RhoA參與緩激肽調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin分布和表達(dá)的作用

馬 騰，王 萍，薛一雪

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽(yáng)110001)

研究顯示，化療藥物進(jìn)入腦膠質(zhì)瘤組織必須通過(guò)血腫瘤屏障(BTB)，BTB在很大程度上影響其化療效果［1］;腫瘤組織的化療藥物濃度提高2倍，其療效增加10倍，增加腦膠質(zhì)瘤組織中的化療藥物濃度是提高其療效的重要因素。國(guó)內(nèi)外研究表明，小劑量緩激肽(BK)及其受體激動(dòng)劑RMP-7能增加BTB通透性，兩者的作用及機(jī)制基本相似。目前，對(duì)BK及其受體激動(dòng)劑增加BTB通透性的機(jī)制仍不明確。研究證明［2］，BK可降低腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RBMECs)膜上的緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin表達(dá)，通過(guò)開(kāi)放緊密連接(TJ)的細(xì)胞旁途徑開(kāi)放BTB，但其具體機(jī)制不明。RhoA/ROCK 信號(hào)通路參與許多血管活性物質(zhì)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高過(guò)程［3］。以往研究證明，ROCK參與BK介導(dǎo)的BTB通透性增加［4］。為探討RhoA參與BK對(duì)occludin分布和表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，2009年3月～2010年3月，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 Nuserum血清(BD Biosciences);FBS(Hyclone公司);occludin抗體(Zymed);RhoA特異性抑制劑肉毒梭菌C3胞外酶、DMEM培養(yǎng)液、BK(Sigma)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RBMECs原代培養(yǎng)和體外BTB建模 將48只3～5 d的胚胎大鼠用CO2吸入法處死，開(kāi)顱取其大腦皮質(zhì)。分離培養(yǎng)大鼠RBMECs及體外BTB建模方法參考文獻(xiàn)［2，5］。將大鼠分為6組各8只，即對(duì)照組、BK 0 min組(A 組)、BK 5 min組(B 組)、BK 10 min組(C組)、BK 15 min組(D組)和BK 15 min+C3胞外酶組(E組)。對(duì)照組加等量無(wú)菌生理鹽水1 μmol/L 處理 15 min;A、B、C、D 組分別在不同時(shí)間加BK處理;E組將C3胞外酶50 μg/ml加入Transwell上室中，4 h后移去上室培養(yǎng)基，向上室加BK 1 μmol/L 作用15 min。

1.2.2 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗(TEER)檢測(cè) 應(yīng)用Millicell-ERS電阻測(cè)量系統(tǒng)，檢測(cè)各組體外 BTB的TEER。

1.2.3 Western-blot法檢測(cè)occludin表達(dá) 當(dāng)Transwell上室的細(xì)胞生長(zhǎng)到融合時(shí)，先用PBS沖洗，再用細(xì)胞鏟刮取下，倒入裂解液A 1 ml中，勻漿、離心，上清液為蛋白樣品液?？?occludin抗體(1∶600)、抗 β-actin 抗體(1∶1 000)4 ℃孵育、二抗孵育、發(fā)光、顯像，所得圖像進(jìn)行定量分析，測(cè)量整合光密度值(IDV)。

1.2.4 免疫熒光法觀察 occludin分布 將單層RBMECs用冷冰固定，0.5%TritonX-100透化，5%BSA封閉。occludin(1∶200)孵育后，用熒光二抗(1∶200)避光孵育，封片，觀察，采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用Bonferroni檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組TEER值比較 見(jiàn)圖1。

圖1 各組TEER值比較

2.2 各組occludin表達(dá)比較 見(jiàn)圖2。

圖2 各組occludin表達(dá)比較

2.3 occludin分布 A組occludin在RBMECs膜上呈連續(xù)分布;B組occludin在細(xì)胞膜上不連續(xù)分布，且表達(dá)減少，occludin由細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移;E組occludin部分恢復(fù)呈連續(xù)分布，occludin由細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移明顯減少。

3 討論

我們以往研究發(fā)現(xiàn)，BK可明顯降低TEER，增加體外BTB模型的通透性，與Liu等［2］報(bào)道一致。本研究顯示，C3胞外酶可抑制體外BTB模型TEER降低，證明RhoA信號(hào)分子參與BK介導(dǎo)的BTB開(kāi)放。

Occludin是構(gòu)成TJ的主要跨膜蛋白，TJ是構(gòu)成BTB的重要結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜上的occludin蛋白表達(dá)減少時(shí)，提示TJ開(kāi)放，BTB通透性增加。本研究發(fā)現(xiàn)，BK可明顯降低細(xì)胞膜上的occludin表達(dá)，C3胞外酶可明顯抑制其表達(dá)下降，說(shuō)明RhoA信號(hào)分子參與BK介導(dǎo)的BTB通透性增加;還發(fā)現(xiàn)BK可使occludin重新分布，C3胞外酶可抑制BK使occludin重分布的作用。Russ等［6］研究表明，RhoA信號(hào)分子可誘導(dǎo)應(yīng)力纖維形成，引起occludin重新分布，增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道［6］一致，說(shuō)明BK也能引起occludin重新分布，使BTB開(kāi)放;但C3胞外酶不能完全抑制BK的效應(yīng)，提示可能有其他信號(hào)傳導(dǎo)通路參與BK開(kāi)放BTB的過(guò)程。

綜上所述，RhoA信號(hào)分子參與BK對(duì)occludin的分布和表達(dá)調(diào)節(jié)，以及BTB通透性升高過(guò)程;但是否有其他信號(hào)傳導(dǎo)通路參與此過(guò)程調(diào)節(jié)仍不明確，有待于深入研究。

［1］Erdlenbruch B，Schinkhof C，Kugler W，et al.Intracarotid administration of short-chain alkylglycerols for increased delivery of methotrexate to the rat brain［J］.Br J Pharmacol，2003，139(4):685-694.

［2］Liu LB，Xue YX，Liu YH，et al.Bradykinin increases blood-tumor barrier permeability by down-regulating the expression levels of ZO-1，occludin，and claudin-5 and rearranging actin cytoskeleton［J］.J Neurosci Res，2008，86(5):1153-1168.

［3］Sun H，Breslin JW，Zhu J，et al.RhoA and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability［J］.Microcirculation，2006，13(3):237-247.

［4］馬騰，薛一雪.Y-27632抑制緩激肽選擇開(kāi)放血腫瘤屏障的研究［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2009，15(4):400-402.

［5］Fan L，Liu Y，Ying H，et al.Increasing of blood-tumor barrier permeability through paracellular pathway by low-frequency ultrasound irradiation in vitro［J］.J Mol Neurosci，2011，43(3):541-548.

［6］Russ PK，Kupperman AI，Presley SH，et al.Inhibition of RhoA signaling with increased Bves in trabecular meshwork cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(1):223-230.