鄭育宏

（惠州博羅中等專業(yè)學(xué)校，廣東 惠州 516100）

pH影響七彩神仙魚蛋白酶活性的研究

鄭育宏

（惠州博羅中等專業(yè)學(xué)校，廣東 惠州 516100）

PH是影響蛋白酶活性顯著因素之一。本人采用Folin—pHenol試劑法，以酪蛋白為底物，測(cè)定了七彩神仙魚胃、中腸、后腸等組織蛋白酶活性、最適PH值，初步探討了PH對(duì)七彩神仙魚胃、中腸、后腸蛋白酶的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，胃蛋白酶PH在2.0，此時(shí)酶比活力為127.8；而中腸蛋白酶最適PH為7.8，最高酶活力比為62.5；后腸最適PH為7.8，最高酶比活力為59.6。另外，胃蛋白酶活性顯著高于腸的蛋白酶活性。本文可為研究?jī)?yōu)化觀賞魚的養(yǎng)殖技術(shù)提供參考。

七彩神仙魚；PH；蛋白酶；活性

七彩神仙魚（SympHysodon discus）俗稱鐵餅、七彩燕，屬慈鯛科（Cichidae）魚類，是名貴的熱帶觀賞魚之一，它原產(chǎn)地為南美洲的亞馬遜河流域。因其體態(tài)雍容華麗及獨(dú)特的護(hù)幼和撫育行為，倍受觀賞魚愛好者的青睞，被冠為“熱帶觀賞魚之帝”。但七彩神仙魚難于養(yǎng)殖，尤其在苗種階段，人工飼料滿足不了其需求。有關(guān)于七彩神仙魚生物學(xué)特性、養(yǎng)殖和繁殖技術(shù)的研究已有一些報(bào)道，但關(guān)于七彩神仙魚營(yíng)養(yǎng)和生理生態(tài)方面，飼料對(duì)七彩仙魚生長(zhǎng)、消化吸收影響的研究報(bào)道少見。消化酶活性與環(huán)境因素有密切關(guān)系，其中PH是主要影響因素，筆者對(duì)七彩神仙魚的蛋白酶活性進(jìn)行了系列研究，期望在七彩神仙魚飼養(yǎng)過程中對(duì)餌料選擇、配合餌料的研制等方面有所幫助，提高七彩神仙魚的成活率，可為研究?jī)?yōu)化觀賞魚的養(yǎng)殖技術(shù)提供參考。

1 .材料與方法

1.1 材料與樣品制備

試驗(yàn)用的七彩神仙魚淡水養(yǎng)殖，均健康無害。平均體全長(zhǎng)12cm，體重為51.6g，取回后在水族箱暫養(yǎng)，饑餓24小時(shí)后，取魚稱重解剖，取出胃、腸（實(shí)驗(yàn)時(shí)分中腸和后腸），剔除附屬物，剖開胃、腸，用冷卻去離子水（4℃）沖洗，濾紙吸干，稱重，按樣品重的20倍分次加進(jìn)約pH＝7.0的冷卻去離子水，高速搗勻，用冷凍離心機(jī)經(jīng)4000 r/min離心30 min，取上清液于4℃冰箱保藏備用，12小時(shí)內(nèi)分析完畢。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取試管6支，標(biāo)號(hào)0、1、2、3、4、5。分別向6支試管中加入0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液（50μg/ml）。然后，各試管用蒸餾水補(bǔ)足到1.00 ml，再各加0.55M碳酸鈉溶液5 ml，最后各管依次加入福林－酚試劑0.5 ml，搖勻，置30℃恒溫水浴顯色15分鐘，用722型分光光度計(jì)在680 nm處測(cè)光吸收值。以酪蛋白的微克數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 蛋白酶活性測(cè)定

蛋白酶活性的測(cè)定采用福林－酚試劑法。先作實(shí)驗(yàn)組：用0.5%酪蛋白溶液2 ml為底物（保持緩沖PH值為7.5），在30℃恒溫水浴中預(yù)熱5分鐘后加入預(yù)熱（30℃，5分鐘）的酶液1 ml，緩沖液2 ml，立即計(jì)時(shí)。反應(yīng)10分鐘后，由水浴中取出，并立即加入10%的三氯乙酸溶液3 ml，放置15分鐘后，用濾紙過濾，取濾液1 ml。加入0.55 mol/L碳酸鈉5 ml，再加入福林－酚試劑1 ml，30℃水浴中顯色15 min。另外，同時(shí)做空白對(duì)照：先取0.5%酪蛋白溶液2 ml，緩沖液2 ml，先加入3 ml10%的三氯乙酸溶液，然后再加入酶液1 ml，以下操作同試驗(yàn)組。用722型分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)為680 nm條件下測(cè)定各自的光密度值。

在資料中顯示，胃蛋白酶最適PH測(cè)定為1.5～6.5，所以對(duì)胃蛋白酶的測(cè)定時(shí)，只測(cè)定PH為2.2～6.2時(shí)的活性，設(shè)置了11個(gè)梯度；而腸蛋白酶在PH4.5～8.5，所以設(shè)置了9個(gè)梯度，測(cè)定范圍為4.6～7.8的活性。

1.4 蛋白酶比活力定義

蛋白酶活力單位：在 30℃水浴下，粗酶液每毫克蛋白每分鐘水解所產(chǎn)生酪氨酸的毫克數(shù)。

式中：△O.D為樣品管光密度值——空白管光密度值

ε為每個(gè)樣品管中蛋白的用量（毫克）

t為保溫時(shí)間（分鐘）

2 .結(jié)果

以PH值為2.0～8.0的0.2 mol/L磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液分別測(cè)定胃、腸組織蛋白酶最適PH值，并測(cè)定各組織在不同 PH條件下蛋白酶的活性。所得數(shù)據(jù)用 Excel及SPSS軟件進(jìn)行處理。

表2 PH對(duì)胃、腸蛋白酶活性的影響

圖2 PH對(duì)七彩神仙魚蛋白酶活性的影響

3 .分析與討論

3.1 蛋白酶的分布特點(diǎn)

根據(jù)表2可得，七彩神仙魚的胃蛋白酶活性的最適PH值為2.2，此時(shí)它最高酶比活力為127.8；中腸蛋白酶活性的最適PH值為7.8，此時(shí)它最高比活力為62.5；而后腸蛋白酶活性的最適PH值為7.8，此時(shí)它最高比活力為59.6。綜合上面的結(jié)果，可以看出胃組織蛋白酶活力顯著高于腸組織蛋白酶活力。這一分布特點(diǎn)說明飼料蛋白質(zhì)的消化主要集中于胃。腸也有一些消化功能，但相對(duì)于胃而言，比較弱，作用還是次要的。由此可得，胃蛋白酶在飼料蛋白質(zhì)的消化吸收過程中起較大作用，這一結(jié)果與有胃魚消化特性相似。這樣，如何讓蛋白質(zhì)飼料停留在胃中的時(shí)間延長(zhǎng)，讓魚類能充分地消化食物中的蛋白質(zhì)，提高飼料的利用率，才能節(jié)省飼料成本，提高魚的生長(zhǎng)發(fā)育速度。

魚類消化器官組織的結(jié)構(gòu)和消化機(jī)能是與其的食性相適應(yīng)的，消化器官的不同部位，因其所承擔(dān)的消化機(jī)能不同，其消化酶活性也就會(huì)呈現(xiàn)明顯的差異。消化系統(tǒng)中不同部位蛋白酶活性的最適PH也就會(huì)呈現(xiàn)不同值。七彩神仙魚胃蛋白酶活性中2.2以下最強(qiáng)，在中性和堿性下則失活，這一結(jié)果與尾崎久雄等報(bào)道基本一致，中、后腸蛋白酶最適PH值大致在7.8，偏弱堿性，這與許多有胃魚，如大鱗大麻哈魚、莫桑比克羅非魚、暗紋東方豚的腸蛋白酶最適PH為7.0～9.5是相同的，也與腸道內(nèi)是經(jīng)常保持堿性的相一致。而七彩神仙魚腸蛋白酶在弱酸性的條件，并未失活，比活力不大。

3.2 蛋白酶活性魚消化器官內(nèi)PH相適應(yīng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果現(xiàn)實(shí)，七彩神仙魚蛋白酶的最適PH在2.2以下，腸為7.8，這些消化器官的蛋白酶最適PH與魚體消化器官內(nèi)部環(huán)境是相適應(yīng)的。如動(dòng)物體內(nèi)胃為酸性，而腸液一般為堿性。各組織相應(yīng)的蛋白酶最適PH值都處于相對(duì)應(yīng)的PH范圍中，這有利于充分發(fā)揮蛋白酶的作用。

魚的消化道不同部位上的特定環(huán)境，是導(dǎo)致七彩神仙魚胃、腸蛋白酶活性最適PH差異和適應(yīng)PH范圍較窄的原因，也是有胃魚的共同特點(diǎn)。七彩神仙魚的中腸蛋白酶比后腸蛋白酶活性稍高，這可能是由于中腸接近胃的緣故。但胃蛋白酶活性明顯高于腸蛋白酶活性，這一結(jié)果與尼羅羅非魚相同，這一結(jié)果進(jìn)一步證明胃可能就是七彩神仙魚消化蛋白質(zhì)的主要組織，另一方面，也反映了胃組織蛋白酶可能在飼料蛋白質(zhì)消化上發(fā)揮更重要的作用。

3.3 蛋白酶活性魚食性的關(guān)系

七彩神仙魚蛋白酶最高比活力為127.8，處于一個(gè)比較高的水平。不同食性的魚類，其蛋白酶活性差異比較大，但它們之間存在一個(gè)明顯的規(guī)律性，即雜食性魚類高于慮食性魚類，慮食性魚類又高于草食性魚類。一般來說七彩神仙魚是個(gè)雜食魚種，但它對(duì)飼料也是非常挑剔的，一般的干飼料是不太能吸引七彩神仙魚索食，現(xiàn)在一般而言喂食的飼料是紅蟲、豐年蝦和牛心漢堡，而最吸引七彩神仙魚的是紅蟲。這就體現(xiàn)了七彩神仙魚，對(duì)飼料蛋白質(zhì)水平要求稍高，其蛋白酶活性比慮食性、草食性的魚類要高，是與這一點(diǎn)相適應(yīng)的。

另外魚類蛋白酶活性與餌料更密切，隨飼料中蛋白質(zhì)的增多而相應(yīng)魚體中的蛋白酶也相應(yīng)會(huì)增多，黃耀桐等指出，如果在飼料中蛋白質(zhì)增加在32%～40%范圍內(nèi)，腸蛋白酶活性都將隨飼料中蛋白質(zhì)含量的增高而升高。

由于食性的不同，消化道的構(gòu)造差異很大。七彩神仙魚的消化系統(tǒng)比較簡(jiǎn)單，胃很小，腸道比較細(xì)長(zhǎng)，這影響了蛋白酶的數(shù)量。若以胃蛋白酶比活力為100%，則中腸蛋白酶比活力為48.90%，后腸蛋白酶比活力為46.63%。這些數(shù)據(jù)證明，胃蛋白酶活力比腸蛋白酶活力明顯要高，這與其體內(nèi)消化器官結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)相適應(yīng)的。

3.4 底物與蛋白酶活性的關(guān)系

七彩神仙魚的消化組織蛋白酶的最適PH是以酪蛋白為底物測(cè)定的，反映了酪蛋白與組織消化酶活力的關(guān)系，但飼料蛋白質(zhì)來源于很多種，這些蛋白質(zhì)如何影響酶活力需作進(jìn)一步研究。研究七彩神仙魚蛋白酶的活性，可作為日糧蛋白質(zhì)需要的參考依據(jù)。

4 .小結(jié)

七彩神仙魚不同消化器官各自所適應(yīng)的PH差異很大，胃內(nèi)為強(qiáng)酸環(huán)境，腸內(nèi)為弱堿性環(huán)境，這是有胃魚的共同特點(diǎn)，而試驗(yàn)結(jié)果為，胃蛋白酶的最適PH在2.2以下，此時(shí)酶比活力為127.8；腸蛋白酶的最適PH為7.8，其中中腸最高酶比活力為62.5，后腸最高酶比活力為59.6。而中腸、后腸的酶比活力稍微有點(diǎn)差異，但差異不大。

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1008-7427（2011）07-0158-02

2011-04-05