孫艷霞，聶大平

(1. 盤錦市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 盤錦 124010; 2. 大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 大連 116027)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobater baumannii, AB)是一種臨床常見的條件致病菌，在院內(nèi)感染中占有很大比重，廣泛存在于自然界及人體的呼吸道、口腔、黏膜、皮膚等部位，引起菌血癥、肺炎、傷口感染、泌尿系等的重度感染[1]。隨著抗菌藥物的廣泛使用，多藥耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行的趨勢(shì)日益嚴(yán)重，尤其在重癥監(jiān)護(hù)病房[2]及燒傷病房[3-4]，給臨床治療帶來極大困難。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制是多方面的，如β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，藥物流出泵的形成，外膜蛋白的改變，整合子的作用等，其中對(duì)亞胺培南的耐藥主要是由于產(chǎn)生了碳青霉烯酶。OXA-23，OXA-24，OXA-51，OXA-58基因在臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌中較常見，而其表達(dá)依賴于OXA基因上游的插入序列1(ISAba1)提供強(qiáng)啟動(dòng)子[5]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)臨床110株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因的研究及探討ISAba1對(duì)OXA-23表達(dá)的影響，了解其耐藥機(jī)制，期待其能在臨床治療及控制耐藥株的產(chǎn)生和擴(kuò)散等方面提供有力依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床菌株

110株鮑曼不動(dòng)桿菌(其中對(duì)亞胺培南敏感株為13株，耐藥株為97株)于2008年7月-2010年3月分離自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院及大連市第三人民醫(yī)院住院患者，無重復(fù)株。常規(guī)鑒定菌種，紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株及抗菌藥物

質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853；轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞為大腸埃希菌TOP10(購(gòu)自天根生化公司) 。

抗菌藥物：藥敏紙片購(gòu)自O(shè)XOID公司，亞胺培南/西司他丁(IMP)購(gòu)自美國(guó)默克公司。

1.3 主要分子生物學(xué)試劑

2×Taq PCR Master Mix，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒，pGM-T克隆試劑盒均購(gòu)自天根生化公司；250 bp DNA Ladder Marker，溴乙錠(EB)，MH瓊脂，瓊脂糖均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；PCR引物[1]合成，測(cè)序均由大連寶生物工程有限公司完成。本實(shí)驗(yàn)中所用引物見表1。

1.4 耐藥基因檢測(cè)方法

1.4.1 模板DNA的制備: 模板煮沸法制備PCR擴(kuò)增模板：將在M-H平板上培養(yǎng)過夜的細(xì)菌菌落混懸于2 mL的8.5 g/L的NaCl中，使成5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬?3000 r/min離心2 min，沉淀重懸于200 μL無菌重蒸餾水，并置K10CD干式恒溫器煮10 min。13000 r/min離心10 min，取上清液保存于-20 ℃?zhèn)溆肹1]。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 (采用25 μL體系): 多重PCR檢測(cè)OXA基因(blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、 blaOXA-58-like)：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s,54 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。

同源性分析(腸桿菌科基因組內(nèi)重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)ERIC-PCR)：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性60 s,58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。

ISAba1-OXA-23、ISAba1-OXA-51、OXA-23、OXA-51基因完整序列的擴(kuò)增：取非同源性鮑曼不動(dòng)桿菌以ISAba1上游引物和OXA-23、OXA-51下游引物分別擴(kuò)增ISAba1-OXA-23 、ISAba1-OXA-51，同時(shí)取OXA-23、OXA-51上下游引物擴(kuò)增OXA-23,OXA-51。94℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性50 s,52 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳: PCR產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V，30 min，Marker為250 bp DNA Ladder Marker，凝膠置300 nm紫外燈下觀察結(jié)果，并進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.4.4 PCR產(chǎn)物純化: 用天根生化公司普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒，按說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。

1.4.5 基因序列: OXA-23，OXA-51，OXA-58，ISAba1-OXA-23完整序列測(cè)定由大連寶生物工程有限公司完成，并與GENBANK注冊(cè)的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 PCR擴(kuò)增引物

1.5 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

1.5.1 PCR產(chǎn)物連接: PCR產(chǎn)物OXA-23及ISAba1-OXA-23使用pGM-T連接試劑盒按照產(chǎn)品說明書連接。

1.5.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化: 連接后質(zhì)粒使用pGM-T轉(zhuǎn)化試劑盒按照產(chǎn)品說明書轉(zhuǎn)化。

1.6 亞胺培南/西司他丁對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的MIC測(cè)定

亞胺培南(西司他丁)對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株及轉(zhuǎn)化子采用瓊脂對(duì)比稀釋法測(cè)定其MIC，對(duì)照CLSI規(guī)定的MIC標(biāo)準(zhǔn)判定耐藥、中介、敏感。

2 結(jié) 果

2.1 多重PCR檢測(cè)OXA-碳青霉烯酶編碼基因

多重PCR檢測(cè)到OXA-23，OXA-51，OXA-58基因，未檢測(cè)到OXA-24基因。110株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因檢出與對(duì)亞胺培南耐藥的關(guān)系見表2 。

多重PCR電泳結(jié)果見圖1。OXA-碳青霉烯酶基因在鮑曼不動(dòng)桿菌中廣泛存在，以O(shè)XA-23、OXA-51為主，OXA-58較為少見，尚未發(fā)現(xiàn)OXA-24；臨床上同時(shí)攜帶OXA-23和OXA-51兩種基因的鮑曼不動(dòng)桿菌較多見。

表2 110株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因檢出與對(duì)IMP耐藥的關(guān)系

2.2 同源性分析

110株菌株中有18個(gè)克隆株。其中，第2孔道菌株為流行株，110株臨床分離的菌株中有51株為該菌株，占實(shí)驗(yàn)總菌數(shù)的46.36%，并且分離自多個(gè)病區(qū)的多種標(biāo)本，其它菌株散在分布,結(jié)果見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 PCR擴(kuò)增OXA基因完整序列: 選取非同源的臨床實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行OXA基因完整序列擴(kuò)增，得到OXA-23、OXA-51、ISA-OXA-23基因序列，長(zhǎng)度分別為1067 bp、825 bp、2036 bp,未擴(kuò)增出ISA-OXA-51基因序列，選取的12株OXA-23陽性中對(duì)應(yīng)擴(kuò)增出ISA-OXA-23陽性菌株9株，見圖3。

圖1 多重PCR擴(kuò)增OXA基因

圖2 同源性分析

圖3 轉(zhuǎn)化子和對(duì)應(yīng)臨床分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段

2.3.2 耐藥基因序列測(cè)定: 隨機(jī)選取ISAba1-OXA-23，OXA-23，OXA-51實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物由大連寶生物工程有限公司測(cè)序，結(jié)果經(jīng)GenBank網(wǎng)上同源性比較，分別與注冊(cè)號(hào)為GQ861439.1，EF534259.1，GQ914991.1的鮑曼不動(dòng)桿菌一致，一致性分別為100%，100%和100%。

2.3.3 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：分別將轉(zhuǎn)化子OXA-23，ISAba1-OXA-23進(jìn)行相應(yīng)PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物與對(duì)應(yīng)的臨床菌株P(guān)CR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，得到的片段長(zhǎng)度與對(duì)應(yīng)的臨床實(shí)驗(yàn)菌株片段大小一致，見圖3。

2.4 亞胺培南對(duì)臨床菌株及轉(zhuǎn)化子的MIC結(jié)果

臨床實(shí)驗(yàn)菌株OXA-23、ISA-OXA-23 和OXA-51 MIC值分別為256、128、128；TOP10(pGM ISAba1-OXA-23)MIC值為0.5，另一轉(zhuǎn)化子TOP10(pGMOXA-23)MIC值為0.125，TOP10(pGMOXA-51)MIC值為0.25。

3 討 論

多藥耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)作為一個(gè)廣泛流行的臨床問題出現(xiàn)[9]，這種趨勢(shì)與包括鮑曼不動(dòng)桿菌在內(nèi)的院內(nèi)感染的不動(dòng)桿菌屬的流行具有一致性。來自美國(guó)全國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)控系統(tǒng)的數(shù)據(jù)顯示，該國(guó)的重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)內(nèi)與不動(dòng)桿菌屬相關(guān)聯(lián)的肺炎感染率從1983年的3%上升至2003年的7%[10]。耐碳青霉稀類的鮑曼不動(dòng)桿菌于1991年首先在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)，隨后報(bào)道了多起由耐亞胺培南的AB引起的醫(yī)院暴發(fā)流行。近年來，該菌在呼吸道的分離率在30%以上[11]。碳青霉烯酶OXA-23的產(chǎn)生是鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的最常見機(jī)制[12]。在歐洲，其耐藥程度明顯與插入序列ISAba1提供的強(qiáng)啟動(dòng)程序?qū)е绿记嗝瓜┟傅倪^表達(dá)有關(guān)[13]；在歐美地區(qū)，觀察到不同的帶有ISAba1和OXA-23結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)支持這一假說，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物高水平耐藥基因可能是其通過轉(zhuǎn)座子基因介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移從與其共生的生物體獲得。

本研究在110株菌中檢測(cè)到單純OXA-23陽性率為8.18%(9/110)；單純OXA-51陽性率為10.91%(12/110)；OXA-58陽性率為1.82%(2/110)；OXA-23和OXA-51同時(shí)陽性率為75.45%(83/110)；未檢測(cè)到OXA-24。上述菌株對(duì)亞胺培南的耐藥率高達(dá)87.27%，說明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物具有極高的耐藥率。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制主要包括：產(chǎn)生B類、D類β-內(nèi)酰胺酶，外膜蛋白(OMP)的丟失，青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變及外排機(jī)制[14]。為了探討ISAba1對(duì)OXA類酶表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)分別將不帶有ISAba1和帶有ISAba1序列的OXA-23片段轉(zhuǎn)化到大腸埃希氏菌TOP10中，以避免B類、D類β-內(nèi)酰胺酶，外膜蛋白(OMP)的丟失，青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變及外排機(jī)制等因素對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的影響，通過比較兩株轉(zhuǎn)化子對(duì)亞胺培南的最低抑菌濃度的不同來觀察ISAba1對(duì)OXA酶表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，兩者的MIC分別為0.125和0.5，并無明顯差別。而Lin YC等[15]將ISAba1-bla(OXA-23) 和 ISAba1-bla(OXA-66)分別轉(zhuǎn)化到A. baumannii ATCC 15151 (CIP 70.10)中，可導(dǎo)致OXA-23，OXA-66的高表達(dá)。表明在鮑曼不動(dòng)桿菌中 ISAba1為blaOXA-23的表達(dá)提供強(qiáng)啟動(dòng)子。但在大腸埃希菌中，ISAba1的存在并未對(duì)OXA酶的表達(dá)產(chǎn)生影響，這可能是該菌的內(nèi)部環(huán)境不能滿足ISAba1啟動(dòng)OXA-23基因的條件所致。

OXA-51是鮑曼不動(dòng)桿菌的重要標(biāo)志[16]。本文OXA-51陽性為95株，表明86.3%的菌株可確定為鮑曼不動(dòng)桿菌，單純OXA-51耐藥、OXA-23耐藥OXA-58耐藥的情況均有報(bào)道[17]，本實(shí)驗(yàn)中，不含OXA基因、單純OXA-23、OXA-51基因耐藥的臨床菌株分別為1.82%、7.27%、7.27%，未檢測(cè)到單純OXA-58的耐藥菌株。并且在檢測(cè)的12株OXA-23陽性的耐藥菌株中，有9株檢測(cè)到ISAba1基因序列，這些都表明ISAba1對(duì)OXA-23表達(dá)可能起重要作用,同時(shí)也存在其他機(jī)制。

大連地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯耐藥主要原因是產(chǎn)生OXA-23基因。ISAba1位于OXA-23基因的上游,大腸桿菌中單純OXA-23基因和有ISAba1-OXA-23片段未對(duì)OXA酶的表達(dá)產(chǎn)生大的影響。

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