子。通常認為,M SCs體積小,核漿比大,不表達分化相關(guān)的標志如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原、堿性磷酸酶或骨涎蛋白。在細胞貼壁附著后則細胞均一致地表達 SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等多種表面蛋白[6]。其中 CD44是多種配體的受體,在骨髓中對細胞外基質(zhì)構(gòu)建起主要作用,是M SCs的重要標志物[7]。M SCs不表達造血細胞表面標志,如CD14、CD34及CD45,也不表達主要組織相容性復合物分子[8]。隨著人們對 M SCs研究的不斷深入,將會有更多的骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性被逐步揭示。

2 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、純化與成骨誘導

由于骨髓細胞的組成具有不均一性,以及 MSCs在骨髓中含量極少,只占有核細胞的1/106～1/105,因此分離高純度的MSCs比較困難,也成為M SCs應用研究的關(guān)鍵。目前常用分離 M SCs的方法有密度梯度離心法、貼壁篩選法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分離法。貼壁篩選法也稱全骨髓法,它是利用 M SCs貼壁生長的特性,通過反復換液去除懸浮細胞而獲得 MSCs,單純貼壁篩選法獲得的M SCs純度不高,易混有許多骨髓造血細胞,且不易通過換液傳代去除[9]。免疫磁珠法和流式細胞儀分離法雖然可以獲得相對純度較高的M SCs,但是成本昂貴,較難進行大規(guī)模的應用,而且在分離過程中對細胞活性有一定的影響[10]。而密度梯度離心法簡便易行,通常與貼壁篩選法結(jié)合使用,利用 Percol1分離液 (密度在 1.073～ 1.082kg/L)可獲得均一性較高的M SCs[11]。Percoll是包被了聚乙烯吡咯的直徑為15～30mm的膠體二氧化硅顆粒,在液體中顆粒大小不一,在一定離心場中可形成一定密度梯度,不同密度的細胞分布在不同的密度層內(nèi),借此可將 M SCs與其他細胞分開,從而達到分離M SCs的目的。

由于 MSCs具有多方向分化的特點,而骨組織工程學要求其向單一方向分化,所以 M SCs的定向誘導具有重要作用。M SCs為條件成骨細胞,許多學者研究表明,地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C是M SCs向成骨細胞分化和體外成骨的必要條件[12]。地塞米松在成骨分化早期以促進基質(zhì)合成為主,后期以促進鈣化為主[13];維生素 C的作用主要是促進體外培養(yǎng)細胞合成膠原,形成鈣化,同時調(diào)節(jié)堿性磷酸酶活性,而堿性磷酸酶在成骨細胞體外鈣化中起決定性作用。β-甘油磷酸鈉可以提供骨組織在體外培養(yǎng)體系中發(fā)生沉淀所需的磷離子,從而加速結(jié)節(jié)的鈣化。用上述誘導分化體系對不同代次 MSCs進行成骨分化,細胞逐漸增大,變?yōu)槎嘟切位蝼[形,隨著時間的推移,細胞逐漸匯合,進而礦鹽沉積并融合成圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié)。誘導分化20d時堿性磷酸酶陽性百分率及活性均較誘導前明顯升高,以第3代最高,堿性磷酸酶染色陽性率達 90%以上,5代以內(nèi)無顯著差異,第 6代后逐漸減低。堿性磷酸酶是成熟成骨細胞的標志酶[14],也是評價機體成骨活性和組織分化能力的特異性指標,而且其活性的高低與成骨細胞分化呈正相關(guān)。除此之外,1,25-(OH)2維生素 D3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及轉(zhuǎn)化生長因子等也可誘導M SCs向成骨分化[15]。但這些誘導劑發(fā)揮作用的機制、誘導劑間的相互作用、最佳量效比和序貫應用等問題尚未完全明確,有待進一步研究。

3 骨髓間充質(zhì)干細胞與股骨頭壞死發(fā)病機理

3.1 股骨頭內(nèi)骨吸收與骨重建的平衡關(guān)系 股骨頭壞死不同的病因最終都造成微循環(huán)損害,微循環(huán)障礙是股骨頭壞死的共同病理機制。無論原發(fā)性還是繼發(fā)性股骨頭壞死,決定其病理演變的因素可概括為3個方面。a)病因;b)由破骨細胞、成骨細胞介導的骨吸收與骨的有效重建速率的平衡關(guān)系;c)生物力學作用[16]。病因最終造成微循環(huán)損害,骨細胞、骨髓組織壞死、MSCs向成骨細胞分化能力下降。

當股骨頭壞死時,破骨細胞對失去保護的骨小梁吸收增強,骨小梁因吸收而變得稀疏細小。另一方面因骨小梁中的骨細胞壞死失去了礦物代謝功能,其機械強度隨之下降,當應力傳導時,骨小梁極易骨折。在骨壞死吸收的同時,修復的強弱取決于供血狀態(tài)、骨小梁表面的骨內(nèi)膜及骨髓的功能狀態(tài)。M SCs分裂增生,在骨壞死區(qū)出現(xiàn)富含成纖維樣母細胞的結(jié)締組織,毛細血管也再生,骨內(nèi)膜殘存的成骨細胞及來自于 M SCs分化的成骨細胞合成骨基質(zhì),重建壞死的骨小梁。通常在正常與壞死骨組織間出現(xiàn)一個修復反應區(qū),該區(qū)骨的形成和吸收都較為活躍,如果吸收的骨不能由新生的骨有效替代,將發(fā)展成一軟化區(qū),當機械負荷在此區(qū)傳遞時,一方面通過 wolf定律刺激骨的重建,另一方面又可導致骨折,引起塌陷發(fā)生。因此,骨的吸收速率及新生骨的有效重建速率應保持一定的平衡關(guān)系,而這種關(guān)系最終由破骨細胞的活動、M SCs向成骨細胞分化的能力及成骨細胞的功能狀態(tài)決定[17],在股骨頭壞死的病理進展過程中具有重要作用。

3.2 病因作用下的 M SCs活性與分化能力對股骨頭壞死的影響 臨床上大劑量應用激素是引起股骨頭壞死的常見原因。然而,地塞米松是實驗室常用的誘導 M SCs向成骨細胞分化的培養(yǎng)條件。對此,許多研究者發(fā)現(xiàn)在一定情況下地塞米松可使MSCs分化向脂肪細胞進行。早在1992年Beresford等[18]研究發(fā)現(xiàn),在M SCs培養(yǎng)時當原代和第2代都加入地塞米松則 MSCs向成骨分化為主;若原代沒有而僅在第 2代加入地塞米松則向成脂肪分化為主;若在原代用地塞米松而在第2代加入維生素D3則增加成骨分化,抑制成脂肪分化。這表明在一定條件下地塞米松可促使 M SCs主要向脂肪細胞譜系分化,其可能部分揭示了大劑量應用激素后股骨頭骨髓內(nèi)脂肪組織增多,骨內(nèi)壓升高,導致骨微循環(huán)障礙,同時骨修復過程緩慢,從而發(fā)生股骨頭缺血性壞死的機制。并且這與壞死股骨頭病理檢查骨髓中脂肪細胞增多增大的表現(xiàn)也是一致的[10]。

為此,一些采用不同方法和觀察指標的實驗都證明了激素對 M SCs向成骨分化的抑制作用。Li等[13]研究在基因表達水平地塞米松對D1細胞(人為建立的一種源于骨髓可分化為成骨細胞或脂肪細胞的細胞系)的影響,結(jié)果顯示激素在體外增強了M SCs向脂肪細胞分化,降低了其向成骨細胞分化,而且抑制血管內(nèi)皮生長因子的表述。Cui等[20]利用大鼠M SCs中的D1細胞系來分析激素對MSCs的分化影響,發(fā)現(xiàn)地塞米松在降低Ⅰ型膠原及骨鈣素基因表達的同時,刺激了M SCs向脂肪細胞的分化以及骨髓脂肪的積聚。這表明激素介導的分化有使成骨的骨髓在體內(nèi)向成脂肪細胞轉(zhuǎn)化的趨勢,可能促使骨質(zhì)疏松或股骨頭壞死的發(fā)生。

除了細胞和動物實驗,已有大量的相關(guān)臨床研究。Gangji等[21]比較了 13例股骨頭壞死和8例骨關(guān)節(jié)炎病人轉(zhuǎn)子間區(qū)成骨細胞的堿性磷酸酶活性、1,25-(O H)2維生素 D3的敏感性及膠原合成水平,結(jié)果顯示股骨頭壞死病人轉(zhuǎn)子間區(qū)成骨細胞的增殖能力下降,并認為轉(zhuǎn)子間區(qū)成骨細胞的功能改變是股骨頭壞死的發(fā)病機理之一。王佰亮等[22]檢測激素性股骨頭壞死患者股骨干骺端M SCs的數(shù)量與增殖活性,采用密度梯度離心法分離 MSCs,再經(jīng)貼壁篩選,對第 3代M SCs,用 M T T法、流式細胞儀法測定細胞生長增殖水平及細胞周期,研究結(jié)果顯示激素性骨壞死的股骨頭頸部M SCs的增殖活性明顯低于正常對照組,并推測激素可能是通過降低了 M SCs增殖活性或增殖分化能力及改變其分化方向從而引起骨壞死。 Hernigou等[23]通過比較 41例股骨頭壞死(特發(fā)性11例,激素性 14例,酒精性16例)和33例正常人髂嵴部位造血干細胞和M SCs的活性,發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死患者造血干細胞和M SCs活性較正常人均有明顯降低。后來又比較了激素性和鐮狀細胞病股骨頭壞死與正常人股骨近端骨髓的活性,骨髓由股骨頭壞死區(qū)周圍和轉(zhuǎn)子間區(qū)穿刺取得,培養(yǎng)成纖維集落形成單位評估 M SCs的活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)激素性股骨頭壞死組的集落單位數(shù)量較其他兩組明顯減少。并提出以下假說,即激素性股骨頭壞死患者的骨髓活性下降可能是對周圍骨嚴重損傷的非特異反應,而與骨壞死范圍無關(guān);骨髓活性下降可能與激素治療有關(guān),而與壞死無關(guān);因激素治療而發(fā)生骨壞死的患者,其原因可能與骨髓活性下降有關(guān)[24]。

關(guān)于酒精對MSCs影響的研究目前相對較少。Suh等[17]在髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)時取酒精性股骨頭壞死和股骨頸骨折的樣本,從股骨近端取材共 33例,將骨髓中的 M SCs分離、培養(yǎng)、擴增,比較倍增時間和分化為成骨細胞和脂肪細胞的能力,研究顯示酒精性股骨頭壞死患者 MSCs分化為成骨細胞的能力下降,提示這可能與股骨頭壞死的病因有關(guān)。孫偉等[25]研究酒精性股骨頭壞死患者股骨干骺端M SCs細胞周期的變化,采用流式細胞儀法測定第 2代 M SCs生長增殖水平及細胞周期,結(jié)果與正常對照組比較,酒精性壞死組G0/G1期細胞比例升高,S+ G2M期細胞比例降低,增殖指數(shù)降低,研究認為酒精性骨壞死的股骨干骺端M SCs增殖分化能力下降,在酒精性骨壞死的發(fā)病中可能起到一定作用。已有很多研究觀察到酒精干預后實驗動物的脂代謝紊亂,骨髓內(nèi)脂肪增加。體外研究中,Wang等[26]按0.03、0.09及0.15mol/L的濃度在小鼠的 M SCs中加入酒精4～12d,研究表明酒精可以誘導M SCs分化為脂肪細胞,脂肪細胞隨酒精濃度和作用時間而增加;且加了酒精的 M SCs堿性磷酸酶活性消失,成骨細胞減少、細胞內(nèi)脂肪堆積導致骨細胞死亡,這可能與酒精性骨壞死的發(fā)病機制有關(guān)。

從干細胞的活性與分化角度探討非創(chuàng)傷性股骨頭壞死可能的病理機制,為骨壞死病理機制研究提供了一條新思路。但是目前的研究手段與實驗方法尚存在不完善的地方,尚未建立一套完整公認的理論體系。作者認為,非創(chuàng)傷性股骨頭壞死,尤其是激素性股骨頭壞死,可能是一種由于M SCs活性及分化發(fā)生改變而引起的疾病。在激素的作用下,通過全身途徑使M SCs的增殖活性、分化能力及分化方向發(fā)生改變。作者經(jīng)過臨床長期觀察推測,這種骨髓活性異常通常是全身性的而并不僅僅局限于股骨頭周圍,這也可以解釋為什么部分激素性股骨頭壞死患者可以同時伴有肩關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等全身多關(guān)節(jié)的骨壞死。在激素或酒精等致病因素的誘導下,患者的股骨干骺端附近(非壞死區(qū))的 M SCs數(shù)量減少及活性減弱,從而使股骨頭成骨能力下降,而成脂肪分化增多,導致骨微循環(huán)障礙,使死骨在吸收后不能有效修復,進而打破了骨吸收與骨重建速率的平衡關(guān)系,在負重外力作用下,最終致股骨頭塌陷。這可能是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的重要病理機制之一。

4 應用骨髓間充質(zhì)干細胞治療股骨頭壞死方法研究

對許多難治性疾病而言,細胞移植無疑是一種行之有效的方法。將具有某種特定功能的細胞移植到體內(nèi)相應受損部位,這不僅可以恢復該部位的部分功能,而且避免了傳統(tǒng)藥物治療所引起的毒副作用。MSCs具有強大的成骨、成軟骨等多向分化潛能和增殖能力,現(xiàn)已經(jīng)廣泛應用于修復骨和軟骨缺損、組織損傷、股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松及骨關(guān)節(jié)炎等臨床多領(lǐng)域。如上所述,非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病理機制可能在于患者股骨干骺端附近的 M SCs數(shù)量減少及活性減弱,導致股骨頭成骨能力下降,使死骨在吸收后不能有效修復而最終塌陷。目前已有研究嘗試對骨壞死患者給予 M SCs移植,以期達到促進壞死修復的目的。

4.1 髓芯減壓并 M SCs移植術(shù) 髓芯減壓術(shù)是最經(jīng)得起實踐考驗的治療早期股骨頭壞死的微創(chuàng)手術(shù)方法,目的是通過髓芯減壓打斷骨內(nèi)高壓-組織水腫-骨內(nèi)高壓的惡性循環(huán),打通阻礙壞死修復的硬化帶,改善壞死區(qū)血供。在髓芯減壓基礎(chǔ)上進行M SCs移植術(shù),可以提供促進股骨頭修復重建的種子細胞,有利于加速新生骨的重建與爬行替代。

Hernigou等[27]采用髓芯減壓加自體骨髓移植治療股骨頭壞死 116例 189髖,取髂前上棘骨髓血離心后得到干細胞懸液,在髓芯減壓后,插入一小套針管,先注入少量造影劑,以了解干細胞可能擴散的區(qū)域,再從套管針注入制備好的干細胞懸液。術(shù)后經(jīng)平均隨訪7年,在塌陷前期(Ⅰ～Ⅱ期)進行治療的 145髖,只有9髖需要再次手術(shù)行關(guān)節(jié)置換,而在塌陷后期(Ⅲ～Ⅳ期)治療的44髖,有 25髖需要再次手術(shù)行關(guān)節(jié)置換。孫偉等[28]回顧性總結(jié)分析髓芯減壓聯(lián)合自體M SCs移植治療早期股骨頭壞死的療效,自患者雙側(cè)髂前上棘連續(xù)抽取骨髓血300～400 mL,分離采集中間層單個核細胞,確認壞死病灶后,以3 mm空心鉆鉆入,于骨壞死區(qū)軟骨下骨5 mm處用 50mL注射器將濃縮的細胞懸液緩慢注入股骨頭內(nèi),并與單純髓芯減壓組相比較,術(shù)后隨訪12個月。研究認為髓芯減壓聯(lián)合自體 MSCs移植是治療 ARCOⅠ～Ⅱ期股骨頭壞死安全有效的方法,臨床 Harris評分和病理影像學觀察均優(yōu)于單純髓芯減壓術(shù)式,并認為對于 ARCOⅢ期患者,兩種方法治療效果均欠佳。任弘等[29]治療 ARCOⅠ c～Ⅱ c期股骨頭壞死患者 25例 30髖,于雙側(cè)髂前上棘穿刺取骨髓血約 50～ 100mL,利用密度梯度離心法提取干細胞,與大轉(zhuǎn)子區(qū)鑿取的松質(zhì)骨充分混合,順髓芯減壓通道送入股骨頭內(nèi)并適力夯實,術(shù)后配合高壓氧治療,隨訪 1年,手術(shù)前后 Harris髖關(guān)節(jié)評分優(yōu)良率由術(shù)前的 43.3%增加到術(shù)后的 90.0%。

作者認為,股骨頭壞死的治療應根據(jù)患者年齡、分期、壞死面積、位置及塌陷危險性等進行個體化選擇,只有正確地掌握治療原則,針對不同分期采用相應方法,才能獲得最佳療效。從以上研究來看,對于塌陷前 ARCOⅠ～Ⅱ期股骨頭壞死,髓芯減壓并 M SCs移植術(shù)取得了良好的手術(shù)效果,但對于塌陷后Ⅲ～Ⅳ期患者,此種手術(shù)方式療效欠佳,治療上須慎重選擇。塌陷是股骨頭壞死疾病性質(zhì)轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵,塌陷后的保髖治療是長期困擾骨科界的一個棘手的難題。一旦塌陷進入中晚期(塌陷程度大于 4 mm,時間大于 6個月),則難以有比人工關(guān)節(jié)療效更確切的治療方法[30]。

4.2 M SCs動脈灌注 股骨頭壞死后盡管保髖治療方式千變?nèi)f化,但是改善股骨頭內(nèi)血供始終是本病治療的主要方向之一,自體干細胞移植血管再生技術(shù)的出現(xiàn)為其治療提供了更為廣闊的前景。Kocher等[31]通過實驗證實,M SCs和內(nèi)皮前體細胞可以促進缺血模型的血流恢復。 Kinnaird等[32]在給鼠缺血性后肢肌肉注射培養(yǎng)的骨源性干細胞后發(fā)現(xiàn),骨源性干細胞可以促進側(cè)支循環(huán)及肢體功能恢復,并且與血管生成有關(guān)的細胞因子基因表達水平增高。季衛(wèi)鋒等[33]應用M SCs動脈灌注治療兔股骨頭壞死動物模型,病理組織學及四環(huán)素熒光標記發(fā)現(xiàn),M SCs組治療后 2周即可見大量間充質(zhì)細胞增生,大量血管增生,周圍骨小梁表面有明顯新骨形成,與對照組相比,MSCs組顯效時間更快捷,更容易誘導再骨化過程。楊曉鳳等[34]采用超選擇性股骨頭供血動脈干細胞移植術(shù)治療股骨頭壞死患者122例,85.1%患者髖關(guān)節(jié)疼痛均有不同程度的緩解,其中15例患者干細胞移植后6個月行股骨頭供血動脈造影術(shù),發(fā)現(xiàn)不僅股骨頭區(qū)有大量血管新生,原已閉塞的動脈也重新開通,血流速度增快,局部血液循環(huán)明顯改善;12～24個月 20例股骨頭X線、CT可見骨質(zhì)病變獲得改善,如壞死區(qū)縮小,新骨形成。

M SCs選擇性動脈灌注與開放性股骨頭干細胞移植術(shù)比較,具有干細胞存活分化環(huán)境優(yōu)良、手術(shù)微創(chuàng)、不良反應少及患者依從性好等特點。該術(shù)式可能有以下幾方面作用。a)疏通發(fā)生病變的股骨頭內(nèi)血管,改善靜脈回流,降低骨內(nèi)壓,恢復或改善股骨頭的血供。b)改善或增加股骨頭壞死區(qū)域周圍及髖部各組織的血液循環(huán),為股骨頭壞死區(qū)域提供良好局部環(huán)境的血供。c)M SCs同時具有保護局部血管內(nèi)皮,促進血管內(nèi)皮細胞修復、再生及血管增生的作用。

4.3 M SCs與骨組織工程技術(shù) 組織工程是應用細胞生物學和工程學原理,將體外培養(yǎng)的功能相關(guān)的活細胞種植于天然或人工合成的具有良好生物相容性和可降解性的聚合物支架上,復合移植于體內(nèi)組織器官缺損部位,完成修復和再造。組織工程的三要素可歸納為種子細胞、信號因子和支架材料[35]。種子細胞是組成新的結(jié)構(gòu)組織的必需成份,這些細胞可以是外源性的或來源于局部環(huán)境[36]。信號因子能夠引導細胞向適宜的方向分化,這些信號因子可以由外部供給,如純化的蛋白質(zhì),或由轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生或由細胞自分泌產(chǎn)生的內(nèi)源性因子[37]。支架材料是指能夠為細胞黏附、生長、分化提供一種基質(zhì),并能植入生物體的材料,它是構(gòu)建組織工程的最基本構(gòu)架[38]。理想的骨種子細胞應該具有以下特點。結(jié)構(gòu)比較簡單,是不具有特定機能的原始細胞;取材容易,對機體損傷小;體外培養(yǎng)時增殖力強;自我更新,一定的條件下能向特定的方向分化;穩(wěn)定表達成骨細胞表型;植入體內(nèi)后能繼續(xù)產(chǎn)生成骨活動;無致瘤性。在種子細胞的選擇方面, M SCs具有強大的分化潛能和增殖能力,其來源、分離方法、分化組織類型等在修復股骨頭壞死骨缺損方面有其獨特的優(yōu)勢,是骨組織工程種子細胞的理想選擇。支架材料復合M SCs在體內(nèi)組織再生過程中可能發(fā)揮以下幾方面的作用[39]。a)在結(jié)構(gòu)上加強缺損部位的強度;b)阻礙周圍組織長人;c)作為體外接種的細胞在體內(nèi)擴增和增殖的支架;d)利用與細胞整合以及受體的相互作用,作為一種細胞功能調(diào)節(jié)因素;e)作為細胞、生長因子和基因的生物載體。按照獲得材料的過程,支架材料分為天然類和人工合成類。天然支架材料是在自然界中存在的能作為骨組織工程支架材料的物質(zhì),包括同種異體骨、異種骨膠原、氨基多糖、蛋白聚糖等。隨著化學工業(yè)中高分子聚合技術(shù)、塑料加工技術(shù)的發(fā)展,根據(jù)仿生學原理結(jié)合人體組成物質(zhì)、代謝產(chǎn)物的情況,利用化學合成的手段,合成了人工支架材料,包括生物陶瓷類和生物高分子聚合物類等。其中部分已應用到臨床或者實驗研究中,并取得了良好的效果。

孫偉等[40]通過掃描電鏡觀察磷酸三鈣多孔生物陶瓷與兔 MSCs復合培養(yǎng)體內(nèi)成骨的超微結(jié)構(gòu),了解其在股骨頭壞死骨缺損修復中的成骨效應,結(jié)果表明 M SCs與磷酸三鈣多孔生物陶瓷復合后具有良好的成骨性,該支架材料適合M SCs黏附、生長、增殖和分化,可應用與股骨頭壞死骨缺損的修復。張曄等[41]以脂質(zhì)體介導pCDNA3-Ang-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的兔 MSCs,與磷酸三鈣陶瓷復合,修復兔液氮冷凍股骨頭壞死模型。實驗組較對照組血供改善,股骨頭修復加強,研究認為 M SCs與材料復合生長良好,具有良好的組織相容性。碳酸三鈣陶瓷作為支架材料,與有機材料比較,不但具有與人體骨組織礦物質(zhì)相似的鈣,而且鈣磷比例小于1.6,可以在體內(nèi)逐步降解[42];另外 ,陶瓷燒結(jié)形成的多孔結(jié)構(gòu),為細胞生長提供了空間,孔與孔之間彼此連接,為新骨長入提供了場所,同時也有利于長入材料深部的血管彼此相通,保證深部組織的營養(yǎng)[43]。

骨組織工程學的興起為 M SCs治療股骨頭壞死提供了有力的支持,其作用機制可能在于：a)為信號因子提供了良好的載體,使得 MSCs在成骨因子的作用下更有效的向目標組織分化,從而提高生物材料的骨誘導能力。b)支架的使用保證了在壞死局部有較高濃度的M SCs,以促進成骨。c)在壞死的股骨頭內(nèi)建立有利于新生毛細血管、血管周圍組織和骨祖母細胞長入的三維結(jié)構(gòu)。但就目前而言,所有支架材料還處于研究開發(fā)階段,存在諸如價格昂貴,技術(shù)不成熟等缺點,臨床上應用效果還有待于進一步驗證。

4.4 補腎法誘導M SCs成骨分化研究 中醫(yī)學認為“腎主骨、生髓”,“腎藏精,精生髓,髓養(yǎng)骨”。腎氣固秘、腎精充盈,則能充養(yǎng)骨髓,骨髓充盈,則骨骼堅固。若腎氣虧虛、腎精不足,腎不能主骨,則骨骼脆弱,發(fā)生骨折甚至骨壞死等。股骨頭壞死屬于“骨蝕”、“骨痹”、“骨痿”、“瘀血”范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學所講的高脂血癥、脂肪代謝紊亂是股骨頭壞死的重要病理機制,過勞、久服湯藥(過度酗酒)導致腎氣虛損,腎氣不足無力推動氣血運行,氣滯血行不暢,血瘀閉阻經(jīng)脈,瘀血不去,新血不生,從而骨枯髓減,則易發(fā)生股骨頭壞死。可見“腎虛”、“血瘀”為股骨頭壞死病理變化的核心。

從干細胞角度闡釋“腎精”的實質(zhì)與作用是目前研究的一個熱點方向[44],由于傳統(tǒng)中醫(yī)理論本身重整體輕微觀的原因,從干細胞領(lǐng)域研究中醫(yī)基礎(chǔ)理論的工作還剛剛起步。中醫(yī)藥“補腎”的機理目前還不清楚,它的用途非常廣泛,是股骨頭壞死整體辨證治療的主要方法。補腎法對于中胚層來源組織(如骨、軟骨及肌肉等)的損傷具有明顯的促進修復作用,這種促進修復的作用與同樣來源于中胚層的 MSCs的正常生理分化相類似。大量研究結(jié)果表明,補腎中藥能促進M SCs體外增殖,誘導M SCs體外高效地向成骨細胞、成軟骨細胞分化。補腎法誘導M SCs增殖與定向成骨分化是近年來一個新興的研究領(lǐng)域,這對于進一步深入闡釋中醫(yī)藥調(diào)控M SCs的機理以及從“以藥驗證”的角度闡釋“腎主骨生髓”傳統(tǒng)理論提供了新思路。

許春姣等[45]研究顯示在M SCs誘導培養(yǎng)的早期,加入低濃度黃芪注射液,有利于促進 M SCs增殖和分化成骨,而長期高濃度則明顯降低M SCs分化功能。王和鳴等[46]探討巴戟天對大鼠 M SCs向成骨細胞分化影響,實驗證實巴戟天能誘導 MSCs向成骨細胞分化,在經(jīng)典成骨誘導組(地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉)中使用巴戟天含藥血清培養(yǎng),能顯著促進 M SCs向成骨細胞分化。研究認為巴戟天中含有誘導M SCs成骨分化的化學成分,但究竟是哪種化學成分起作用,還有待以后的實驗進一步證實。馬慧萍等[47]研究淫羊藿總黃酮對大鼠M SCs增殖和成骨性分化的影響,將淫羊藿總黃酮和含淫羊藿總黃酮大鼠血清分別以不同濃度加入大鼠M SCs培養(yǎng)液中,進行細胞增殖和成骨分化的分析。實驗表明淫羊藿總黃酮直接加入培養(yǎng)液對M SCs增殖無明顯影響,含淫羊藿總黃酮大鼠血清則強烈刺激細胞增殖,成倍增加堿性磷酸酶染色陽性的克隆數(shù);淫羊藿總黃酮不影響 M SCs的成骨分化,但淫羊藿總黃酮大鼠血清顯著提高堿性磷酸酶活性、骨鈣素分泌量和鈣鹽沉積量。研究認為淫羊藿總黃酮活性代謝產(chǎn)物強烈刺激M SCs的增殖和成骨分化。史傳道等[48]通過對補腎活血復方仙花活骨丹顆粒含藥血清對小鼠M SCs激素誘導分化影響的觀察,揭示該藥物治療激素性股骨頭壞死藥理學機制,研究發(fā)現(xiàn)仙花活骨丹含藥血清可有效抑制地塞米松誘導的M SCs脂肪分化進程,提高其向成骨分化的能力。吳云剛等[49]將右歸飲含藥血清加入人M SCs誘導分化成骨細胞的培養(yǎng)體系,采用細胞形態(tài)學觀察、M T T法及細胞內(nèi)堿性磷酸酶含量檢測反映其促進成骨的功能,結(jié)果表明右歸飲對人成骨細胞的增殖起到促進作用,鈣結(jié)節(jié)染色及細胞內(nèi)堿性磷酸酶含量測定表明右歸飲對成骨細胞的活性有促進作用。劉少軍等[50]研究通絡(luò)生骨膠囊對體外培養(yǎng)激素誘導M SCs成骨和成脂肪雙向分化的影響,結(jié)果地塞米松可誘導M SCs成骨和成脂肪雙向分化,通絡(luò)生骨膠囊具有明顯的抑制成脂肪分化,促進成骨分化的作用。研究認為通絡(luò)生骨膠囊治療激素性股骨頭壞死藥效機制,可能是通過對 M SCs成脂肪和成骨分化調(diào)控的影響而產(chǎn)生作用。

5 存在問題與展望

目前對M SCs及其在股骨頭壞死修復中的研究雖然已取得了較大進展,M SCs在臨床醫(yī)學上的應用價值也已得到了肯定,但仍有許多問題有待解決。a)M SCs誘導分化的信號轉(zhuǎn)導機制還不是很明確,多種誘導調(diào)控因素之間的相互作用也未完全闡明,還需要進一步探索。b)目前對于從干細胞角度探討股骨頭壞死病理機制的研究還僅限于由 M SCs向成骨細胞、脂肪細胞或血管內(nèi)皮細胞分化這一環(huán)節(jié)上,而造血干細胞對于骨壞死的影響尚缺乏關(guān)注,壞死各階段的病理過程還可以在干細胞水平做更為深入的研究。c)在成骨的過程中,MSCs細胞間如何作用以及其所處的微環(huán)境中各種刺激因子如何起作用,植入后的 M SCs所形成的新生骨在組織學、生物力學上與正常骨有多大差別,能否解決退變等問題也尚待研究。d)目前組織工程支架材料還處于研發(fā)階段,且價格昂貴,技術(shù)尚未成熟,在臨床上的應用有待于進一步的驗證。e)MSCs移植治療股骨頭壞死的療效缺乏長期隨訪及大樣本隨機對照研究,療效評價標準和適應證的選擇缺乏統(tǒng)一的標準。f)移植M SCs的適宜細胞量仍不清楚,移植途徑究竟是直接移植好還是經(jīng)血管移植好,還是兩者聯(lián)合使用更好,目前也缺乏研究報道。

M SCs具有強大增殖能力和多向分化潛能,其來源不受限制,取材方便,對供體損傷小,易于分離,大量傳代后仍能保持其生物學特性。中藥在 MSCs的擴增、定向分化的調(diào)控方面都有其獨特的作用,既可直接作用于M SCs,又可影響其微環(huán)境,促進其存活與功能的建立?；谏鲜鲈?將中藥結(jié)合M SCs治療股骨頭壞死預示著良好的前景。但是目前的研究多僅限于動物實驗,從人體實驗方面研究中藥對于M SCs的干預作用尚鮮見報道。目前有關(guān)M SCs的藥物研究報道主要是基于對治病機理的反推求證,雖然大量臨床研究結(jié)果顯示單純藥物治療不能改變壞死股骨頭的塌陷變形,但是對壞死的自身修復作用是有確切幫助的。運用干細胞技術(shù)研究中醫(yī)藥對股骨頭壞死的作用,也許可以使藥物的作用機理更加明確,從而篩選出有效的治療藥物。因此,如何發(fā)揮中醫(yī)藥治療股骨頭壞死的獨特優(yōu)勢,從細胞水、分子和基因水平探討中藥結(jié)合 M SCs治療股骨頭壞死藥理學機制,進而過渡到人體實驗,具有積極重要的意義。

[1] PittengerM F,Mackay AM.Beck SC,etal. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(4)：143-147.

[2] Justesen J,Stenderup K,Eriksen EF,etal. Maintenance of osteoblastic and adipocytic differentiation potential with age and osteoporosis in human marrow stromal cell cultures[J].Calcif Tissue Int,2002,71(1)：36-44.

[3] TamirA,Petrocelli T,Stetler K,et al.Stem cell factor inhibits erythroid differentiation by modulating the activity of G1-cyclin-dependent kinase complexes：A role for p27 in erythroid differentiation coupled G1 arrest[J].Cell Growth Differ,2000,11(5)：269-277.

[4] Woodbury D,Schwarz EJ,Prockop DJ,et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons[J].J Neurosci Res,2000, 61(4)：364-370.

[5] Lagasse E,Connors H,Al-Dhalimy M,et al.Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo[J].Nat Med,2000,6(11)：1229-1234.

[6] Gronthos S.Zannettino AC,Hay SJ,et al.Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derives from human bone marrow [J].Cell Sci,2003,116(5)：1827-1835.

[7] Minguell JJ.Is hyaluronic acid the“organizer”of the extrace11ular matrix in marrow stroma? [J].Exp Hemato1,1993,21(1)：7-8.

[8] Conget PA,Minguell JJ.Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells[J].J Cell Physiol,1999,l81(1)：67-73.

[9] Tropel P,Noel D,Platet N,et al.Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow[J].Exp Cell Res,2004, 295(2)：395-406.

[10] Bosnakovski D,Mizuno M,Kim G,et al. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells in pellet cultural system[J]. Exp Hematol,2004,32(5)：502-509.

[11] Romanov YA,Darevskaya AN,Merzlikina NV,et al. Mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue：Isolation,characterization,and differentiation potentialities[J].Bull Exp Biol Med, 2005,140(1)：138-143.

[12] Tabata Y.Tissue regeneration based on tissue engineering technology[J].Congenit Anom(Kyoto), 2004,44(1)：111-124.

[13] Li X,Jin L,CuiQ,etal.Steroid effects on osteogenesis through mesenchymal cell gene expression[J].Osteoporos Int,2005,16(1)：101-108.

[14] Shamblott M J,Axelman J,Wang S,et al.Derivation ofpluripotentstem cellsfrom cultured human primordial germ cells[J].PNAS,1998,95(23)：13726-13731.

[15] Jorgensen N R,Henriksen Z,Sorensen O H,et al. Dexamethasone,BM P-2 and 1,25-dihydroxy vitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype：Validation of anin vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts[J]. Steroids,2004,(69)：219-226.

[16]胡長根,陳君長,劉強,等.激素對股骨頭微血管及組織細胞的影響[J].中華骨科雜志,2004,24(6)：359-363.

[17] Suh KT,Kim SW,Roh HL,etal.Decreased osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in alcohol-induced osteonecrosis[J].Clin Orthop Relat Res,2005,(431)：220-225.

[18] Boresford JN,Bennett JH,Devlin C,et al.Evidence for an inverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures[J].Cell Sci,1992, 102(2)：341-392.

[19] Motomura G,Yamamoto T,Miyanishi K,et al.Bone marrow fat-cell enlargement in early steroid-induced osteonecrosis：A histomorphometric study of autopsy cases[J].Pathol Res Pract,2005,200(11-12)：807-811.

[20] Cui Q,Wang GJ,Balian G.Pluripotential marrow cells produce adipocytes when transplanted into steroid-treated mice[J].Conncet Tissue Res,2000, 41(1)：45-56.

[21] Gangji V, Hauzeur JP, Schoutens A,etal. Abnormalities in the replicative capacity of osteoblastic cells in the proximal femur of patients with osteonecrosis of the femoral head [J]. Rheumatol,2003,30(2)：348-351.

[22]王佰亮,李子榮,婁晉寧.激素性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細胞增殖活性的檢測 [J].中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版),2008,2(1)：25-28.

[23] Hernigou P,Beaujean F.Abnormalities in the bone marrow ofthe iliac crest in patients who have osteonecrosis secondary to corticosteroid therapy or alcohol abuse[J].J Bone Joint Surg(Am),1997,79 (7)：1047-1053.

[24] Hernigou P,Beaujean F,Lambotte JC.Decrease in the mesenchymal stem-cell pool in the proximal femur in corticosteroid-induced osteonecrosis[J].J Bone Joint Surg(Br),1999,81(2)：349-355.

[25]孫偉,王佰亮,李子榮,等.酒精性股骨頭壞死股骨干骺端骨髓間充質(zhì)干細胞細胞周期的變化 [J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(3)：469-472.

[26] Wang Y,LiY,Mao K,etal.Alcohol-induced adipogenesis in bone and marrow：A possible mechanism for osteonecrosis[J].Clin Orthop Relat Res,2003(410)：213-214.

[27] Hernigou P,Beaujean F.Treatment of osteonecrosis with autologous bone marrow grafting[J].Clin Orthop Relat Res,2002(405)：14-23.

[28]孫偉,李子榮,王佰亮,等.髓芯減壓加自體骨髓干細胞移植治療股骨頭壞死的早期隨訪結(jié)果 [J].中國組織工程研究與臨床康復,2008,12(12)：2231-2234.

[29]任弘,郝福合,趙成玉,等.髓芯減壓自體骨髓干細胞移植治療股骨頭缺血性壞死 [J].河北醫(yī)科大學學報, 2008,29(4)：572-574.

[30]龐智暉,何偉,張慶文,等.改良減壓植骨內(nèi)穩(wěn)定術(shù)治療圍塌陷期激素性股骨頭壞死 [J].廣東醫(yī)學,2009, 30(7)：1071-1073.

[31] KocherAA,SchusterMD,SzabolesM J,et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis,reduces remodelingand improves cardiac function[J].Bat M ed,2001,7(4)：430-436.

[32] Kinnaird T,Stabile E,Burnet MS,et al.Marrowderived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis through paracrine mechanisms[J].Circ Res,2004,94(5)：678-685.

[33]季衛(wèi)鋒,童培建,鄭文標,等.骨髓多能干細胞動脈灌注治療股骨頭壞死的實驗研究 [J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24(11)：999-1002.

[34]楊曉鳳,王紅梅,許憶峰,等.干細胞移植改善股骨頭壞死缺血狀態(tài) 122例臨床觀察 [J].中華外科雜志, 2007,45(20)：1428-1431.

[35] Kanczier JM, Oreffo RO. Osteogenesis and angiogenesis：The potential for engineering bone[J]. Eur Cell Mater,2008,15(2)：100-114.

[36] Kruyt M,De Bruijn J,Rouwkema J,et al.Analysis of the dynamics of bone formation,effect of cell seeding density,and potential of allogeneic cells in cell-based bone tissue engineering in goats[J].Tissue Eng Part A,2008,14(6)：1081-1088.

[37] TohmaY,OhgushiH,Morishita T,et al.Bone marrow-derived mesenchymal cells can rescue osteogenic capacity of devitalized autologous bone [J].Tissue Eng Regen Med,2008,2(1)：61-68.

[38] Spalazzi JP,DagherE,Doty SB,et al.In vivo evaluation of a multiphased scaffold designed for orthopaedic interface tissue engineeringand soft tissue-to-bone integration[J].J Biomed Mater Res A,2008,86(1)：1-12.

[39]金勛杰,周景龍,楊顯生.骨組織工程支架材料研究進展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2006,12(4)：424-427.

[40]孫偉,李子榮,王佰亮,等.磷酸三鈣多孔生物陶瓷復合自體骨髓間充質(zhì)干細胞修復股骨頭壞死模型的超微結(jié)構(gòu)觀察 [J].中國組織工程研究與臨床康復, 2009,13(3)：457-460.

[41]張曄,曾炳芳,張長青,等.骨髓間充質(zhì)干細胞預構(gòu)人工骨對兔股骨頭壞死的修復作用[J].中國臨床康復, 2004,8(20)：3960-3962.

[42]胡建中,毛新展,呂紅斌,等.羥基磷灰石 /磷酸三鈣復合材料成骨細胞載體的體外實驗[J].中國臨床康復, 2003,7(6)：916-917,925.

[43] LeGeros RZ. Properties of osteoconductive biomaterials：calcium phosphates[J].Clin Orthop Relat Res,2002(395)：81-98.

[44]張進,徐志偉,杜少輝,等.“精”學說與干細胞辨識[J].中醫(yī)藥學刊,2004,22(7)：1198-1200.

[45]許春姣,翦新春,成紅泉,等.黃芪對兔骨髓基質(zhì)細胞增殖和向成骨細胞分化的影響[J].中南大學學報(醫(yī)學版),2004,29(4)：489-491.

[46]王和鳴,王力,李楠,等.巴戟天對骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化影響的實驗研究 [J].福建中醫(yī)學院學報, 2004,14(3)：16-20.

[47]馬慧萍,賈正平,張汝學,等.淫羊藿總黃酮含藥血清促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨性分化[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2004,10(4)：420-422.

[48]史傳道,楊曉航,于遠望,等.仙花活骨丹顆粒對小鼠M SCs激素誘導分化的影響 [J].遼寧中醫(yī)雜志, 2005,32(8)：848-849.

[49]吳云剛,張志平.右歸飲含藥血清對人骨髓基質(zhì)干細胞誘導為成骨細胞的影響 [J].江西中醫(yī)藥,2006,37 (7)：57-58.

[50]劉少軍,鄧彥,王海彬.通絡(luò)生骨膠囊對骨髓基質(zhì)干細胞成骨和成脂肪雙向分化的影響 [J].四川中醫(yī), 2008,26(3)：22-24.