微管相關(guān)蛋白2、巢蛋白與人胚胎食管肌層發(fā)育的關(guān)系*

張 泳， 劉學(xué)紅

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，浙江 紹興 312000)

胚胎時(shí)期，食管肌層的分化、生長(zhǎng)發(fā)育受到各種基因的調(diào)控，蛋白是基因的表達(dá)產(chǎn)物，相應(yīng)蛋白在組織細(xì)胞的表達(dá)分布規(guī)律能反映基因的活動(dòng)規(guī)律。巢蛋白(nestin)和微管相關(guān)蛋白2(microtubule－associated protein 2，MAP－2)均屬于細(xì)胞骨架蛋白，其表達(dá)分布規(guī)律反映細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)發(fā)育及增殖能力。目前微管相關(guān)蛋白和巢蛋白在動(dòng)物和人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中的分布及病理作用機(jī)制研究較多［1－5］，但關(guān)于它們?cè)谌伺咛ナ彻芗影l(fā)育過程中的表達(dá)、分布規(guī)律及作用機(jī)制，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過研究人胚胎食管肌層生長(zhǎng)發(fā)育過程中微管相關(guān)蛋白和巢蛋白表達(dá)、分布規(guī)律，探討兩者在食管肌層分化、發(fā)育過程中的作用，為先天性食管畸形研究提供形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 胚胎收集與分組

收集發(fā)育正常但因意外原因造成人工流產(chǎn)的人胚胎標(biāo)本16例(每例標(biāo)本均取得產(chǎn)婦本人同意)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)、B超所測(cè)胎兒雙頂徑和人胚胎形態(tài)學(xué)特征等確定胎齡為7－16周。以每4周為1月齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下:第2月齡組5例，第3月齡組6例，第4月齡5例。

2 取材和免疫組織化學(xué)染色程序

從胎尸內(nèi)取出食管標(biāo)本，分別從每例標(biāo)本中切取食管長(zhǎng)約0.4 cm，用4℃生理鹽水沖洗管腔，放入10%中性甲醛水溶液中固定8－12 h后取出，流水沖洗30 min，行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片，片厚4 μm，每個(gè)標(biāo)本取4片，行免疫組織化學(xué)染色(所用試劑MAP－2和nestinⅠ抗(小鼠抗人)及其輔助試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。免疫組化染色采用PV法:即切片常規(guī)脫蠟至水→微波抗原修復(fù)→3%H2O2滅活內(nèi)源性酶→滴加Ⅰ抗(抗體濃度為1∶150)→PV6002→DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5分鐘×3次)→蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對(duì)照，用已知陽性片作陽性對(duì)照。

結(jié) 果

切片經(jīng)染色后，MAP－2和nestin陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈淡黃色、黃色或深黃色，細(xì)胞核不著色。第2月胚齡時(shí)，人胚食管肌層薄，內(nèi)環(huán)肌層僅有2－4層肌細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞排列松散，肌間神經(jīng)叢明顯，內(nèi)有許多細(xì)胞體呈圓形或橢圓形的神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞質(zhì)少。第3月胎齡時(shí)，食管肌層明顯增厚，內(nèi)環(huán)肌層細(xì)胞層數(shù)增多達(dá)5－8層，細(xì)胞間排列仍較松散。肌間神經(jīng)叢增大，神經(jīng)叢內(nèi)細(xì)胞增多。第4月胎齡時(shí)，食管肌層增厚不明顯，但肌細(xì)胞間排列較致密，肌間神經(jīng)叢與第3月相似。

1 Nestin在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層的表達(dá)

第2月齡段，nestin蛋白在肌層肌細(xì)胞處呈廣泛陽性表達(dá)，見圖1A、B;第3月齡段，nestin蛋白在肌層肌細(xì)胞處呈廣泛強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖1C;第4月齡段，nestin蛋白在肌層陽性表達(dá)明顯減弱，大部分肌細(xì)胞呈陰性表達(dá)，見圖1D。第2－4月，nestin蛋白在肌間神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈陽性表達(dá)，隨著胎齡的增大，陽性表達(dá)無明顯變化，見圖1A－D。

Figure 1.At the second to fourth month of gestation，nestin positive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A:×100;B，C，D:×400).A，B:the second month;C:the third month;D:the fourth month.圖1 在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層nestin的陽性表達(dá)情況

2 MAP－2在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層的表達(dá)

第2－4月齡段，MAP－2在人胚胎食管肌層肌細(xì)胞處均呈陰性表達(dá)，而在肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維處呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)強(qiáng)度隨胎齡增大而增強(qiáng)，見圖2 A－D。

Figure 2.At the second to fourth month of gestation，MAP－2 postive expression(↑)in esophageal muscular layer of human embryos(A，C，D:×400，B:×40).A:the second month;B，C:the third month;D:the fourth month.圖2 在第2－4月胎齡人胚胎食管肌層MAP－2的陽性表達(dá)情況

討 論

巢蛋白為第Ⅵ類中間絲蛋白，和細(xì)胞骨架、細(xì)胞信號(hào)、器官發(fā)生、細(xì)胞新陳代謝有關(guān)，并且代表干細(xì)胞增殖、遷移 、分化的特性。它還參與定位和運(yùn)行亞細(xì)胞器，并用來調(diào)節(jié)骨架蛋白等功能多樣的細(xì)胞增殖、生存和分化［6］?，F(xiàn)有研究表明［7－10］，巢蛋白廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物和人的神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、肌組織等多組織、器官。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第2－3月胎齡段的人胚胎食管肌層細(xì)胞內(nèi)呈陽性表達(dá)，第4月齡大部分肌細(xì)胞呈陰性表達(dá)。說明在胚胎發(fā)育的早期階段，食管肌層肌細(xì)胞在第4月齡前尚處于生長(zhǎng)發(fā)育的不成熟期，在大部分肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量合成細(xì)胞骨架成分，促進(jìn)肌細(xì)胞的快速增殖、生長(zhǎng)發(fā)育，向肌細(xì)胞成熟方向發(fā)展，以適應(yīng)胚胎食管隨胎齡增大而增厚的需要。到了第4月齡，食管肌層大部分肌細(xì)胞發(fā)育接近成熟，細(xì)胞骨架成分基本發(fā)育完善，肌細(xì)胞也由活躍的增殖期逐漸轉(zhuǎn)為靜止期，細(xì)胞增殖能力下降，nestin表達(dá)減弱或消失。這與巢蛋白的生物學(xué)特性有關(guān)，即巢蛋白在干細(xì)胞中的表達(dá)通常為一過性，當(dāng)組織分化成熟時(shí)，巢蛋白的表達(dá)即消失。我們的研究結(jié)果與Su等［10］報(bào)道nestin在大鼠食管肌層的表達(dá)基本一致。更有趣的是我們觀察到nestin在第2－4月齡食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)部分神經(jīng)細(xì)胞呈陽性表達(dá)，隨著胎齡的增大，陽性表達(dá)無明顯變化。結(jié)果提示第2－4月齡食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)均存在部分神經(jīng)前體細(xì)胞，這些細(xì)胞在隨胎齡的變化而不斷增殖分化，以彌補(bǔ)在發(fā)育過程中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。這與Park等［11］報(bào)道敲除nestin的小鼠胚胎神經(jīng)管神經(jīng)上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，再生能力明顯下降相一致。結(jié)合我們前期研究結(jié)果，早期食管發(fā)育階段，食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)存在一定數(shù)量神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，說明在早期胚胎食管發(fā)育階段，nestin與食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞的生存和再生相關(guān)。

MAP－2是一種高度保守的蛋白，是微管組裝的啟動(dòng)子，作為細(xì)胞骨架系統(tǒng)重要成分之一，大量地存在于神經(jīng)元的胞體和樹突中，其能促進(jìn)微管形成、誘導(dǎo)微管成束、防止微管解聚，在神經(jīng)元的生長(zhǎng)和發(fā)育、突起的形成和生長(zhǎng)、軸突和樹突的細(xì)胞器運(yùn)輸及傳遞信號(hào)等方面起到重要作用，是神經(jīng)元特異性標(biāo)記物之一。錢軍等［12］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)MAP2的高表達(dá)可能在脊髓損傷后突觸結(jié)構(gòu)的重建及受損神經(jīng)功能代償和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第2－4月齡段，MAP－2在人胚胎食管肌層肌細(xì)胞處均呈陰性表達(dá)，而在肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維處呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)強(qiáng)度隨胎齡增大而增強(qiáng)。結(jié)果提示在第2月齡人胚胎食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)前體細(xì)胞大部分已分化發(fā)育成神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，但它們尚處于發(fā)育早期階段，細(xì)胞比較幼稚，各種細(xì)胞器尚未發(fā)育成熟，細(xì)胞骨架蛋白合成能力有限。隨著胎齡的增大，肌層細(xì)胞層數(shù)增多，肌層增厚，肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞器發(fā)育逐漸完善，細(xì)胞合成微管蛋白能力增強(qiáng)，細(xì)胞增殖活躍，為適應(yīng)食管肌層生長(zhǎng)發(fā)育需要，食管肌間神經(jīng)叢內(nèi)細(xì)胞釋放較多的信號(hào)，調(diào)控遠(yuǎn)離的肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育。

因此，我們認(rèn)為在人胚胎早期生長(zhǎng)發(fā)育過程中，MAP－2和nestin可能參與了調(diào)控食管肌層肌細(xì)胞和神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育。

［1］李俊岑，丁培培，劉姿辰，等.神經(jīng)前體細(xì)胞巢蛋白在大鼠脊髓損傷后的表達(dá)［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(9):833－837.

［2］Zhang P，Li J，Liu Y，et al.Transplanted human embryonic neural stem cells survive，migrate，differentiate and increase endogenous nestin expression in adult rat cortical peri－ infarction zone［J］.Neuropathology，2009，29(4):410－421.

［3］Santilli G，Lamorte G，Carlessi L，et al.Mild hypoxia enhances proliferation and multipotency of human neural stemcells［J］.PLoS One，2010，5(1):e8575.

［4］van Velthoven CT，Kavelaars A，van Bel F，et al.Repeated mesenchymal stem cell treatment after neonatal hypoxia－ischemia has distinct effects on formation and maturation of new neurons and oligodendrocytes leading to restoration of damage，corticospinal motor tract activity，and sensorimotor function［J］.J Neurosci，2010，30(28):9603－9611.

［5］曹麗麗，董 艷，徐婧婧，等.Wortmannin通過抑制癲癇大鼠海馬自噬活性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2010，26(8):1584 －1588.

［6］Zhang M，Song T，Yang L，et al.Nestin and CD133:valuable stem cell－specific markers for determining clinical outcome of glioma patients［J］.J Exp Clin Cancer Res，2008，27(1):85 －91.

［7］Hendrickson ML，Rao AJ，Demerdash ON，et al.Expression of nestin by neural cells in the adult rat and human brain［J］.PLoS One，2011，6(4):e18535.

［8］Yang KM，Yong W，Li AD，et al.Insulin－producing cells are bi－potential and differentiators prior to proliferation in early human development［J］.World J Diabetes，2011，2(4):54 －58.

［9］Parfitt JR，McLean CA，Joseph MG，et al.Granular cell tumours of the gastrointestinal tract:expression of nestin and clinicopathological evaluation of 11 patients［J］.Histopathology，2006，48(4):424 －430.

［10］Su PH，Wang TC，Wong ZR，et al.The expression of nestin delineates skeletalmuscle differentiation in the developing rat esophagus［J］.J Anat，2011，218(3):311 －323.

［11］Park D，Xiang AP，Mao FF，et al.Nestin is required for the proper self－ renewal of neural stem cells［J］.Stem Cells，2010，28(12):2162 －2171.

［12］錢 軍，孫正義，馬延超，等.大鼠脊髓損傷后MAP－2的表達(dá)及與運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的相關(guān)性［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，27(5):489－492.