劉忠瑞,邵國喜,徐峰,劉欽毅,呼春

吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科,長春130041

細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展為脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的治療提供了新的手段,其中細(xì)胞移植和基因治療是兩種最有前途的方法。本實驗將殼聚糖納米粒子膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因復(fù)合體(Complex of Chitosan Nanoparticle and Glial Cell Line Derived NeurotrophicFactor,CS-nano/pcDNA3.1/GDNF)轉(zhuǎn)入SCI部位,觀察GDNF的表達(dá)效率及對損傷脊髓的營養(yǎng)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物:健康Wistar大鼠170只,體質(zhì)量 200～ 250 g,雌雄不拘,隨機分為5組:A組(椎板切除+SCI+CS-nano/pcDNA3.1/GDNF,n=40),B組 (椎板切除+SCI+GDNF基因治療,n=40),C組(椎板切除+SCI+殼聚糖納米粒子,n=40),D組為單純損傷組(椎板切除+SCI,n=40),E組為對照組(椎板切除,n=10)。②主要材料:CS-nano/pcDNA3.1/GDNF已制備。

1.2 方法

1.2.1 SCI模型制備與給藥 SCI模型制備應(yīng)用改良 Allen氏垂直重量打擊法(weight-drooping)法。應(yīng)用質(zhì)量為10 g的沖擊棒自10 cm長玻璃管垂直自由下落擊打脊髓背側(cè)圓形墊片,同時對脊髓造成打擊,沖擊棒直徑為3 mm。采用脊髓內(nèi)直接注射法給藥,用微量注射器吸取3～4 μ L混合液,注入A～D組損傷部頭端的脊髓組織內(nèi),分不同方向選 3點注射,緩慢注射,留針 10～15 min。隨后緩慢取出微量注射器,逐層縫合傷口。

1.2.2 石蠟切片制作及HE染色 大鼠SCI后10 h處死,取脊髓組織,置福爾馬林固定液中固定24 h,用自來水沖凈固定液后浸于70%酒精中4℃保存。系列脫水后石蠟包埋,切片厚度4 μ m,常規(guī) HE染色,取受損部脊髓做連續(xù)冰凍切片,片厚20 μ m,染色流程為:蒸餾水洗,Mayer蘇木精2 min,自來水藍(lán)化20 min,蒸餾水洗,1%伊紅15 min,蒸餾水洗,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡下觀察SCI情況。

1.2.3 大鼠脊髓組織的GDNF免疫組織化學(xué)染色 大鼠 SCI后 5、10、20、48 h分別處死大鼠,取脊髓組織,制作石蠟切片,然后進(jìn)行如下操作:①石蠟切片常規(guī)脫蠟,PBS洗5 min×3次,阻斷(0.3%H2O2和甲醇)20 min,PBS洗 5 min×3次;②加正常 10%羊血清封閉20 min,傾去血清后加GDNF抗體,置于濕盒4°C過夜。PBS洗5 min×3次;③滴加生物素標(biāo)記的二抗,37°C孵育30 min,PBS洗5 min×3次;④加鏈霉親合素標(biāo)記的 HRP,37°C孵育 30 min,PBS洗5 min×3次;⑤DAB顯色,室溫 10 min,蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片;⑥光鏡下觀察脊髓染色情況,胞漿顯棕黃色者為陽性染色。

1.2.4 TUNEL檢測脊髓細(xì)胞凋亡 大鼠SCI后 5、10、20、48 h 分別處死大鼠,取脊髓組織,制作石蠟切片,然后進(jìn)行如下操作:①將切片常規(guī)系列酒精下行入水,蛋白酶K液(0.01 mol/L Tris-HCl配置)浸泡(20 ℃)15 min,入0.3%H2O2甲醇中以封閉內(nèi)源性過氧化物酶;②PBS洗后,0.1%TritonX-100的0.1%枸櫞酸鈉液中(4℃)冰浴2 min;③PBS洗后,正常山羊血清封閉10 min,加標(biāo)記液(POD液)37℃反應(yīng)30 min;④PBS洗后二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色 10 min;⑤Mayrow's蘇木精復(fù)染,脫水透明封片,光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行Student't檢驗,結(jié)果以(±s)表示,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 光鏡下可見損傷段有廣泛出血,脊髓結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)神經(jīng)元死亡,白質(zhì)中可見腫脹軸突和大量空泡,見圖1A。

2.2 GDNF免疫組織化學(xué)染色 脊髓內(nèi)GDNF陽性細(xì)胞的細(xì)胞漿呈棕黃色,表達(dá)越高,染色越深。GDNF在E組未見表達(dá),見圖1B。SCI后5 h,A～D組均偶爾表達(dá),見圖1C。SCI后 10 h,B、C、D 組 GDNF陽性細(xì)胞數(shù)增高,但在 A組卻表達(dá)最高,見圖1D。SCI后20 h,B、C、D組GDNF 陽性細(xì)胞數(shù)較10 h略降低,但A組GDNF陽性細(xì)胞數(shù)仍較高,見圖1E。SCI后48 h,A～D組的GDNF陽性細(xì)胞數(shù)均降低,但A組GDNF陽性細(xì)胞數(shù)仍明顯高于B～D組,見圖1F。

圖1 A-F SCI后各組染色 A:HE染色(×400);B:E組免疫組化染色顯示GDNF無表達(dá)(×100);C:SCI后5 h A～D組免疫組化染色顯示GDNF 偶見表達(dá)(×400);D-F:SCI后10、20、48 h A組免疫組化染色顯示GDNF高表達(dá)(×400)

2.3 TUNEL標(biāo)記及計數(shù)結(jié)果 SCI后10 h鏡下可見,TUNEL陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色顆粒,E組偶見細(xì)胞凋亡,B、C、D組均可見較多的細(xì)胞凋亡,A組陽性細(xì)胞數(shù)較B、C、D組明顯減少,見圖2A-C、表1。

3 討論

3.1 基因治療與SCI SCI后,由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在很多抑制神經(jīng)生長的因素,導(dǎo)致神經(jīng)元壞死、凋亡增加,軸突生長緩慢,中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境缺乏神經(jīng)生長因子,又有許多抑制因子存在,使SCI的恢復(fù)十分困難。細(xì)胞移植和基因治療能使基因在損傷局部持續(xù)表達(dá),并能替代局部受損的脊髓組織。Ohori等[2]將神經(jīng)營養(yǎng)因子與綠色熒光蛋白的基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)能表達(dá)多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)干細(xì)胞能更好地擴增,并能向神經(jīng)元與少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Tobias等[3]用基因修飾的成纖維細(xì)胞移植到大鼠的脊髓半橫斷區(qū),通過示蹤技術(shù)觀察到它能明顯促進(jìn)紅核脊髓束軸突的再生,肢體運動功能也明顯改善。吳軍等[4]觀察神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞移植對急性大鼠SCI的作用,發(fā)現(xiàn)移植轉(zhuǎn)染后的嗅鞘細(xì)胞能在體內(nèi)長期存活,表達(dá)NT-3基因,與對照組比較能更好地促進(jìn)SCI區(qū)軸突的再生和后肢功能的恢復(fù)。

3.2 GDNF在SCI中的保護(hù)與營養(yǎng)作用GDNF是運動神經(jīng)元(motor neuron,MN)最強有力的營養(yǎng)因子之一。在體外和體內(nèi)的試驗中,GDNF都能提高胚胎MN的存活及分化,減少MN的凋亡,具有明顯的營養(yǎng)作用。Iannotti等[5]制造大鼠脊髓挫傷模型后灌注GDNF,發(fā)現(xiàn)34%～42%的受損脊髓功能可以恢復(fù),10%～13%的白質(zhì)恢復(fù),可以提高損傷部位遠(yuǎn)近端神經(jīng)元的數(shù)量,這些神經(jīng)元的軸突還可通過受損的脊髓界面支配下段的脊髓。Zhou等[6]觀察大鼠 SCI模型中應(yīng)用GDNF的最佳時間窗,發(fā)現(xiàn)在傷后2周應(yīng)用GDNF能明顯提高M(jìn)N存活,減少凋亡,增加感覺恢復(fù)區(qū)域,并能上調(diào)一氧化氮合酶,而在4周與6周應(yīng)用時,GDNF很難發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。GDNF家族對調(diào)節(jié)運動神經(jīng)軸突的生長和發(fā)出分枝發(fā)揮重要作用,體外試驗發(fā)現(xiàn)GDNF可明顯提高運動軸突的生長能力[7]。Tang等[8]報道在電燒傷大鼠SCI模型應(yīng)用腺病毒重組GDNF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入損傷部位,傷后2～3周發(fā)現(xiàn)基因移植組運動學(xué)評分較對照組明顯提高,認(rèn)為GDNF基因移植能保護(hù)神經(jīng)元并能促進(jìn)M N功能恢復(fù)。本實驗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與GDNF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),表明GDNF具有明顯的神經(jīng)元保護(hù)功能。

圖2 A-C SCI后10 h各組TUNEL染色 A:E組偶見陽性細(xì)胞;B:B、C、D組可見較多陽性細(xì)胞;C:A組可見較少陽性細(xì)胞

表1 各時間點每張切片TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)(個,±s)

表1 各時間點每張切片TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)(個,±s)

與E組比較,①P＜0.01;與D組比較,②P＜0.01

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3.3 殼聚糖納米粒子作為基因載體的研究

研究表明,利用納米技術(shù),如利用金納米微粒結(jié)合雜交DNA片段,很容易進(jìn)入機體細(xì)胞核并與核內(nèi)染色體組合,具有較高的特異性[9]。在基因治療中,質(zhì)粒DNA插入目的細(xì)胞的基因組后,可修復(fù)遺傳錯誤或產(chǎn)生治療因子(如多肽、蛋白質(zhì)、抗原、抗體等)。將質(zhì)粒DNA濃縮成納米微粒并帶上負(fù)電荷,將更容易進(jìn)入細(xì)胞核主動靶向作用于腫瘤細(xì)胞。殼聚糖納米粒子作為載體,能夠攜帶基因?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移,并具有明顯的靶向性作用。Chandy等[9]制備殼聚糖包衣的PLA/PLGA微球,用于5-氟尿嘧啶的腦膠質(zhì)瘤的靶向治療,發(fā)現(xiàn)藥物初次突釋后呈典型的二相釋藥,可靶向治療腦膠質(zhì)瘤,且穩(wěn)定釋放≥30 d。本實驗中,A組脊髓組織GDNF明顯表達(dá),并對脊髓呈現(xiàn)明顯的保護(hù)作用,而單純應(yīng)用質(zhì)?；蛑委熡捎跊]有殼聚糖載體的協(xié)助,不能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)GDNF,對SCI無明顯保護(hù)作用。本實驗還表明單純應(yīng)用質(zhì)粒基因組與單純損傷組的細(xì)胞凋亡和GDNF表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。

如何選擇合適的基因載體,如何充分利用納米粒子的特性,提高其穿梭效率,使目的基因在受體中高效持續(xù)表達(dá),是納米粒子基因載體研究的重要任務(wù)。

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