mRSD－9基因參與細(xì)胞內(nèi)吞功能的初步研究*

李樹春， 王 槐， 王桂萍， 滿序聰

(中央民族大學(xué)，中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

Endophilin 3是一種包含BAR結(jié)構(gòu)域的蛋白，它參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)［1］。我們實(shí)驗(yàn)室以endophilin3的N端保守區(qū)+可變區(qū)(C+V區(qū))為誘餌，應(yīng)用酵母雙雜交的方法從小鼠睪丸cDNA文庫中篩選獲得了一個(gè)編碼結(jié)合蛋白的新基因，命名為mRSD－9。該基因全長為575 bp，開放讀碼框534 bp，編碼一個(gè)含177個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，獲得Gen-Bank接受號(hào)為AY278322。本實(shí)驗(yàn)對(duì)mRSD－9蛋白和endophilin 3的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)該基因功能進(jìn)行初步研究。

材料和方法

1 材料

1.1 菌株 E.coli DH5，用于質(zhì)粒的擴(kuò)增與轉(zhuǎn)化?；蛐?F－φ80dlacZΔM15 recA1 endA1 gyrA96 thi－1 hsdR17(rk－mk+)supE44 relA1 deoRΔ(lacZYA －argF)U169購自天根生化科技有限公司。

1.2 細(xì)胞株 CHO細(xì)胞系是本室保存，293T細(xì)胞系購自ATCC。

1.3 質(zhì)粒載體 pGEM－T載體:用于PCR產(chǎn)物的克隆(Promega);pEGFP－N1:用于基因的真核表達(dá)(BD Biosciences);pDsRed1－N1:用于基因的真核表達(dá)(BD Biosciences);pcDNA6/V5－HisB－FLAG/HA/Myc(Invitrogen):用于基因的真核表達(dá)。

1.4 抗體 Endophilin 3和mRSD－9多抗為本實(shí)驗(yàn)室制備。Flag和Myc單抗、Anti－Flag M2 Agrose購自Sigma。FITC和TRITC標(biāo)記的抗小鼠IgG購自中衫生物技術(shù)公司。

1.5 工具酶及試劑 DL2000 DNA marker、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶Klenow片段、RNase A以及各種限制性內(nèi)切酶均為TaKaRa(大連)有限公司產(chǎn)品。IPTG和 X－gal購自Boehringer－mannheim;丙烯酰胺、N'，N'－ 亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS等均購自Bio－Rad;Tris和尿素等購自Gibco－BRL;各種蛋白酶抑制劑均為Sigma產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM和RPMI－1640購自Gibco－BRL，胎牛血清購自HyClone。胰蛋白酶購自Gibco－BRL。小規(guī)模轉(zhuǎn)染所用Lipofectamine 2000購自Invitrogene。其它各種試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.6 主要儀器及設(shè)備 冷凍高速離心機(jī)(Beckman)、Eppendorf臺(tái)式冷凍離心機(jī)、MilliQ Plus超純水系統(tǒng)(Millipore)、PCR 儀(MJ research Inc.)、蛋白質(zhì)垂直電泳儀(Bio－Rad)、酶標(biāo)儀(Bio－tech Instruments Inc.)、紫外觀測儀及照相系統(tǒng)(UVP Inc.)、熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nikon)、激光共聚焦顯微鏡(LEICA，TCS NT)等。

2 方法

2.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建［2］用PCR擴(kuò)增mRSD－9及endophilin 3 cDNA序列，引物設(shè)計(jì)時(shí)在上、下游引物的5'端分別加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)及HindⅢ和EcoRⅤ酶切位點(diǎn)。引物見表1。首先將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM－T載體上，然后以相應(yīng)的酶進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)瓊脂糖電泳和切膠回收后，連接到經(jīng)過相同酶切的pcDNA6－HisB載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

表1 質(zhì)粒載體構(gòu)建所使用的引物Table 1.The primers of plasmid vectors

2.2 免疫共沉淀［3］磷酸鈣法轉(zhuǎn)染(1)pcDNA6/V5－Flag－endophilin3和pcDNA6/V5－HisB－Myc、(2)pcDNA6/V5－Flag－endophilin3和pcDNA6/V5－Myc－mRSD－9、(3)pcDNA6－HisB－Flag－endophilin3和pcDNA6/V5－HisB－Myc－mRSD－9于HEK 293T細(xì)胞;24 h后收集細(xì)胞制備細(xì)胞裂解液。處理Anti－Flag M2 Affinity Gel，充分混勻立即取40 μL置于新的管中，6000 r/min離心30 s;0.5 mL PBS洗滌樹脂2次。取適量細(xì)胞裂解液(根據(jù)Input結(jié)果確定使用量)加入洗滌好的抗－Flag樹脂中，其間追加1次PMSF，4℃ 振搖8 h，1000 r/min離心30 s棄去上清。隨后用3種洗液各洗1次后，棄上清。加入 30 μL 1.2 ×loading buffer，煮沸8 min，12000 r/min離心2 min后保留上清，－20℃保存?zhèn)溆?進(jìn)行15%和10%SDS－PAGE，然后用小鼠源抗Flag或者myc抗體作為I抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為II抗，ECL顯色。

2.3 轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)［4］Lipofectamine 2000方法瞬轉(zhuǎn)pDsRed1－N1空質(zhì)粒、pDsRed1－N1－mRSD－9及pDsRed1－N1－ΔmRSD－9于HeLa細(xì)胞，6 h換液后正常培養(yǎng)12 h，然后換成無血清培養(yǎng)10h，再換成含25 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白的含血清的DMEM培養(yǎng)15 min，最后用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞，并用冰冷的4%多聚甲醛固定，顯微鏡觀察。

穩(wěn)定表達(dá)pEGFP－N1、pEGFP－N1－ mRSD－9及pEGFP－N1－ΔmRSD－9的CHO細(xì)胞，37℃無血清培養(yǎng)1 h，然后換成含30 mg/L Texas red偶聯(lián)的轉(zhuǎn)鐵蛋白的DMEM 37℃培養(yǎng)1 h。

2.4 ATP/GTP結(jié)合及競爭實(shí)驗(yàn)［5］mRSD－9蛋白和突變mRSD－9蛋白用BCA法測定蛋白濃度，將2種蛋白樣品分別上樣50－70 μg，于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。電泳后立即將膠置于含20%甘油的50 mmol/L Tris－HCl中浸泡洗滌2次，每次15 min。電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，30 V、3.5 h進(jìn)行電泳。用TBS洗3次，每次10 min后在封閉液中4℃封閉過夜或室溫20 min。再用結(jié)合緩沖液洗2遍(每次10 min)后進(jìn)行雜交。最后用結(jié)合緩沖液洗滌3次，每次10 min并進(jìn)行放射性自顯影。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 mRSD－9與endophilin 3相互作用

為了驗(yàn)證二者的相互作用，我們分別構(gòu)建了pcDNA6－HisB－Myc－mRSD－9和pcDNA6－HisB－Flag－endophilin 3的真核表達(dá)質(zhì)粒，并共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，從正反兩個(gè)方向?qū)Χ叩南嗷プ饔眠M(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示過量表達(dá)的Myc－mRSD－9能被Flag－endophilin 3共沉淀，見圖1A。反之，過表達(dá)的Flag－endophilin 3也能被Myc－mRSD－9共沉淀，見圖1B。說明這兩種蛋白能夠在體內(nèi)相互作用。

Figure 1.The interactions mRSD － 9 and endophilin 3.A:co－immunoprecipitation of mRSD －9 with the endophilin 3.293T cells were co－transfected with the plasmids of Flag－endophilin 3 and Myc－mRSD－9.Anti－Flag M2 beads were used to pull down the transfected Flag－endophilin 3.Immunoprecipitates were examined for the presence of Myc－mRSD－9 using anti－Myc antibody.4%of the input is shown.B:anti－Myc antibody was used to pull down the transfected Myc－mRSD －9.The Flag－endophilin 3 in immunoprecipitates was examined by anti－Flag antibody.4%of the input is shown.Hc:heavy chain;Lc:light chain.C:co－localization of mRSD －9 and endophilin 3 visualized by laser confocal microscopy.CHO cells were cultured on glass coverslips and co－transfected with Myc－mRSD－9 and Flag－endophilin 3.Immunostaining was conducted using anti－Myc and anti－Flag as primary antibodies and FITC－conjugated and TRITC－conjugated antibodies as secondary antibodies.As control，CHO cells co－transfected with Myc－mRSD－9 and Flag vector or Flag－endophilin 3 and Myc vector showed no co－localization of the two components.圖1 mRSD－9與endophilin 3相互作用

為了驗(yàn)證mRSD－9蛋白與endophilin 3蛋白在細(xì)胞內(nèi)是否相互作用，利用pEGFP－N1－mRSD－9融合綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)載體、pDsRed1－N1－endophilin 3融合紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察了mRSD－9－GFP融合蛋白與endophilin 3－RFP融合蛋白在CHO細(xì)胞中定位關(guān)系。結(jié)果顯示紅色熒光蛋白(endophilin 3)和綠色熒光蛋白(mRSD－9)在細(xì)胞中呈現(xiàn)完全共定位，見圖1C。

2 mRSD－9促進(jìn)ATP/GTP轉(zhuǎn)化

利用ExPASy－PROSITE網(wǎng)上資源進(jìn)行基序分析，發(fā)現(xiàn)mRSD－9蛋白具有P－loop基序結(jié)構(gòu)，該基序可以參與ATP或GTP轉(zhuǎn)化。采用ExPASy－Prop-Search網(wǎng)上資源對(duì)mRSD－9氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)相似性比較。比對(duì)結(jié)果顯示mRSD－9蛋白與GrpE蛋白相似性最高。將分析結(jié)果用BioEdit生物分析軟件進(jìn)行驗(yàn)證，證明mRSD－9與ATP結(jié)合蛋白GrpE具有最大結(jié)構(gòu)相似性，見圖2A。因此采用［α－32P］－ATP/GTP blot overlay assay方法來研究它與ATP/GTP的結(jié)合。結(jié)果mRSD－9蛋白可以和ATP/GTP結(jié)合，而且它們的結(jié)合能被大于1000倍的高濃度非同位素標(biāo)記ATP/GTP所替代，因此結(jié)合是特異的，而且具有飽和性。為了驗(yàn)證mRSD－9 P－loop基序在ATP/GTP結(jié)合中的關(guān)鍵作用，我們構(gòu)建了P－Loop基序突變的ΔmRSD－9，并進(jìn)行了ΔmRSD－9的ATP/GTP結(jié)合實(shí)驗(yàn)，見圖2B、C，結(jié)果表明P－loop基序是mRSD－9結(jié)合ATP/GTP的關(guān)鍵部分。

Figure 2.mRSD －9 protein is structurally related to GrpE，which serves as an ADP/ATP exchange factor.A:the similarity score between mRSD －9 and GrpE was 0.32.The threshold value of similarity significance is 3.0，so the result indicates a significantly close structural similarity between these two proteins.B:mRSD－9 mutated by PCR－based site－directed mutagenesis.Lysine at position 141 within the conserved region of mRSD －9 P－loop mutated to aspartate，confirmed by sequencing.C:［α －32P］－ATP/GTP blot overlay assay.Lane 1:mRSD －9 incubated with［α －32P］ATP/GTP;Lane 2:mRSD－9 incubated with［α －32P］ATP/GTP and cold ATP/GTP;Lane 3:ΔmRSD －9 incubated with［α －32P］ATP/GTP;Lane 4:ΔmRSD－9 incubated with［α －32P］－ ATP/GTP and cold ATP/GTP.圖2 mRSD－9促進(jìn)ATP/GTP轉(zhuǎn)化

3 mRSD－9蛋白參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞過程

mRSD－9蛋白與GrpE蛋白具有較高結(jié)構(gòu)相似性，GrpE蛋白參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞中網(wǎng)格蛋白的釋放，所以考慮mRSD－9蛋白可能是通過影響內(nèi)吞過程中網(wǎng)格蛋白的釋放而影響了內(nèi)吞過程。

通過轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)可見，在轉(zhuǎn)染空載體組，紅色熒光表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白(綠色熒光)與周圍未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞大致相同，見圖3A。在轉(zhuǎn)染pDsRed1－N1－mRSD－9組，mRSD－9蛋白(紅色熒光)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白(綠色熒光)比周圍未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯減少，見圖3B，說明mRSD－9蛋白抑制了轉(zhuǎn)鐵蛋白的內(nèi)吞。而在轉(zhuǎn)染pDsRed1－N1－ΔmRSD－9組，ΔmRSD－9蛋白(紅色熒光)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白(綠色熒光)比周圍未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯增多，見圖3C，說明mRSD－9蛋白突變后不但對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞不具有抑制作用，還促進(jìn)了內(nèi)吞。

Figure 3.Effect of overexpressed wild type or mutant mRSD－9 on the clathrin－dependent endocytosis.Transferrin uptake by HeLa or CHO cells was examined by confocal microscopy or flow cytometry.A:HeLa cells transfected with the expression plasmids encoding pDSRed－N1 empty vector，pDSRed－N1－ mRSD－9 or pDSRed－N1－ΔmRSD－9 were incubated in serumfree media for 1 h at 37℃.After incubated with 30 mg/L FITC－transferrin for 1 h at 37℃，transferrin uptake was examined by laser confocal microscopy.Bar:20 μm.B:relative intensity of fluorescence.CHO cells stably transfected with pEGFP－N1－mRSD－9 or pEGFP－N1－ΔmRSD－9 were incubated in serum－free media for 1 h at 37℃.Cells were incubated with 30 mg/L Texas red－transferrin for 1 h at 37℃and examined by flow cytometry to determine uptake in 3×104cells..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs EGFP group.圖3 mRSD－9蛋白對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞的影響

討 論

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是一個(gè)多步驟多程序化的過程［6，7］，隨著內(nèi)吞過程的引發(fā)，網(wǎng)格蛋白聚集在膜上受體與配體結(jié)合部位的胞質(zhì)側(cè)而形成斑塊，并使細(xì)胞膜出現(xiàn)輕微的弧度。此后，有外被的膜向胞質(zhì)側(cè)形成一個(gè)寬底凹陷。帶有外被的寬底凹陷進(jìn)一步向內(nèi)凹陷并形成一個(gè)狹窄的頸部，逐漸融合形成一個(gè)獨(dú)立的小泡，在發(fā)動(dòng)蛋白提供動(dòng)力的作用下，小泡從頸部斷開，形成了帶有外被的自由運(yùn)動(dòng)的囊泡，但這個(gè)階段只是短暫的。然后，囊泡的網(wǎng)格蛋白外被在熱休克同源蛋白(heat－shock cognate protein 70，Hsc70)的ATPase作用下發(fā)生解體，釋放的網(wǎng)格蛋白可返回細(xì)胞膜繼續(xù)介導(dǎo)下一輪內(nèi)吞。最后，脫去包被的內(nèi)吞小泡與早期內(nèi)體(early endosome)融合，隨著融合囊泡內(nèi)的pH值降低，受體與配體分離。由此可見，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞是一個(gè)高效而有序的過程［8］。

最初人們認(rèn)為在頸部融合過程中，發(fā)動(dòng)蛋白的GTPase的功能起促進(jìn)作用。但是最近一些研究結(jié)果挑戰(zhàn)了這一說法。因?yàn)榘l(fā)動(dòng)蛋白的GED(GTPase effecter domain)結(jié)構(gòu)域似乎在寡聚反應(yīng)中才會(huì)介導(dǎo)較強(qiáng)的GTPase活性。當(dāng)GED結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變導(dǎo)致聚集激活的GTPase活性被中斷時(shí)，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用反而增強(qiáng)了［9］。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GTPase活性并不是內(nèi)吞作用中的限速步驟。發(fā)動(dòng)蛋白可能是通過作用于下游效應(yīng)因子的GTP結(jié)合狀態(tài)來起作用的。最后一個(gè)階段即是形成一個(gè)帶有外被的自由運(yùn)動(dòng)的囊泡。到目前為止還不能對(duì)脫離細(xì)胞膜后的內(nèi)吞小泡進(jìn)行確切追蹤。因?yàn)閹в型獗坏淖杂蛇\(yùn)動(dòng)的囊泡在刺激突觸后仍然很少見，所以可以推測外被的解聚過程是迅速發(fā)生的。網(wǎng)格蛋白外被的解聚與解聚 ATP酶Hsc70和輔助蛋白 auxilin的功能相關(guān)［10，11］。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在 GTP轉(zhuǎn)換蛋白缺乏小鼠的胞質(zhì)中外被形成比在野生型小鼠胞質(zhì)中更為有效。

在原核生物大腸桿菌中網(wǎng)格蛋白的釋放有賴于DnaK/DnaJ/GrpE分子伴侶系統(tǒng)。DnaJ上有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)結(jié)合內(nèi)吞小泡上的網(wǎng)格蛋白，另一個(gè)結(jié)合DnaK。因此DnaK通過DnaJ與網(wǎng)格蛋白結(jié)合，并在DnaJ的催化下水解ATP為ADP，使網(wǎng)格蛋白從內(nèi)吞小泡上釋放下來。此時(shí)仍與ADP結(jié)合的DnaK對(duì)網(wǎng)格蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)，需要GrpE的核苷酸交換作用，重新結(jié)合ATP后，DnaK才能與網(wǎng)格蛋白分離，完成網(wǎng)格蛋白的釋放［12］。

GrpE核苷酸交換的具體機(jī)制是，GrpE形成同源二聚體，與DnaK的ATPase結(jié)構(gòu)域結(jié)合，通過引起后者的構(gòu)象變化，打開其ATPase結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，釋放 ADP，由于胞漿內(nèi)存在過量的 ATP，所以ATP進(jìn)入DnaK的ATPase結(jié)構(gòu)域，并將GrpE替換下來［13］。

在真核細(xì)胞中，DnaK的同源物是Hsc70，一個(gè)在所有真核細(xì)胞胞漿中表達(dá)的組成性蛋白。DnaJ在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的同源物是GAK，即輔助蛋白2，它也是一個(gè)表達(dá)在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞漿中的蛋白。由此推測GrpE在真核細(xì)胞胞漿中也應(yīng)該有一個(gè)對(duì)應(yīng)物，但目前僅發(fā)現(xiàn)它在線粒體中的同源物，而在胞漿中尚未發(fā)現(xiàn)。Mge1p存在于酵母(Saccharomyces cerevidiae)線粒體中，與GrpE功能相似，在從胞漿向線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，起到核苷酸轉(zhuǎn)換的作用［14］。HMGE是在人線粒體中發(fā)現(xiàn)的GrpE同源蛋白，但是它不但不參與Hsc70系統(tǒng)的核苷酸轉(zhuǎn)換，而且還與DnaJ蛋白(HSJ1b)結(jié)合，抑制其催化 Hsc70的ATP酶作用［15］。

mRSD－9蛋白含有保守的P－loop基序，文獻(xiàn)表明P－loop基序是一個(gè)ATP或GTP結(jié)合區(qū)，參與某一耗能過程，提示mRSD－9蛋白可能通過該模序在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞中發(fā)揮重要作用。為了驗(yàn)證mRSD－9蛋白是否能夠與ATP或GTP結(jié)合，我們同時(shí)表達(dá)了mRSD－9蛋白和P－loop基序點(diǎn)突變的ΔmRSD－9蛋白，利用這兩種蛋白我們進(jìn)行了ATP和GTP結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明mRSD－9蛋白能夠與ATP/GTP可逆性結(jié)合，并且這種結(jié)合是由mRSD－9蛋白的P－loop結(jié)構(gòu)域所介導(dǎo)。據(jù)此，我們通過轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)研究mRSD－9蛋白是否參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞，采用ΔmRSD－9 K141D作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)mRSD－9通過P－loop區(qū)對(duì)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞具有抑制作用，而ΔmRSD－9顯著增加轉(zhuǎn)鐵蛋白的攝入。因?yàn)閑ndophilin3參與了網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞，并且有可能在內(nèi)吞晚期網(wǎng)格蛋白的釋放和早期內(nèi)吞小泡脫離細(xì)胞膜中都起作用。同時(shí)生物信息學(xué)研究也提示mRSD－9蛋白與GrpE蛋白具有較高結(jié)構(gòu)相似性，GrpE蛋白參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞中網(wǎng)格蛋白的釋放，所以考慮mRSD－9蛋白可能是通過影響內(nèi)吞過程中網(wǎng)格蛋白的釋放而影響了內(nèi)吞過程。

當(dāng)然對(duì)這些機(jī)制的探討非常初步，mRSD－9是否通過促進(jìn)網(wǎng)格蛋白復(fù)合體的解體而促進(jìn)CCV的釋放也需要進(jìn)一步的研究。另外，對(duì)mRSD－9其它兩個(gè)結(jié)構(gòu)域－DPY30結(jié)構(gòu)域和Coiled－coil結(jié)構(gòu)域的功能還需要進(jìn)一步探討。

［1］Liu AP，Aguet F，Danuser G，et al.Local clustering of transferrin receptors promotes clathrin－coated pit initiation［J］.J Cell Biol，2010，191(7):1381 －1393.

［2］周 希，黃曉燕，陳長曦，等.Pax－8基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其功能的初步研究［J］.中國病理生理雜志，2011，27(3):430 －436.

［3］虞紅珍，祝 敏，王 豫，等.hHBrk1與WAVE1蛋白相互作用位點(diǎn)的鑒定［J］.中國病理生理雜志，2011，27(3):494－498.

［4］Tanabe K，Torii T，Natsume W，et al.A novel GTPaseactivating protein for ARF6 directly interacts with clathrin and regulates clathrin － dependent endocytosis［J］.Mol Biol Cell，2005，16(4):1617 －1628.

［5］Pearse BM.Coated vesicles from pig brain:purification and biochemical characterization［J］.J Mol Biol，1975，97(1):93－98.

［6］Ungewickell EJ，Hinrichsen L.Endocytosis:clathrin －mediated membrane budding ［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19(4):417－725.

［7］龔小衛(wèi)，魏 潔，李熠生，等.p38 MAPK信號(hào)通路參與受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞的調(diào)控［J］.中國病理生理雜志，2007，23(7):1388 －1391.

［8］Schmid SL.Clathrin－mediated endocytosis:a universe of new questions［J］.Mol Biol Cell，2010，21(22):3818 －3819.

［9］Chappie JS，Acharya S，Leonard M，et al.G domain dimerization controls dynamin's assembly－stimulated GTPase activity［J］.Nature，2010，465(7297):435 －440.

［10］Lu HA，Sun TX，Matsuzaki T，et al.Heat shock protein 70 interacts with aquaporin－2 and regulates its trafficking［J］.J Biol Chem，2007，282(39):28721 －28732.

［11］Sever S，Skoch J，Newmyer S，et al.Physical and functional connection between auxilin and dynamin during endocytosis［J］.EMBO，2006，25(18):4163 －4174.

［12］Pierpaoli EV，Sandmeier E，Baici A，et al.The power stroke of the DnaK/DnaJ/GrpE molecular chaperone system ［J］.J Mol Biol，1997，269(5):757 －768.

［13］Sugimoto S，Higashi C，Saruwatari K，et al.A gram －negative characteristic segment in Escherichia coli DnaK is essential for the ATP－dependent cooperative function with the co － chaperones DnaJ and GrpE［J］.FEBS Lett，2007，581(16):2993 －2999.

［14］Krzewska J，Langer T，Liberek K.Mitochondrial Hsp78，a member of the Clp/Hsp100 family in Saccharomyces cerevisiae，cooperates with Hsp70 in protein refolding［J］.FEBS Lett，2001，489(1):92 －96.

［15］Choglay AA，Chapple JP，Blatch GL，et al.Identification and characterization of a human mitochondrial homologue of the bacterial co － chaperone GrpE［J］.Gene，2001，267(1):125－134.