155例漢族結(jié)核病患者N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)基因多態(tài)性分析

李昕潔 王云南 鄒永紅 何剛 尹小毛 張言斌 蘇雯婕 劉志輝

(1.廣州市胸科醫(yī)院 廣州 510095;2.廣州醫(yī)學(xué)院 廣州 510180)

155例漢族結(jié)核病患者N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)基因多態(tài)性分析

李昕潔1王云南1鄒永紅1何剛1尹小毛1張言斌1蘇雯婕2劉志輝1

(1.廣州市胸科醫(yī)院 廣州 510095;2.廣州醫(yī)學(xué)院 廣州 510180)

目的探討中國(guó)漢族結(jié)核病患者N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)基因分布特征>。方法應(yīng)用PCR-DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞基因組NAT2基因的特定序列,分析常見(jiàn)位點(diǎn)的單核苷酸突變,并與文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)其他地區(qū)健康人群NAT2基因多態(tài)性進(jìn)行比較>。結(jié)果對(duì)155例漢族結(jié)核病患者NAT2基因的特定序列進(jìn)行了測(cè)定,NAT2等位基因頻率分別為：NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%);共檢測(cè)到 NAT2*4/4、NAT2*4/5A 、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C、NAT2*4/6、NAT2*4/7、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6 、NAT2*6/7、NAT2*7/7 11 種基因型 ,根據(jù)基因表型的代謝速度將其分為快型(NAT2*4/4)、中間型(NAT2*4/5A、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)、慢型(NAT2*5B/6、NAT2*5B/7 、NAT2*6/6 、NAT2*6/7 、NAT2*7/7)3類,出現(xiàn)頻率分別為：23.2%,54.9%(1.3%,3.2%,1.9%,34.9%,13.6%),21.9%(1.9%,4.5%,5.8%,9.0%,0.6%);結(jié)核病患者與健康人群間的代謝速度分型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.93,P＜0.01)>。結(jié)論中國(guó)漢族結(jié)核病患者NAT2的基因表型以中間型為主要存在形式(占54.9%),NAT2的基因型分布可能與結(jié)核病易感性有關(guān)。

結(jié)核/酶學(xué);芳基胺N-2酰轉(zhuǎn)移酶;多肽現(xiàn)象,遺傳;漢族

N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(NAT2)是體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶,直接影響芳香胺及雜環(huán)胺類物質(zhì)在人體內(nèi)的代謝,研究表明NAT2的基因多態(tài)性與某些疾病的遺傳易感性相關(guān)且存在明顯的種族和地域差異。國(guó)外已有研究報(bào)道南非、俄羅斯等人群中NAT2基因多態(tài)性分布與結(jié)核病的遺傳易感性之間的關(guān)系[1-2],然而在我國(guó),對(duì)于NAT2基因多態(tài)性在結(jié)核病患者中的分布規(guī)律則未見(jiàn)報(bào)道。本研究應(yīng)用PCR-DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)我國(guó)結(jié)核病患者外周血淋巴細(xì)胞基因組NAT2基因的特定序列進(jìn)行測(cè)定,分析常見(jiàn)位點(diǎn)的單核苷酸突變,旨在了解我國(guó)結(jié)核病患者NAT2基因多態(tài)性分布特征,并為進(jìn)一步研究NAT2基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性、抗結(jié)核藥物肝損害的關(guān)系等提供資料。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 本院確診的漢族結(jié)核病患者外周血標(biāo)本155例,其中男性99例,女性56例,年齡17～81歲,平均42.7歲,個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系。

1.2 儀器與試劑 DNA提取液購(gòu)自深圳匹基生物工程有限公司;PCR試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司,引物由大連寶生物工程有限公司合成;PCR產(chǎn)物純化試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司;PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Applied Biosystems公司9600 GeneAmp PCR System;DNA測(cè)序儀為美國(guó) ABI 3100基因分析儀。

1.3 NAT2基因型檢測(cè)

1.3.1 DNA提取 采用密度梯度離心法分離外周血淋巴細(xì)胞后,加入40 μ l DNA提取液,漩渦振蕩30 s,于1 680 g離心5 s后100℃水浴10 min;之后以7 280 g離心10 min,吸取上清液置于一新EP管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的人類NAT2基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,PCR上、下游引物分別為5′-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3′和 5′-TTGGGTGATACATACACAAGGGG-3′。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 (1)反應(yīng)體系：50 μ l反應(yīng)體系中,4種dNTP的終濃度均為0.2 mmol/L,上下游引物終濃度均為0.8 mmol/L,TaqDNA聚合酶為1.25 U,模板量為50～100 ng。(2)反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min,95℃30 s、60℃30 s、72℃1 min共30個(gè)循環(huán),72℃延伸5 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序及結(jié)果分析 PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳確定其為NAT2后,陽(yáng)性標(biāo)本純化后進(jìn)行測(cè)序分析。(1)測(cè)序體系配制：在PCR反應(yīng)管中依次加入 1 μ l Ready Reaction Premix 、3.5 μ l BigDye Sequencing Buffer、13 μ l去離子水 、0.2 μ l上游引物(濃度為 20 μ mol/L)、0.2 μ l 下游引物(濃度為20 μ mol/L)和 2.5 μ l DNA 模板并混勻。(2)測(cè)序反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3 min,96℃10 s、50℃5 s、60℃4 min共25個(gè)循環(huán),4℃保存。(3)產(chǎn)物純化后上測(cè)序儀檢測(cè),判斷測(cè)定序列包含的等位基因類型,并判斷個(gè)體基因型。

2 結(jié)果

2.1 我國(guó)漢族結(jié)核病患者NAT2等位基因頻率NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%),未檢測(cè)到NAT2*14型基因突變。(見(jiàn)表1)

表1 我國(guó)漢族結(jié)核病患者NAT2等位基因分布頻度

表2 我國(guó)漢族結(jié)核病患者NAT2基因型分布

表3 結(jié)核病患者與健康人群NAT2基因型分布情況

2.2 NAT2基因代謝速度分型 本次實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到 NAT2*4/4、NAT2*4/5A、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6 、NAT2*4/7 、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6、NAT2*6/7、NAT2*7/7 11種基因型,根據(jù)基因表型的代謝速度將其分為快型(NAT 2*4/4)、中間型(NAT 2*4/5A 、NAT2*4/5B 、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)、慢型(NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6 、NAT2*6/7、NAT2*7/7)3 類 ,分別為23.2%、54.9%、21.9%,以中間型為主,而其中又以NAT2*6等位基因出現(xiàn)頻率最高,頻率分布見(jiàn)表2。

2.3 結(jié)核病患者與健康人群NAT2基因型分布情況比較 和文獻(xiàn)[3-4]比較,我國(guó)漢族結(jié)核病患者與健康人群間的代謝速度分型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.93,P ＜0.01)(表3)。由此說(shuō)明：我國(guó)漢族結(jié)核病患者與健康人群具有不同的NAT2基因型特征。

3 討論

人類N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(NATs)在體內(nèi)催化多種藥物和致癌物質(zhì)的代謝,廣泛分布于胃、小腸、結(jié)腸和肝臟,因編碼基因不同而將其分為 NAT1和NAT2 2個(gè)亞類。其中NAT2的基因多態(tài)性與某些藥物的臨床療效和不良反應(yīng)的個(gè)體差異以及一些疾病的遺傳易感性相關(guān)[5],研究不同人群或個(gè)體的NAT2多態(tài)性具有非常重要的意義。

NAT2基因位于人類第8對(duì)染色體的短臂2區(qū)2帶(8p22)上,目前已發(fā)現(xiàn)有26種等位基因[6],常見(jiàn)的等位基因突變主要發(fā)生在191、282、341、481、590、803、857 7 個(gè)位點(diǎn),其中亞洲人以 481(M1)、590(M2)、857(M3)和191(M4)等位點(diǎn)的基因突變?yōu)槌Ｒ?jiàn)。多態(tài)性的NAT2等位基因構(gòu)成了多態(tài)性的NAT2基因型,根據(jù)乙?；x能力的不同,NAT2基因表型可分為：快速乙酰化型、中間型、慢乙?；??？煲阴；褪且吧兒献有?NAT2*4/4),中間型是野生型和突變型的雜合子型(NAT 2*4/5,NAT2*4/6,NAT2*4/7),而慢乙?；褪侵讣兒贤蛔冃?含有NAT2*5,NAT2*6,NAT2*7任意2或3個(gè)等位基因)。

NAT2基因的多態(tài)性具有顯著的種族和地區(qū)差異,其等位基因突變的發(fā)生導(dǎo)致酶活性下降、穩(wěn)定性降低及表達(dá)量減少使得乙酰化代謝能力受損,造成個(gè)體對(duì)疾病易感性的差異。國(guó)外已有報(bào)道研究NAT2基因多態(tài)性分布與結(jié)核病的遺傳易感性之間的關(guān)系[1-2]：在俄羅斯本土人群中,NAT2的基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān),以NAT2*5/5基因型在結(jié)核病人中的出現(xiàn)頻率顯著高于健康對(duì)照人群;Adams等[2]研究則顯示,南非人群中NAT2快型基因型占有很高比例,可能與南非人群結(jié)核病易感性有關(guān)。本次研究對(duì)155例結(jié)核病患者的外周血淋巴細(xì)胞NAT2基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)到NAT2*4/4 、NAT 2*4/5A 、NAT 2*4/5B 、NAT 2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7 、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7 、NAT2*6/6 、NAT2*6/7 、NAT2*7/7共11種基因型,各基因型頻率分別為：23.2%、1.3%、3.2%、1.9%、34.8%、13.6%、1.9%、4.5%、5.8%、9.0%、0.6%。其中,中間型(NAT2*4/5A 、NAT2*4/5B 、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)所占比例最大,為54.9%;快速乙?；汀⒙僖阴；头謩e為23.2%,21.9%,說(shuō)明我國(guó)結(jié)核病患者NAT2基因表型以中間型最為常見(jiàn)。NAT2各等位基因分布頻率為：NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%),以NAT2*4出現(xiàn)頻率最高,其次為 NAT2*6和 NAT2*7、NAT2*5A 、NAT2*5B、NAT2*5C則出現(xiàn)較少,未檢測(cè)到NAT2*14型基因突變,我們也注意到在慢速乙?；突虮硇椭?NAT2*6等位基因出現(xiàn)頻率最高。同時(shí)我們也將結(jié)核病患者NAT2基因型分布頻率與文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]我國(guó)其他地區(qū)健康人群NAT2基因型分布頻率做比較,2者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.93,P＜0.01),提示我們NAT2基因型分布可能與我國(guó)漢族人群結(jié)核病易感性相關(guān)。在我們的研究中,中間型出現(xiàn)頻率最高,且顯著高于健康人群,這與國(guó)外的一些報(bào)道結(jié)果不盡相同[1],這可能是由于所在的地域不同,研究人群有所差別所致。

另外,也有文獻(xiàn)報(bào)道其慢乙?；团c抗結(jié)核藥物治療的肝功能損害發(fā)生關(guān)聯(lián)[7]。

綜上所述,本研究為我國(guó)漢族結(jié)核病患者NAT2基因多態(tài)性分布特點(diǎn)提供了可靠數(shù)據(jù),對(duì)研究NAT2基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物肝損害的關(guān)系提供了一定的參考價(jià)值。同時(shí),本研究結(jié)果初步提示NAT2基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān),但對(duì)其作用機(jī)制還不了解,需擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的研究。

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An analysis on N-acetytransferase 2 genetic polymorphisms in 155 Hans Chinese patients with tuberculosis

Li Xinjie1,Wang Y unnan1,Zou Y onghong1,He Gang1,Y in Xiaomao1,Zhang Y anbin1,Su Wenjie2,Liu Zhihui1
(1.Guangzhou Chest Hospital,Guangzhou510095,China;2.Guangzhou Medical College,Guangzhou510180,China)

ObjectiveTo determine the distribution of N-acetyltransferase 2(NAT2)genetic polymorphisms in Chinese Hans TB patients.MethodsT he specific gene sequence of NAT2 from peripheral blood lymphocytes were detected by PCR-DNA sequencing technique and the common sites of single nucleotide polymorphism were analysed.These results were compared with the data of healthy population reported in other articles.ResultsOf 155 Chinese Hans TB patients,the alleles genetic frequencies of NAT2*4,NAT2*5A,NAT2*5B,NAT2*5C,NAT2*6,and NAT2*7 were 50.7%,0.6%,4.8%,1.0%,28.7%and 14.2%respectively.11 genotypes as follow were detected：NAT2*4/4,NAT2*4/5A,NAT2*4/5B,NAT2*4/5C,NAT2*4/6,NAT2*4/7,NAT2*5B/6,NAT2*5B/7,NAT2*6/6,NAT2*6/7 and NAT2*7/7.According to the metabolic phenotype,these genotypes were divided into fast type(NAT2*4/4),interme-diate type(NAT2*4/5A,NAT2*4/5B,NAT2*4/5C,NAT2*4/6,NAT2*4/7)and slow type(NAT2*5B/6,NAT2*5B/7,NAT2*6/6,NAT2*6/7,NAT2*7/7).And their frequencies were 23.2%,54.9%(1.3%,3.2%,1.9%,34.9%,13.6%),and 21.9%(1.9%,4.5%,5.8%,9.0%,0.6%),respectively.There are significant difference in the phenotype distribution between TB patients and healthy population(χ2=11.93,P ＜0.01).ConclusionsThe intermediate type of NAT2 genotype in Chinese Hans TB patients was main form,and NAT2 genotype distribution may be associated with TB susceptibility.

tuberculosis/enzymology;arylamire N-acetyltransferase;polymorphism,genetic;Han nationality

Wang Yunnan(13059192298@wo.com.cn)

王云南(13059192298@wo.com.cn)

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008B030301265)

2011-03-25)

(本文編輯：范永德)