中國部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)馬鈴薯Y病毒(PVY)的株系分化與鑒定

陳士華，劉曉磊，張曉婷，吳興泉

(1.河南工業(yè)大學，河南 鄭州450001;2.河南農(nóng)業(yè)大學，河南 鄭州450002)

馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，PVY)是馬鈴薯上最常見、危害最重的馬鈴薯病毒之一，發(fā)病嚴重時減產(chǎn)可達80%以上.馬鈴薯Y病毒為正義單鏈RNA病毒，線狀，全基因組長度在9 700 nt左右，由1個開放閱讀框和其兩側的非編碼區(qū)組成，可編碼1個多聚蛋白，然后自身水解成至少10個蛋白質(zhì).作為RNA病毒，PVY在自然條件下極易發(fā)生基因重組

或突變而產(chǎn)生具有不同致病力的新株系.因此，PVY具有明顯的株系分化現(xiàn)象.PVY已被廣泛認同的株系類型有3種:PVYO株系、PVYN株系和PVYC株系.近年來，PVY在歐洲、美洲等地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列的具有高致病性的PVY新株系.主要包括PVYNTN株 系［1］、PVYNW株 系［2］、PVYN:O株 系［3］、PVYnnp株系［4］等.其中 PVYNTN株系、PVYNW株系、PVYN:O株系是侵染馬鈴薯的PVY株系，PVYnnp株系則是侵染辣椒的PVY株系.PVY的各種新株系不但致病力更強，而且傳播更為迅速，新的流行疫區(qū)不斷出現(xiàn)，在一些國家已經(jīng)成為PVY的主流株系.PVY在中國分布廣泛.目前，中國在株系水平上對PVY進行的研究已經(jīng)開展，郭興啟［5］和李鵬［6］分別克隆鑒定了PVYN株系cp基因介導的煙草抗病性.王秀芳等［7］證明PVY山東分離物為PVYO株系.石鵬君［8］克隆表達了PVYN株系和PVYO株系的HC-Pro基因.目前，PVY各類新株系在中國馬鈴薯上的發(fā)生情況、分子特征、致病性等方面尚未見到系統(tǒng)的研究報道，影響了對PVY開展有效地監(jiān)控措施.研究明確中國各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)PVY的株系種類，可為制定PVY的綜合防治策略提供理論依據(jù)，對促進馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展、保證糧食生產(chǎn)安全具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 毒源的獲得

2007—2008年間分別在山西省臨縣，貴州省貴陽市、威寧自治縣和黑龍江省克山農(nóng)場等地區(qū)采集獲得感染PVY的馬鈴薯樣本.

1.2 PVY p1基因和cp基因的克隆

1.2.1 引物的設計與合成 依據(jù)PVY cp基因和p1基因上、下游核苷酸序列，設計RT-PCR引物序列.其中PVY p1基因上游引物PVYP1序列為:5'-TCATCCATGGCAACTTACACA-3'，下游引物PVYP2序列為:5'-AACCATTGAATCCATAACCCC-3'.PVY cp基因上游引物 YCP1:5'-CACCATATGGCAAGCAAATGACACAAT-3';PVY cp基因下游引物YCP2:5'-CCATCTAGAGACACTACATCACAT-3'.引物有寶賽生物科技有限公司合成.

1.2.2 cp基因和p1基因的克隆與序列測定 采用植物RNA提取試劑盒提取帶毒馬鈴薯樣本的總RNA，以此為模板，加入隨機六聚體引物在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用上述引物，采用常規(guī)PCR法擴增cp基因和p1基因.基因克隆載體選用Promega公司的pGEM-T Easy Vector System(長3 018 bp，具有Amp抗性，可用于藍白斑篩選).PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，采用DNA膠回收試劑盒進行純化，與pGEM-T easy Vector連接，然后采用CaCl2法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞.選取白色菌落擴大培養(yǎng)后，采用堿裂解小量提取法質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定.對陽性克隆進行基因序列測定，序列測定在大連寶生物工程有限公司進行.

1.3 依據(jù)p1基因和cp基因?qū)VY株系進行分子鑒定

將p1基因和cp基因聯(lián)合進行序列分析.從Genbank中檢索獲得已知株系類型的PVY全基因組序列，從中截取各分離物的p1基因和cp基因序列，并將兩基因聯(lián)合.然后將本研究中測定的中國各地區(qū)PVY的p1基因和cp基因聯(lián)合后與上述聯(lián)合基因序列共同利用Clustal X軟件和BioEdit軟件進行系統(tǒng)進化樹的建立和序列特征分析，以明確各分離物的株系種類.

2 結果與分析

2.1 中國部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)PVY p1基因和cp基因的克隆

以帶毒馬鈴薯葉片總RNA為模板，以隨機六聚體為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，以PVYCP1，PVYCP2和PVYP1，PVYP2為引物，PCR擴增p1基因和cp基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(圖1-2).序列測定結果表明，利用 PVYCP1和 PVYCP2引物獲得的DNA片段全長1 064 bp，其中1～798 bp為PVY cp基因，799～1 064 bp為3'非編碼區(qū)序列.利用PVYP1和PVYP2引物獲得的DNA片段全長852 bp，可編碼282個氨基酸的蛋白質(zhì)，其1～6 bp為PVY基因組5`非編碼區(qū)序列，7～831 bp為p1基因序列，832～852 bp為HC-pro基因部分序列.通過上述方法已克隆獲得PVY黑龍江省克山分離物、山西省臨縣分離物、貴州省貴陽分離物、威寧分離物的p1基因和cp基因(Genbank序列號分別為FJ766535， FJ766536， EU719650， EU675327，F(xiàn)J766533，F(xiàn)J423029，F(xiàn)J423031，F(xiàn)J423030).

圖1 PVY cp基因PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 The PCR produce of PVY cp gene and the identification of recombination plasmid by restriction enzyme cleavage

圖2 PVY p1基因PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 The PCR produce of PVY p1 gene and the identification of recombination plasmid by restriction enzyme cleavage

2.2 依據(jù)p1基因和cp基因序列鑒定中國PVY分離物株系類型

2.2.1 依據(jù)p1基因和cp基因建立PVY系統(tǒng)進化樹 前期研究證明單獨利用p1基因和cp基因序列分析均無法對PVY全部株系種類進行準確鑒定，但將兩基因聯(lián)合后分析可達到很好的鑒定效果［9］.因此，本研究將p1基因和cp基因聯(lián)合后建立PVY系統(tǒng)進化樹，對同時克隆獲得p1基因和cp基因的中國PVY分離物進行分析，結果如圖3所示.由圖可知，在系統(tǒng)進化樹中中國黑龍江省克山(KSH)分離為PVYNTN株系;貴州省貴陽(GY)分離物、威寧(WN)分離物、山西省臨縣(LX)分離物為PVYN:O株系.

圖3 依據(jù)cp和p1基因建立PVY株系間系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of PVY strains based on the cp and p1 gene sequences

貴陽(GY)分離物、威寧(WN)分離物、臨縣(LX)分離物雖然明顯具有PVYN:O株系的分子特征，但在系統(tǒng)進化樹中它們與來自美洲的6個PVYN:O株系分離物仍然具有一定距離.上述情況說明來源中國的PVYN:O株系具有一定的地域分子特征，它們可能是在中國單演化而來，而不是從歐美地區(qū)傳入中國的.

2.2.2 p1基因和cp基因中基因重組位點分析通過研究發(fā)現(xiàn)來自歐美的PVYO株系和PVYN株系間p1基因和cp基因存在明顯的分子差異，具有各自不同的分子序列特征.PVYNW株系的p1基因存在1個重組位點，而cp基因無重組位點，全部表現(xiàn)為PVY°株系的cp基因特征.PVYN:O株系的p1基因和 cp基因均無重組位點，p1基因表現(xiàn)為PVYN株系特征，而cp基因則表現(xiàn)為PVYO株系特征.PVYNTN株系的cp基因均存在1個重組位點，而p1基因則存在1個或無重組位點.利用此規(guī)律對中國4個不同分離物的p1基因和cp基因進行分析，結果如圖4所示，由圖4可以證明KSH分離物為PVYNTN株系.GY分離物、WN分離物和LX分離物為PVYN:O株系，這與利用系統(tǒng)進化樹的分析結果相同.

3 討論

在前期研究中分別對河南省PVY進行了分子鑒定［9］，明確了PVY在河南省馬鈴薯田間的發(fā)生情況，并證明利用p1基因和cp基因序列聯(lián)合分析可對PVY各株系進行分子鑒定.在此基礎上，本研究進一步證明中國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)PVY已具有明顯的株系分化現(xiàn)象，PVYNTN株系、PVYN:O株系均有發(fā)生，而且這些具有明顯基因重組特征的株系可能已成為中國馬鈴薯田間PVY的流行株系，目前尚未見到相關的研究報道.

在本研究測定的4個不同地區(qū)的PVY分離物中，未發(fā)現(xiàn) PVYN，PVYO，PVYC株系，其中3個地區(qū)的PVY分離物屬于PVYN:O株系，這也說明目前在中國馬鈴薯田間PVY通過重組發(fā)生變異的現(xiàn)象十分普遍，PVYN:O株系的發(fā)生及分布范圍十分廣泛，可能已成為流行株系.通過分子序列分析，證明中國的PVYN:O株系具有明顯的地域特征，說明這些株系可能是在中國單獨演化而來的，也可能是從歐美等地傳入中國后通過基因重組而產(chǎn)生，相關內(nèi)容有待于深入研究.

近年來，有研究表明一些PVYNTN株系和PVYN:O株系分離物均可引起馬鈴薯塊莖壞死病(Potato tuber necrotic ringspot disease，PTNRD)［1，10］，該病害的一個重要特征性癥狀是在馬鈴薯塊莖的內(nèi)部或外部引起環(huán)狀、弧狀壞死斑，嚴重影響馬鈴薯的品質(zhì)和經(jīng)濟價值.本研究證明，PVYNTN株系和PVYN:O株系在中國均有發(fā)生，并且PVYN:O株系可能已成為中國馬鈴薯田間的主要流行株系，這表明在PVY防治工作中應加強對這些新的重組型株系的發(fā)生與危害情況的更為嚴格的監(jiān)控，以便制定相應的防治策略，以確保馬鈴薯高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn).

［1］ BECZNER L，HORVATH J，ROMHANYI I，et al.Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato［J］.Potato Research，1984，27(3):339－352.

［2］ CHRZAOWSKA M.New isolates of the necrotic strain of potato virus Y(PVYN)found recently in Poland［J］.Potato Research，1991，34(2):179－182.

［3］ NIE X，SINGH RP.A new approach for the simultaneous differentiation of biological and geographical strains of potato virus Y by uniplex and multiplex RT－PCR［J］.J Virol Methods，2002，104(1):41 －54.

［4］ FANIGLIULO A，COMES S，PACELLA R，et al.Characterization of potato virus Y nnp strain inducing veinal necrosis in pepper:a naturally occurring recombinant strain of PVY［J］.Archive of Virology，2005，150(4):709－720.

［5］ 郭興啟.翻譯與非翻譯馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因介導的抗病性比較［D］.杭州:浙江大學，2001.

［6］ 李 鵬.馬鈴薯Y病毒CP基因5'端和3'端反向重復結構介導的抗病性研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2006.

［7］ 王秀芳，朱常香，溫孚江，等.一個馬鈴薯Y病毒山東分離物的分離與鑒定［J］.植物病理學報，2003，33(3):203－208.

［8］ 石鵬君.馬鈴薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花葉病毒CP基因的克隆、原核表達與抗血清制備［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2004.

［9］ 陳士華，劉曉磊，張曉婷，等.河南省PVY高致病性株系的發(fā)現(xiàn)及其分子特征研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學學報，2010，44(4):443 －447.

［10］ PICHE L M，SINGH R P，NIE X，et al.Diversity among PVY field isolates obtained from potatoes grown in the United States［J］.Phytopathology，2004，94:1368－1375.