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      冠狀散囊菌基因組DNA提取方法比較研究

      2011-09-18 04:50:14劉石泉趙運(yùn)林胡治遠(yuǎn)雷存喜
      茶葉 2011年4期
      關(guān)鍵詞:子囊孢子破壁溶菌酶

      劉石泉 趙運(yùn)林 胡治遠(yuǎn) 雷存喜

      (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128;2.湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程系,湖南 益陽 413000;3.黑茶研究所,湖南益陽 413000)

      茯磚茶屬于后發(fā)酵茶,是所有茶類中加工工藝最復(fù)雜、生產(chǎn)加工周期最長、工藝最獨(dú)特的黑茶類產(chǎn)品。在茯磚茶制造中,選用黑毛茶為原料,通過篩分、汽蒸、握堆、稱茶、蒸茶、壓制、包裝、發(fā)花、干燥、檢驗(yàn)等工序制成[1]。其中發(fā)花是茯磚茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序。黑毛茶經(jīng)渥堆、發(fā)酵及發(fā)花工藝產(chǎn)生金黃色的冠突散囊菌(Aspergillus Cristatus(Raper&Fennell)Malloch&Cain,該菌俗稱金花)使茯磚茶內(nèi)質(zhì)金花普茂,獨(dú)具菌花香,湯色紅濃、香氣純正、滋味醇和。一直以來,茯磚茶是作為邊疆少數(shù)名族日常生活中不可或缺的必備品,在邊疆享有“寧可三日無糧,不可一日無茶”的美譽(yù),其奧妙與茯磚茶的品質(zhì)風(fēng)味是不可分割的[2]。歷來邊疆少數(shù)民族通過判斷金花質(zhì)量和數(shù)量來衡量茯磚茶的品質(zhì)優(yōu)劣[3],開發(fā)優(yōu)質(zhì)品牌茯磚茶,發(fā)展壯大茯磚茶產(chǎn)業(yè)、夯實(shí)品牌基礎(chǔ),顯然離不開冠狀散囊菌的分子生物學(xué)如DNA、蛋白質(zhì)等研究。本研究旨在對茯磚茶中的優(yōu)勢菌種——冠狀散囊菌進(jìn)行DNA提取方法的比較研究,為后續(xù)冠狀散囊菌的DNA分子標(biāo)記技術(shù),進(jìn)行群體遺傳研究打下基礎(chǔ)。

      隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用,通過提取DNA來用基因工程技術(shù)改善微生物的目的產(chǎn)量已成為許多科學(xué)工作者正在探索的熱門課題,文獻(xiàn)檢索表明目前已有多種DNA的提取方法,但專門針對冠狀散囊菌DNA的提取方法未檢索到,我們認(rèn)為很有必要參考真菌的 DNA提取方法[5-7],對冠狀散囊菌DNA的提取進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究。因?yàn)楣跔钌⒛揖钦婧思?xì)胞,擁有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)胞壁,難以破壞,所以提取冠狀散囊菌基因組DNA比提取大腸桿菌等細(xì)菌DNA要困難得多。本試驗(yàn)擬通過使用溶菌酶破壁法、纖維素酶破壁法、果膠酶破壁法、CTAB法、SDS法提取冠狀散囊菌菌絲體和子囊孢子的基因組DNA,然后進(jìn)行電泳檢測、ITS序列的PCR擴(kuò)增檢測以及紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度和純度。期望在前人研究方法的基礎(chǔ)上,摸索一套簡便、易行的適于提取冠狀散囊菌總DNA的方法,獲得的總DNA含蛋白質(zhì)少、降解不明顯、產(chǎn)量較高、重復(fù)性好。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 菌株 從2007年益陽茶廠有限公司產(chǎn)金湘益特制禮品茯磚茶,采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng),運(yùn)用平板梯度稀釋法分離獲得的茯磚茶中的優(yōu)勢菌種——冠狀散囊菌。

      1.1.2 儀器 高速臺式冷凍離心機(jī)(Z36HK)、Bio-Rad DNA電泳儀、紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)、DNA擴(kuò)增儀(TC-25/H)、凝膠成像分析系統(tǒng)(Gellabsystem)等。

      1.1.3 主要試劑 溶菌酶、纖維素酶、果膠酶、RNaseA等購置于上海生物工程有限公司;使用的真菌通用引物[8]ITS1(5'– TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') 和 ITS4(5'– TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')由上海生物工程有限公司合成;其他為國產(chǎn)分析純試劑。

      1.1.4 溶液配制 DNA緩沖液:100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10 mmol/L EDTA。

      SDS 裂解液:2%Triton X-100、3%SDS(m/m)、0.5 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、50 mmol/L EDTA、2% β-巰基乙醇(v/v)用前加)。

      CTAB 裂解液:100 mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)、20 mmol/L EDTA(pH 8.0)、1.4 mol/L NaCl。

      0.1mol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 7.4):77.4 mL 0.1 mol/L Na2HPO4、22.6 mL 0.1 mol/L NaH2PO4。

      山梨醇緩沖液:用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)配制1.2 mol/L 山梨醇。

      溶菌酶、纖維素酶、果膠酶緩沖液:用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液分別配制成20 mg/mL酶液后用0.22 μm細(xì)菌濾膜過濾除菌。

      PBS 緩沖液:0.01 mol/L Na2HPO4和 NaH2PO4(pH 7.0)、0.15 mol/L NaCl。

      PDA液體培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮,稱取200 g,切成小塊放入燒杯中,加適量蒸餾水,煮沸1小時,稍冷后用雙層紗布過濾,加入蔗糖20 g,混勻,用量筒定容至1000 mL,趁熱分裝在三角瓶中,在1.1 kg/cm2(121℃)中保持20分鐘滅菌(固體培養(yǎng)基在滅菌前加1%的瓊脂)。

      1.2 冠狀散囊菌基因組DNA提取方法

      1.2.1 溶菌酶破壁法 冠狀散囊菌接種于50 mL PDA液體培養(yǎng)基中,28℃、280 rpm震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)96h,用無菌紗布過濾分開子囊孢子和菌絲體,室溫下10 000 rpm離心5 min收集子囊孢子,自然干燥后分別準(zhǔn)確稱取0.1 g子囊孢子和菌絲體,分別用PBS緩沖液1.5 mL重懸子囊孢子和菌絲體,室溫下10 000 rpm離心5 min收集子囊孢子和菌絲體;用山梨醇溶液100μL重懸,加入5μL 20 mg/mL溶菌酶37℃溫浴過夜(12h);液氮速凍,然后65℃水浴中溶解,反復(fù)3次;向懸浮液中加入150μL 5 mol/L KAc(pH8.9)輕輕混勻,然后12 000 rpm離心10 min;將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中,加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),輕輕顛倒數(shù)次,然后12 000 r/min離心10 min;重復(fù)抽提一次;轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中,加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉溶液,輕輕混勻,-20℃ 放置30 min后12 000 rpm離心10min;除去上清,將沉淀溶解在100μL DNA緩沖液中,加入6 μL RNaseA(10 mg/mL),37℃溫浴30 min,加入1/2 體積的7.5 mol/L NH4Ac(pH7.5)和等體積的異丙醇,-20℃放置30 min后12 000 r/min離心10 min;除去上清,加入500μL 70%乙醇漂洗沉淀2次,12 000 r/min離心5 min;風(fēng)干除去乙醇,用50 μL ddH2O溶解冠狀散囊菌DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.2 纖維素酶破壁法 操作同1.2.1,其中20 mg/mL溶菌酶換成含20 mg/mL纖維素酶溶液。

      1.2.3 果膠酶破壁法 操作同1.2.1,其中20 mg/mL溶菌酶換成含20 mg/mL果膠酶溶液。

      1.2.4 CTAB法 冠狀散囊菌的重懸子囊孢子和菌絲體液制備方法同1.2.1,分別取1.5 mL子囊孢子和菌絲體重懸液,室溫下10 000 r/min離心5 min收集孢子和菌絲體;分別用液氮碾磨破壁。加250 μL CTAB 裂解液混勻,65℃保溫1 h。10 000 r/min離心10 min。取上清,將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),輕輕顛倒數(shù)次,然后12 000 r/min離心10 min;重復(fù)抽提一次;然后轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中,加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉溶液,輕輕混勻,-20℃放置30 min后12 000 rpm離心10 min;除去上清,將沉淀溶解在100μL DNA 緩沖液中,加入 6 μL RNaseA(10 mg/mL),37℃溫浴30 min,加入1/2 體積的 7.5 mol/L NH4Ac(pH 7.5)和等體積的異丙醇,-20℃放置30 min后12 000 r/min離心10min;除去上清,加入500 μL 70%乙醇漂洗沉淀2次,12 000 r/min離心5 min;風(fēng)干除去乙醇,用50μLddH2O溶解冠狀散囊菌DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.5 SDS法 將250 μL CTAB裂解液換成加250 μL SDS 裂解液,其他操作同1.2.4。

      1.3 冠狀散囊菌基因組DNA質(zhì)量檢測

      1.3.1 凝膠電泳檢測 基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,點(diǎn)樣2 μL,80 V恒定電壓40 min,然后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Gellabsystem)拍照。

      1.3.2 純度及濃度檢測 樣品稀釋100倍,終體積500 μL,做3個平行對照,混勻后用紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)測定,分析各種方法所提冠狀散囊菌基因組DNA純度及濃度。A260值代表其濃度,一般OD260/OD280<1.7,表明樣品中蛋白質(zhì)含量過多;OD260/OD280>2.0,表明 RNA含量過多;OD260/OD280為1.8表示純度好。

      1.3.3 ITS的PCR檢測 使用50 μL反應(yīng)體系為:10 × buffer(5 μL)、25 mM DNTP(1 μL)10 μM ITS1(3 μL) 、10 μM ITS4(3 μL)、DNA 模板(2 μL)、5 U/μL TaqE(0.2 μL)、DDH2O(35.8 μL);使用的PCR 程序?yàn)?94℃預(yù)變10 min,94℃ 45 s、55℃ 60 s、72℃ 2 min,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB 染色,點(diǎn)樣2 μL,80 V 恒定電壓 40 min,然后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Gellabsystem)拍照。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測冠狀散囊菌基因組DNA

      從電泳結(jié)果(圖1)可以看出,各種方法所提冠狀散囊菌基因組DNA分子大小基本一致,說明五種方法均能提取該菌株基因組DNA;十條條帶的亮度都是冠狀散囊菌菌絲體作提取材料的要亮,說明用冠狀散囊菌菌絲體作為材料提取的DNA的收獲量明顯優(yōu)于用子囊孢子;用溶菌酶、纖維素酶、果膠酶提取DNA從瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶上很難發(fā)現(xiàn)有明顯差異說明其破壁能力相差不大;用CTAB法提取該菌株基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度最弱,說明該法說明DNA的收獲率較低,而用SDS法提取該電泳條帶亮度最亮,說明該法說明DNA的收獲率最高,是較為理想的DNA提取方法。

      2.2 冠狀散囊菌基因組DNA的濃度、純度比較

      用分光光度計(jì)測定出了各種方法提取的冠狀散囊菌基因組DNA的濃度,通過紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)測定各個DNA的純度和濃度如表1所示,其中溶菌酶破壁法、纖維素酶破壁法、果膠酶破壁法三種酶破壁法,均以菌絲體基因組DNA的得率較高,其中最高的是溶菌酶,達(dá)到了1.57 mg/mL。CTAB法和SDS法同樣以菌絲體基因組DNA的得率較高,SDS法在所有方法中基因組DNA的得率最高,其中以菌絲體為材料的DNA得率達(dá)到了最高1.69 mg/mL。5種方法所提取的DNA都在OD260處有顯著吸收峰。用子囊孢子為材料提取的基因組 DNA,其 OD260/OD280比值都接近1.8,說明它們的純度都較高,去蛋白和去RNA的效果都較好;用菌絲體為材料提取的基因組DNA,其OD260/OD280比值都小于1.8,且比用子囊孢子的對應(yīng)方法都要小,說明有菌絲體作為提取基因組DNA的材料,含有一定殘留的蛋白質(zhì)的量較用子囊孢子的要高。其OD260/OD280比值除纖維素酶法外沒有明顯大于1.8的,說明去RNA的效果都較好。為了不影響后續(xù)試驗(yàn),本研究沒有使用TE緩沖液溶解DNA,而使用了ddH2O。若用TE緩沖液溶解DNA,由于pH值和離子存在會稍微影響光吸收值,其OD260/OD280比值會稍高,更接近標(biāo)準(zhǔn)值 1.8[9]。

      表1 DNA五種不同提取方法純度和濃度檢測結(jié)果Table 1 The concentration and purity of Eurotium cristatum DNAs extracted by five methods

      2.3 冠狀散囊菌基因組DNA的ITS序列PCR檢測結(jié)果

      使用真菌通用引物ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')和ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從凝膠電泳結(jié)果(圖2)可以看出,各種方法所提冠狀散囊菌基因組DNA均能擴(kuò)增出長度為560bp的目的條帶,說明五種方法均能較為完整的提取冠狀散囊菌基因組DNA。

      3 討論

      文獻(xiàn)檢索表明,溶菌酶破壁法、纖維素酶破壁法、果膠酶破壁法、CTAB法、SDS法均有提取真菌基因組的較為成功的先例,只是未應(yīng)用在冠狀散囊菌中進(jìn)行研究,更未進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究,本實(shí)驗(yàn)不但進(jìn)行了這5種方法的比較,而且對5種方法分別用冠狀散囊菌菌絲體和子囊孢子作為材料,對比了其提取基因組DNA的效果,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明能篩選出較為切實(shí)可行的提取方法。

      溶菌酶在食品工業(yè)、醫(yī)學(xué)和酶工程中應(yīng)用十分廣泛[10]。在DNA的提取中主要應(yīng)用在細(xì)菌中進(jìn)行輔助破壁,如金黃色葡萄球[11]、白色瘤胃球菌[12]等。其中三種酶法提取DNA中,溶菌酶破壁法效果較好,其DNA收獲量較其他酶法也稍高,我們認(rèn)為這主要與溶菌酶的作用及特點(diǎn)有關(guān),溶菌酶以溶解革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁而具有溶菌作用,原因在于它能水解N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1.4糖苷鍵。溶菌酶發(fā)揮溶菌作用的最適酸度在 pH 8.0 左右,溶菌酶在 pH 1.2 ~11.3 的廣泛范圍內(nèi)劇烈變化時都沒有發(fā)現(xiàn)溶菌酶活性任何改變,因此溶菌酶對酸堿度的變化不敏感。在堿性范圍時,穩(wěn)定性較差。溶菌酶的熱變性是可逆的,其變性溫度一般不高于70℃,溶菌酶是相當(dāng)穩(wěn)定的[13]。但冠狀散囊菌是真菌,其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性細(xì)菌顯著不同,從試驗(yàn)結(jié)果看,其DNA收獲量遠(yuǎn)較SDS法的低,很可能是溶菌酶裂解法不能使真菌細(xì)胞壁裂解充分,基因組DNA釋放不充分,同時也導(dǎo)致去除蛋白質(zhì)及苯酚不徹底。

      纖維素酶由多種水解酶組成的一個復(fù)雜酶系,自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶。習(xí)慣上,將纖維素酶分成三類:C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是對纖維素最初起作用的酶,破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。Cx酶是作用于經(jīng)C1酶活化的纖維素、分解β-1,4-糖苷鍵的纖維素酶。β葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖[14,15]。其纖維素酶對底物的最適作用溫度為45℃,最適 pH 值為 4.5 - 5.0[16]。纖維素酶在環(huán)境、藥品、食品、飼料、釀酒、洗滌劑工業(yè)和石油開采等方面都有很好的應(yīng)用[16],纖維素酶預(yù)處理能明顯提高植物的破壁效果[17,18]。

      果膠酶是分解果膠的一個多酶復(fù)合物,通常包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶。通過它們的聯(lián)合作用使果膠質(zhì)得以完全分解。天然的果膠質(zhì)在原果膠酶作用下,轉(zhuǎn)化成水可溶性的果膠;果膠被果膠甲酯水解酶催化去掉甲酯基團(tuán),生成果膠酸;果膠酸經(jīng)果膠酸水解酶類和果膠酸裂合酶類降解生成半乳糖醛酸。但作用pH 2.5-6.0較為窄,且最適作用pH 3.5,作用溫度為15~55℃左右。最適作用溫度為50℃。目前果膠酶在食品、紡織、醫(yī)藥、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)、飼料等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[19]。

      我們用上述溶菌酶、纖維素酶、果膠酶三種酶都能有效提取真菌DNA,且其提取效果有一定的差異,但差異不大,我們認(rèn)為這三種酶各自的優(yōu)化作用條件應(yīng)該有差異,但我們統(tǒng)一用一種條件進(jìn)行裂解,顯然不能說明三種酶的作用全貌,相對來講溶菌酶的稍好,可能是該酶的適應(yīng)pH值相對較廣,而纖維素酶、果膠酶屬于酸性適應(yīng)裂解酶。

      CTAB法主要用于植物DNA的提取[20]以真菌菌絲體為材料的DNA提取也有一些成功報(bào)道[21-24],但提取質(zhì)量亟待改善,主要原因是真菌多糖、多酚等次生物質(zhì)的存在使提取的真菌DNA中總殘留多糖雜質(zhì),由于其許多理化性質(zhì)與核酸很相似,因此很難將它們分開。多糖的污染,不僅使DNA定量不準(zhǔn),還直接影響下游反應(yīng)酶的活性[25]。正因此很多學(xué)者在運(yùn)用該法時往往加以改進(jìn),如楊同文等[26]采用CTAB結(jié)合DNA凝膠回收試劑盒提取食用菌DNA來除去雜質(zhì)污染。我們的實(shí)驗(yàn)證明CTAB法提取冠狀散囊菌基因組DNA在五種方法中效果確實(shí)是最差的,說明其提取方法還有待優(yōu)化和改進(jìn)。

      SDS法廣泛用于植物、動物、微生物的DNA提?。?7-29],其中特別是對多糖含量豐富的植物效果尤為明顯,如李靜等對石斛基因組DNA研究[30],本研究證實(shí)對冠狀散囊菌基因組DNA提取效果是最好的,不但DNA收獲率較高,而且其紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810DASPC)DNA的純度檢測也證實(shí)其純度較其他方法的好。

      本實(shí)驗(yàn)中,所用的材料冠狀散囊菌菌絲體和子囊孢子,五種方法在提取DNA時也表現(xiàn)出一定的差異,但都證實(shí)用冠狀散囊菌菌絲體作為DNA提取材料優(yōu)于用子囊孢子。具體體現(xiàn)在DNA的收獲量、純度上(見表1),筆者認(rèn)為,導(dǎo)致該差異出現(xiàn)的主要原因是冠狀散囊菌菌絲體細(xì)胞壁和子囊孢子子囊壁的結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致,冠狀散囊菌菌絲體提取效果普遍優(yōu)于對應(yīng)的子囊孢子,說明菌絲體結(jié)構(gòu)上更容易破壁而釋放基因組DNA。另外DNA的存在環(huán)境致使細(xì)胞多糖、多酚等非DNA組分影響其DNA提取也是不可忽視的一個重要因素,很顯然,相關(guān)的研究尚需進(jìn)一步的深入。

      綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合成本因素我們建議用冠狀散囊菌菌絲體作為材料,采用SDS法進(jìn)行基因組DNA提取,能穩(wěn)定獲得含蛋白質(zhì)少、降解不明顯、產(chǎn)量較高的基因組DNA。

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