孟忠吉 張永紅 李 東 柯昌征 湯守兵 陳 悅△

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院感染科 2.生物醫(yī)學(xué)研究所 (湖北十堰，442000)

人體感染HBV后，病毒、人體的免疫應(yīng)答和肝細(xì)胞三者相互作用，共同影響著乙型肝炎的病程進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸。其中，宿主免疫狀態(tài)是決定乙型肝炎臨床轉(zhuǎn)歸和治療療效的最主要因素［1］。研究表明，慢性肝炎患者體內(nèi)DC免疫指標(biāo)的下降與HBV感染常同時(shí)存在，提示HBV感染慢性化與DC缺陷有關(guān)［2］。本研究探討HBV的病毒粒子和抗原成分對(duì)DC細(xì)胞成熟和功能的影響，探索HBV相關(guān)DC細(xì)胞功能缺陷在乙型肝炎慢性化中的地位。

1 材料與方法

1.1 材料 L929細(xì)胞和小鼠腦心肌炎病毒 (EMCV)為本室保存。HBV-Met細(xì)胞培養(yǎng)上清 (德國(guó)杜伊斯堡-埃森大學(xué)醫(yī)學(xué)院胃腸肝病科Dr.Wu提供)含HBV病毒粒子和 HBsAg、HBeAg［3］。細(xì)菌脂多糖 (LPS)為Invivogen公司產(chǎn)品;重組人粒細(xì)胞-單核細(xì)胞克隆刺激因子 (rh GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(rh IL-4)，重組人腫瘤壞死因子-α (TNF-α)為Peprotech公司產(chǎn)品;FITC-標(biāo)記的抗小鼠CD-Ⅱc，PE-標(biāo)記的抗小鼠MHCII、CD40、CD80、CD86單克隆抗體購自BD公司。

1.2 DC細(xì)胞分離培養(yǎng) 小鼠骨髓來源BM-DC的分離參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。分離C57BL/6小鼠的股骨骨髓細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，PBS洗3遍后，懸浮于RPMI 1640中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后，棄懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞置于完全DC培養(yǎng)基 (RPMI 1640，10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，10 ng/ml rhIL-4，5 ng/mL rhGM-CSF)。

1.3 DC細(xì)胞的成熟 DC細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，加入1μg/mL的LPS，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)基中分別加入HBV-Met細(xì)胞培養(yǎng)2天、12天的上清 (HBV-Met d2，HBV-Met d12)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)。分別收集DC細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清用于后續(xù)檢測(cè)。

1.4 DC細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集懸浮的DC細(xì)胞，用FACS標(biāo)記液PBA(PBS+1%BSA+0.02%疊氮鈉)調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，加入離心管，100 μl/管，分別按直接標(biāo)記法或間接標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀 (FACS calibur，BD公司)檢測(cè)細(xì)胞表面表型。

1.5 病毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) DC細(xì)胞上清中的IFN水平采用病毒保護(hù)試驗(yàn)方法檢測(cè)［4］。L929細(xì)胞以5.5×104/孔接種于 96孔板，加入100ul含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞鋪滿孔底。棄上清液，加入100ul RPMI-1640，待檢測(cè)的DC細(xì)胞上清液以1∶2到1∶256稀釋后加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。把EMCV加入到各孔中，37℃，5%CO2再培養(yǎng)24小時(shí)。棄培養(yǎng)基，用含0.1%結(jié)晶紫的20%乙醇固定染色L929細(xì)胞。1個(gè)單位的IFN定義為保護(hù)50%細(xì)胞免受病毒攻擊死亡的能力。

1.6 TNF生物活性分析 DC細(xì)胞上清中的TNF水平采用生物活性分析方法檢測(cè)［5］。L929細(xì)胞以5.5×104/孔接種于96孔板，加入100ul含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞鋪滿孔底。棄上清液，加入100ul RPMI-1640含有2μg/ml放線菌素D。待檢測(cè)的DC細(xì)胞上清液以1∶2到1∶256稀釋后加入到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。棄培養(yǎng)基，用含0.1%結(jié)晶紫的20%乙醇固定染色L929細(xì)胞。1個(gè)單位的TNF定義為殺死50%L929細(xì)胞的能力。

2 結(jié)果

2.1 HBV抑制成熟DC細(xì)胞產(chǎn)生IFN的能力 DC細(xì)胞在LPS等刺激下成熟后可以產(chǎn)生高水平的I型干擾素，而在培養(yǎng)基中加入含有HBV病毒粒子和HBsAg、HBeAg等成分的細(xì)胞培養(yǎng)上清后 (Smet d12)，DC細(xì)胞即使同樣受到LPS的刺激，IFN的產(chǎn)量也大幅下降 (圖1)。

圖1 HBV抑制成熟DC細(xì)胞產(chǎn)生IFN的能力

2.2 HBV抑制DC細(xì)胞表面分子的表達(dá) 在DC細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，DC細(xì)胞成熟過程中，使用含HBV的培養(yǎng)基 (Smet d12)，則DC細(xì)胞成熟障礙，表面分子表達(dá)水平受到顯著抑制，而正常的DC細(xì)胞(Smet d2)成熟后高表達(dá)CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ (圖2)。

2.3 HBV抑制成熟DC細(xì)胞產(chǎn)生TNF的能力 DC細(xì)胞在LPS等刺激下成熟后可以產(chǎn)生高水平的TNF，而在培養(yǎng)基中加入含有HBV病毒粒子和HBsAg、HBeAg等成分的細(xì)胞培養(yǎng)上清后 (Smet d12)，DC細(xì)胞即使同樣受到LPS的刺激，TNF的產(chǎn)量也大幅下降 (圖3)。

圖2 HBV抑制DC細(xì)胞表面分子的表達(dá)

圖3 HBV抑制DC細(xì)胞分泌TNF的能力

3 討論

慢性乙型肝炎患者體內(nèi)，HBV的抗原成分和病毒粒子直接或間接抑制免疫應(yīng)答，其中DC細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙是造成免疫耐受的重要原因。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞 (APC)，也是唯一能活化初始T細(xì)胞的APC，在特異性激活初始T細(xì)胞、聯(lián)結(jié)天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮獨(dú)一無二的作用。DC細(xì)胞高表達(dá) Toll樣受體 (TLRs)3、4、7、8、9，相應(yīng)的配體尤其是 TLR3、4、9的配體 Poly(I:C)、LPS和CpG可以激活相應(yīng)的TLR通路，誘導(dǎo)DC細(xì)胞活化，表現(xiàn)為DC細(xì)胞共刺激分子CD80、CD86、CD40和成熟標(biāo)志MHC-I、MHC-II、CD83的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)DC細(xì)胞分泌TNF、IFN等細(xì)胞因子，并且可以誘導(dǎo)自體T細(xì)胞活化［4］。DC的成熟在免疫應(yīng)答中具有重要意義，是激活T細(xì)胞、啟動(dòng)免疫應(yīng)答的必要條件。由于HBV抗原成分抑制DC細(xì)胞的成熟和功能活化，導(dǎo)致DC抗原遞呈能力低下。本研究結(jié)果顯示:在DC細(xì)胞成熟過程中加入HBV病毒粒子和抗原成分，顯著抑制DC細(xì)胞表面共刺激分子和成熟標(biāo)志的上調(diào)表達(dá)，抑制DC細(xì)胞分泌IFN和TNF的能力。提示HBV病毒粒子和抗原成分可以直接抑制DC細(xì)胞的表型成熟和功能活化，從而使DC細(xì)胞不能有效遞呈HBV的抗原給T淋巴細(xì)胞，這可能是形成HBV特異性免疫耐受的重要機(jī)制。

我們前期的研究顯示HBsAg、HBeAg和HBV顆粒均可以不同程度的抑制肝細(xì)胞和肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及DC細(xì)胞等對(duì)于TLR配體的應(yīng)答能力［5］。另外，HBV DNA多聚酶可以抑制IFN信號(hào)通路［6］，HBV可通過前C/C蛋白下調(diào)IFN可誘導(dǎo)的MxA啟動(dòng)子活性或通過HBx蛋白依賴性的蛋白酶的活性抑制等途徑來拮抗宿主的抗病毒效應(yīng)機(jī)制［7］，更重要的是，新生期的感染可能造成抗原特異性T細(xì)胞的中樞缺失或無能。因此，慢性乙肝患者免疫系統(tǒng)不健全、免疫細(xì)胞 (T細(xì)胞、DC)應(yīng)答數(shù)量和質(zhì)量上的不足，加上病毒顆粒和抗原的耐受原作用等因素形成HBV特異性免疫耐受，而這種耐受是導(dǎo)致HBV持續(xù)感染和久治不愈的根源。

國(guó)內(nèi)外研究者一直在探索打破HBV特異性免疫耐受的方法，目前正在進(jìn)行研究的免疫調(diào)節(jié)治療包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 (CIK)［8］、HBV 抗原激活的 DC 疫苗［9］、特異性CTL、HBV多肽疫苗、免疫復(fù)合物疫苗等［10］，大多還處于臨床前研究或臨床試驗(yàn)階段。通過對(duì)DC成熟過程的改變來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，可以增強(qiáng)免疫功能，促進(jìn)慢性乙肝患者病毒控制。我們也開展了DC疫苗和DC-CIK治療乙型肝炎和腫瘤的臨床研究，取得了初步的臨床療效。另一方面，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)特異性siRNA抑制嗜肝病毒基因表達(dá)和復(fù)制后，可以顯著上調(diào)肝細(xì)胞免疫應(yīng)答基因的表達(dá)，增強(qiáng)抗病毒天然免疫功能［11］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi介導(dǎo)的WHV mRNA降解產(chǎn)物可能通過活化PKR和TLR-3、7/8信號(hào)通路，誘導(dǎo)IFN和炎癥因子的產(chǎn)生而活化細(xì)胞天然免疫功能。而且，HBV的基因表達(dá)和復(fù)制被RNAi封閉后，可以解除HBV對(duì)于NF-κB、IRF-3以及ERK信號(hào)通路的抑制，上調(diào)TLR的表達(dá)，恢復(fù)細(xì)胞對(duì)于TLR激動(dòng)劑的反應(yīng)性［3］。因此，慢性乙型肝炎的治療應(yīng)該從抗病毒和調(diào)節(jié)免疫兩個(gè)方面入手，一方面封閉病毒蛋白的表達(dá)，解除HBV特異性耐受;另一方面激活/恢復(fù)天然免疫，輔助增強(qiáng)HBV特異性免疫應(yīng)答。如何充分上調(diào)DC細(xì)胞功能，打破機(jī)體的免疫耐受，是亟待解決的問題。

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