大鼠肝臟缺血再灌注損傷后水通道蛋白4表達(dá)的變化

燕少偉， 王立明， 張日新， 王海波

(1包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010;2大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連 116000)

缺血再灌注損傷(ischemia－reperfusion injury，IRI)，是指發(fā)生缺血的組織器官，當(dāng)恢復(fù)血液灌注后缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。肝臟作為高灌注器官，非常容易發(fā)生IRI，IRI是造成肝移植術(shù)后移植肝臟原發(fā)失功、移植失敗及慢性排斥反應(yīng)的主要原因之一，其發(fā)生率可高達(dá)88%［1］。因此，肝缺血再灌注損傷時的病理生理變化一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。

水通道蛋白(aquaporins，AQP)是90年代新近發(fā)現(xiàn)的屬于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白中的一個家族，擁有13(AQP0－12)個成員，可以提供液體快速跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通路，同時也參與甘油等小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)［2，3］。AQP介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)具有速度快、不受膜脂質(zhì)流動性及溫度的影響等特點(diǎn)，因此推測AQP可能參與體液容量調(diào)節(jié)，但其具體的生理作用還不十分清楚。雖然有許多學(xué)者對AQP家族已進(jìn)行了一些研究，但多在生理?xiàng)l件下，對在病理?xiàng)l件下如肝臟發(fā)生缺血再灌注損傷時AQP變化的研究甚少。

AQP所有成員之間的基因序列具有一定的同源性。AQP4的基因定位在人染色體18q11.2與q12.1之間的連接處，由4個分別編碼127、55、27、92位氨基酸的外顯子組成，并被0.8、0.3和5.2 kb的內(nèi)含子分隔開。AQP4的一級結(jié)構(gòu)同其它AQP一樣，為跨細(xì)胞膜6次的單肽鏈，其氨基和羥基末端均位于細(xì)胞內(nèi)，含3個胞外環(huán)(A、C、E)和2個胞內(nèi)環(huán)(B、D)。AQP4整個分子前后兩部分在序列上相似，呈180°定位的正面對稱結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其它AQP同源性最高的是位于B環(huán)與E環(huán)上的冬酰氨－脯氨酸－丙氨酸(NPA)基序，NPA基序重疊位于脂質(zhì)雙分子層之間，產(chǎn)生一個使水分子單線通過的通道，可使水分子順滲透壓梯度雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，這是AQP家族成員共有的特征性結(jié)構(gòu)。AQP4的四級結(jié)構(gòu)是由具有活性、分子量約34 kD亞單位組成的四聚體。四聚體在膜上的組裝是維持AQP的穩(wěn)定和其正常功能所必須的。AQP4有3個mRNA亞型，由N端外顯子的差異所決定。它們分別是AQP41M1、AQP41M23和AQP41M23X。AQP41M1編碼的蛋白為M1，AQP41M23和 AQP41M23X編碼的蛋白為M23。M1比M23在N端多22個氨基酸。亞型的表達(dá)存在組織和年齡的差異。AQP4 C端第276－280位的5個氨基酸對于AQP4在細(xì)胞膜上的固定起著不可替代的作用，它們突變或缺失將導(dǎo)致AQP4不能固定于細(xì)胞膜上，影響生物學(xué)效應(yīng)。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)AQP4能夠維持膽管細(xì)胞頂膜區(qū)和基側(cè)膜區(qū)之間水通透性的平衡，其主要調(diào)控基側(cè)膜水的通透性，負(fù)擔(dān)15%水的轉(zhuǎn)運(yùn)［4］，調(diào)節(jié)水在基底面和側(cè)面的擴(kuò)散［4－6］。

肝臟IRI后常發(fā)生淤膽等多種膽道并發(fā)癥，可能與IRI后膽汁的分泌變化有關(guān)，但其分子機(jī)制目前尚不清楚。AQP4在肝臟內(nèi)只表達(dá)于肝內(nèi)膽管細(xì)胞，便于對其進(jìn)行單獨(dú)研究。膽汁主要由肝細(xì)胞分泌，并由膽管內(nèi)皮細(xì)胞和膽囊內(nèi)膜細(xì)胞通過吸收和排泌改變其成分，其中包括維持滲透壓的溶質(zhì)，如膽鹽和谷光苷肽，形成可能造成水的被動轉(zhuǎn)運(yùn)的滲透壓梯度。在這一過程中，膽管細(xì)胞起著重要的作用，膽管細(xì)胞雖然只占肝臟細(xì)胞總數(shù)的3－5%，但產(chǎn)生的膽汁量約占總膽汁量的 40%，通過排泌 Na+、Cl－和HCO3－等離子，同樣形成滲透壓梯度。其功能改變可能導(dǎo)致一系列病理生理變化，如肝移植后膽道并發(fā)癥等。膽汁的生成與流動是靠膽鹽的主動排泌所導(dǎo)致的滲透壓梯度使水在AQP的易化作用下向膽管內(nèi)移動而實(shí)現(xiàn)的［7］，因此AQP在肝臟膽汁分泌過程中起重要作用。而膽鹽通過肝腸循環(huán)重新回到肝臟，參與形成維持膽汁分泌的滲透壓梯度。

目前多項(xiàng)研究表明缺血再灌注損傷與水通道蛋白間存在密切關(guān)系［8，9］。本研究通過將大鼠肝蒂夾閉30 min后恢復(fù)血液灌注的方法建立肝缺血再灌注模型［10］，觀察一定時段AQP4在肝臟的表達(dá)變化情況，及在該病理?xiàng)l件下的表達(dá)變化與肝臟功能變化的關(guān)系，從新的角度探討肝缺血再灌注損傷的病理生理變化，并為其防治提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物及分組 選用48只健康6周齡雄性Wistar大鼠，體重(235±15)g，由大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動物按窩別和體重配成對子，隨機(jī)分配到缺血再灌注組及對照組2 h、1、3、7 d組，每小組6只。

1.2 主要試劑 多聚賴氨酸、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液、Trizol均購于北京中杉金橋公司;RTPCR試劑盒6×buffer、上樣緩沖液、DNA marker均購于大連寶生物公司;AQP4抗體購于武漢博士德公司。主要試劑的配制:10×TBE電泳緩沖液:三羥甲基氨基甲烷［tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris］108 g，硼酸(boric acid)55 g，0.5 mol/L 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)(pH8.0)40 mL，加三蒸水(ddd－H2O)溶解至 1000 mL，用時10倍稀釋。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS):NaCl 8.0 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4·H2O 1.56 g，KH2PO40.20 g，用 ddd－H2O 溶解并定容至1000 mL，調(diào)pH至7.2，高壓滅菌。二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理的 ddd－H2O:取1 mL DEPC加入999 mL ddd－H2O中，充分振蕩，常溫存放24 h后高壓蒸汽滅菌10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 肝缺血再灌注損傷模型的建立 動物術(shù)前均自由進(jìn)食、水。麻醉方法:實(shí)驗(yàn)大鼠應(yīng)用10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射麻醉。缺血再灌注組建立全肝缺血30 min再灌注損傷模型。大鼠麻醉成功后腹部備皮，取仰臥位，熱墊保持體溫在(36.5±0.5)℃，應(yīng)用0.5%碘伏溶液常規(guī)消毒皮膚，鋪無菌孔巾，取腹部正中切口，上至劍突，下至恥骨上，逐層切開皮膚、腹白線及壁層腹膜，進(jìn)入腹腔后小心游離肝門，用無損傷動脈夾夾閉肝蒂，阻斷出入肝臟血流(在此過程中濕鹽水紗布覆蓋切口，減少腹腔的不顯性失水)，30 min后重新恢復(fù)肝臟血液灌注。當(dāng)松開動脈夾后肝臟在2－5 min內(nèi)顏色由暗紅轉(zhuǎn)為鮮紅表明缺血再灌注損傷模型建立成功，關(guān)腹。若超過5 min肝臟顏色仍然未轉(zhuǎn)為鮮紅色則認(rèn)為肝臟有血栓形成，排除出實(shí)驗(yàn)。對照組將經(jīng)過相同的手術(shù)操作，但僅不夾閉肝蒂，30 min后關(guān)腹。實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉清醒后自由進(jìn)食、水，不給予抗生素。

2.2 標(biāo)本采集 分別于再灌注2 h、1、3、7 d處死大鼠，留取標(biāo)本。經(jīng)腹主動脈取血6－8 mL靜置15 min后離心留取血清－26℃保存?zhèn)溆?，以行間接膽紅素(indirect bilirubin，IB)、直接膽紅素(direct bilirubin，DB)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)檢測。取血后迅速以4℃的PBS液10 mL經(jīng)門靜脈灌注至肝臟，摘除大鼠肝臟，每例標(biāo)本平分為兩份，一份用10%PBS甲醛液固定以行病理及免疫組化檢測，另一份于液氮冷凍1 h后轉(zhuǎn)入－80℃保存以行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT－PCR)檢測。每只大鼠相應(yīng)檢測標(biāo)本取材部位保持一致。

2.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測 (1)血清IB、DB及ALT的檢測:用Olympus AU2000全自動生化分析儀檢測。(2)肝組織病理學(xué)檢測:經(jīng)10%PBS甲醛溶液固定的肝組織標(biāo)本行石蠟包埋，切片厚度為5 μm。經(jīng)梯度乙醇脫水及二甲苯置換后行HE染色，觀察組織形態(tài)學(xué)變化。(3)AQP4的免疫組化檢測:肝臟蠟塊標(biāo)本切片厚度為5 μm，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇處理至水后，滴加0.3%過氧化氫室溫(溫度20℃，濕度80%)孵育10 min，以除去內(nèi)源性過氧化物酶，PBS水洗3 min×3次;在0.1 mol/L枸櫞酸鈉液中高壓鍋(2 atm)抗原修復(fù)10 min，室溫自然冷卻后PBS洗3 min×3次;正常非免疫動物血清封閉10 min;滴加AQP4Ⅰ抗(兔抗鼠多克隆抗體，PBS稀釋 AQP41∶100)4℃孵育過夜，PBS洗3 min×3次;滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗(羊抗兔IgG抗體)室溫孵育15 min，PBS洗3 min×3次;滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化酶室溫孵育15 min，PBS洗3 min×3次后行DAB顯色1 min。在10×10倍光鏡下以每張切片胞膜上呈清晰黃褐色顆粒表達(dá)為陽性表達(dá)。隨機(jī)選取互不重疊的視野5個，10×40倍視野下對陽性表達(dá)區(qū)域，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描，檢測每個視野內(nèi)平均吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計分析。(4)RT－PCR檢測肝組織AQP4 mRNA的表達(dá):應(yīng)用Trizol試劑常規(guī)一步法提取肝組織標(biāo)本總RNA。以隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:取2 μL RNA加入隨機(jī)引物1 μL 70℃水浴5 min，冰水驟冷，隨后加入5×PCR緩沖液4 μL，20 mmol/L dNTP 1 μL，RNasin 0.4 μL，蒸餾水3.4 μL，M － MLV 0.2 μL，總反應(yīng)體積為 20 μL;反應(yīng)條件:37℃ 60 min，90℃ 5 min。引物序列為:上游引物5'－GCATGAATCCAGCTCGATCCTTTGG －3'，下游引物5'－AATGGGTGGCAGGAAATCTGAGGC －3'，擴(kuò)增片段長度407 bp。β－actin引物序列為:上游引物5’－ GATATCGCTGCGCTCGTCGTC －3'，下游引物5’－ CATGAGGTAGTCTGTCAGGTC －3’，擴(kuò)增片段長度560 bp。PCR反應(yīng)體系為:1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 ×PCR 緩沖液2 μL，20 mmol/L dNTP 1 μL，Taq 酶0.1 μL，引物1 μL，余量以蒸餾水補(bǔ)足體積至20 μL，PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件:95℃ 1.5 min，55℃ 2 min，72℃ 1 min，40個循環(huán)，最后72℃ 8 min。反應(yīng)產(chǎn)物10 μL加于1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，取出凝膠，紫外度值，以目標(biāo)條帶灰度和β－actin灰度的比值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

配對樣本在透視分光儀下觀察結(jié)果并攝片，用β－actin校正半定量，凝膠圖像分析系統(tǒng)測定各電泳帶灰度值兩兩比較采用配對t檢驗(yàn)。均采用 SPSS for Windows 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

結(jié) 果

1 模型建立情況

所有實(shí)驗(yàn)大鼠除2 h處死組外均于術(shù)后4 h內(nèi)清醒，自由進(jìn)食、水。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均無腹腔感染，無死亡發(fā)生。

2 肝功能檢測

各對照組間血清DB差異無顯著(P＞0.05)，缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術(shù)后血清DB較對照組明顯升高(P＜0.05)，術(shù)后第1 d最高［(11.80±1.07)μmol/L缺血再灌注組 vs(5.01±0.53)μmol/L對照組］，P＜0.05，以后逐漸減少，于術(shù)后第7 d恢復(fù)正常［(5.53±0.41)μmol/L缺血再灌注組 vs(5.13±0.27)μmol/L對照組］。各對照組間血清IB差異無顯著(P＞0.05)，缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術(shù)后血清IB較對照組明顯升高(P＜0.05)，術(shù)后第1 d最高［(20.71±1.46)μmol/L缺血再灌注組vs(7.62±0.98)μmol/L對照組］，以后逐漸減少，于術(shù)后第7 d恢復(fù)正常［(7.86±1.23)μmol/L缺血再灌注組 vs(6.53±0.87)μmol/L對照組］。各對照組間血清ALT差異無顯著(P＞0.05)，缺血再灌注2 h、1 d、3 d組大鼠術(shù)后血清ALT較對照組明顯升高(P＜0.05)，術(shù)后第1d最高［(55.75±3.31)U/L缺血再灌注組 vs(33.46±2.06)U/L對照組］，以后逐漸減少，于術(shù)后第 7d恢復(fù)正常［(22.32±1.16)U/L缺血再灌注組 vs(21.09±1.13)U/L對照組］，見圖1－3。

Figure 1.Comparison of serum DB level in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖1 缺血再灌注組與對照組大鼠血清DB濃度比較

Figure 2.Comparison of serum IB level in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖2 缺血再灌注組與對照組大鼠血IB濃度比較

3 肝臟病理學(xué)檢測

通過對肝臟組織切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)缺血再灌注組肝臟小葉中央靜脈周圍可見點(diǎn)片狀壞死區(qū)域，見圖4A、B。

4 免疫組化染色結(jié)果

在對照2 h、第1 d、第3 d、第7 d組均可見肝內(nèi)膽管細(xì)胞AQP4表達(dá)陽性(A值分別為4033±316、4136±505、3929±328、3892±277)，各對照組間差異無顯著(P＞0.05);在 IRI各時相組，可見IRI后2 h、第1 d、第3 d AQP4表達(dá)均較對照組顯著下降(A值分別為2836±255、1279±107、2296±217)，與對照組比較均顯著差異(P＜0.05)，見圖5－9。其中以術(shù)后第1 d變化最顯著，以后AQP4的表達(dá)量逐漸增多，到術(shù)后第7 d時IRI組A值與對照組比較，差異無顯著(P＞0.05)，見圖10。

5 RT－PCR結(jié)果

對照組各時點(diǎn)AQP4 mRNA表達(dá)差異無顯著(P＞0.05)。在 IRI各時相組，可見在 IRI后2 h、1 d、3 d AQP4 mRNA表達(dá)較對照組顯著下降(P＜0.05)，IRI后第1 d組AQP4 mRNA表達(dá)下降最明顯，以后逐漸增加，IRI第7 d AQP4 mRNA表達(dá)恢復(fù)正常，見圖11、12。

Figure 3.Comparison of serum ALT activity in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖3 缺血再灌注組與對照組大鼠血ALT活性比較

Figure 4.Pathological changes of rat liver tissues(HE staining，×100).A:ischemia － reperfusion 1 d group.Arrows indicate the degeneration and necrosis of cells.B:sham－operation group.圖4 缺血再灌注組和對照組大鼠肝組織HE染色切片

Figure 5.Immunohistochemical staining of AQP4 in rat liver section(×100)from sham －operation group.Cholangiocytes were stained as arrows indicated.圖5 對照組大鼠肝組織切片AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

Figure 6.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 2 h group.Cholangiocyte staining(arrow －indicated)was obviously reduced.圖6 缺血再灌注2 h組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

Figure 7.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 1 d group.Arrow－indicated cholangiocyte staining was the weakest.圖7 缺血再灌注1 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

Figure 8.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 3 d group.Arrow －indicated cholangiocyte staining restored a little.圖8 缺血再灌注3 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

Figure 9.AQP4 expression examined by immunohistochemical staining in rat liver section(×100)from hepatic ischemia－reperfusion 7 d group.Cholangiocyte staining obviously restored(arrow－indicated).圖9 缺血再灌注7 d組AQP4免疫組化染色蘇木精復(fù)染切片

Figure 10.Comparison of AQP4 expression in liver tissues examined using immunohistochemical staining in rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia － reperfusion injury..n=6.*P＜0.05 vs sham－operation group.圖10 AQP4免疫組化染色強(qiáng)度比較

Figure 11.Comparison of AQP4 mRNA expression examined by RT － PCR in the liver of rats 2 h，1 d，3 d and 7 d after hepatic ischemia－reperfusion injury..n=6.*P ＜0.05 vs sham －operation group.圖11 AQP4 mRNA相對表達(dá)水平比較

Figure 12.Electrophoresis results of RT－PCR product of AQP4 mRNA in ischemia － reperfusion 2 h，1，3，7 d groups(A)and sham －operation group(B).圖12 缺血再灌注組和對照組AQP4 mRNA RT－PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

討 論

1 肝臟缺血再灌注模型問題

目前大鼠肝臟缺血再灌注模型建模方法較多，以夾閉肝蒂30 min和夾閉肝蒂及肝下下腔靜脈20 min的全肝缺血再灌注模型最為普遍，前者具有操作相對簡單及模型大鼠成活率高的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過將模型大鼠肝蒂夾閉30 min后重新使其開放的方法建立肝臟缺血再灌注模型，在大體觀察上可見夾閉肝蒂后肝臟顏色明顯由鮮紅色轉(zhuǎn)為暗紅色，重新開放后又轉(zhuǎn)為鮮紅色;術(shù)后模型組大鼠出現(xiàn)血轉(zhuǎn)胺酶、膽紅素升高等肝功能受損表現(xiàn);肝組織病理切片可見模型組大鼠肝細(xì)胞點(diǎn)片狀變性、壞死。這些變化與國內(nèi)外關(guān)于缺血再灌注時肝臟的病理生理改變的報道相似，故本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的動物模型準(zhǔn)確可靠。缺血再灌注組大鼠雖在夾閉肝蒂時同時夾閉了膽總管，但結(jié)扎膽總管8－24 h后方可造成膽紅素升高［11］，同時經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明單純結(jié)扎膽總管30 min與對照組比較，膽紅素變化無顯著差異(P＞0.05)，故本實(shí)驗(yàn)中IRI組大鼠術(shù)后膽紅素升高不是由膽道阻斷所致。

2 AQP4在肝臟的定位表達(dá)與IRI

大鼠肝細(xì)胞(hepatocytes)主要表達(dá)AQP0、AQP8和 AQP9［12－14］，大鼠肝內(nèi)膽管細(xì)胞(cholangiocytes)所表達(dá)的AQP種類是目前已知的所有細(xì)胞中最多的:AQP0、AQP1、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9和AQP11［15］，其中 AQP1和 AQP4 研究較為深入，包括分子、生化和功能研究。AQP4在肝臟主要存在于肝內(nèi)膽管細(xì)胞基底面和側(cè)面，在這個區(qū)域有高表達(dá)。AQP4只表達(dá)于肝內(nèi)膽管細(xì)胞而在肝細(xì)胞無表達(dá)，便于對其進(jìn)行單獨(dú)研究。研究表明，鼠肝內(nèi)膽管細(xì)胞AQP4過度表達(dá)導(dǎo)致對水的通透性升高。膽汁中98%為水，膽汁分泌與AQP密切相關(guān)［16］。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)可通過蛋白磷酸化的方式調(diào)節(jié)AQP4活性。PKC可在轉(zhuǎn)錄水平對AQP4 mRNA進(jìn)行調(diào)節(jié)。pH值也是影響AQP家族表達(dá)的因素，尤其是當(dāng)pH降到5.5以后，AQP4對乳酸鹽和水表現(xiàn)出特殊的通透性，其他如多巴胺、碳酸酐酶抑制劑及高水平的血小板源生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等也影響著AQP4的分布與表達(dá)。AQP4基因啟動子區(qū)域有一低氧誘導(dǎo)因子結(jié)合基序。低氧可下調(diào)AQP4 mRNA及蛋白的表達(dá)，重新給氧又可使AQP4水平恢復(fù)。溫度、激素、生長因子、視黃酸等因素的變化都會對水通道產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測方法發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管可見棕黃色濃染，證明AQP4表達(dá)在肝內(nèi)膽管細(xì)胞，這與國內(nèi)外其它相關(guān)文獻(xiàn)報道相符。

肝臟是人體最大的消化腺，每天產(chǎn)生800－1000 mL膽汁，因此人們一直關(guān)注AQP在肝臟的分布、表達(dá)和功能。膽汁的生成與流動是靠膽鹽的主動排泌所造成的滲透壓梯度使水在AQP的易化作用下向膽管內(nèi)移動實(shí)現(xiàn)的，而膽鹽通過肝腸循環(huán)重新回到肝臟，參與形成維持膽汁分泌的滲透壓梯度。AQP可以在存在滲透壓的情況下加速水的轉(zhuǎn)運(yùn)，肝內(nèi)膽管管腔和膽管上皮細(xì)胞基底的滲透壓差是持續(xù)存在的，發(fā)生肝內(nèi)膽汁淤積時此滲透壓差可能會更高，此時水的通透量是決定膽汁生成量的主要因素，而水的通透量則取決于AQP的表達(dá)量及功能，本實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)發(fā)生肝臟缺血再灌注損傷時，AQP4表達(dá)下降，可以解釋肝內(nèi)膽管細(xì)胞水通透性降低及肝內(nèi)膽汁淤積。當(dāng)肝臟發(fā)生局部缺血時，缺血的肝組織進(jìn)行無氧代謝使ATP生成減少，肝內(nèi)膽管細(xì)胞中AQP4的數(shù)量和功能可能隨之改變，使水順滲透壓梯度向膽管內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)減少。而通過肝腸循環(huán)的膽鹽排泌保持較為恒定的數(shù)量(與腸道吸收的數(shù)量保持平衡)，造成肝小管內(nèi)膽汁濃度過高，致使功能性淤膽。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝IRI后AQP4及AQP4 mRNA的表達(dá)量較對照組明顯減少，伴隨AQP4表達(dá)減少，大鼠血膽紅素迅速升高;隨著AQP4表達(dá)量的恢復(fù)，大鼠血膽紅素也漸趨正常，AQP4表達(dá)的減少可能是導(dǎo)致IRI后功能性淤膽的重要原因。

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