劉 釗，石福忠，楊占秋

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074； 2 武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所，武漢 430071)

柯薩奇病毒(CV)屬小核糖核酸科腸道病毒屬.柯薩奇病毒可引起腦膜炎和輕度麻痹、胸膜痛、肋間痛、呼吸性疾病、結(jié)膜炎以及手足口綜合征[1]. B組柯薩奇病毒是病毒性心肌炎的主要致病因素[2，3]，近年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),柯薩奇病毒尤其是柯薩奇B4病毒(CVB4)在1型糖尿病中起重要作用[4]；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，CVB4的非結(jié)構(gòu)蛋白P2C與人胰島素表面的谷氨酸脫羧酶(GAD)具有同源序列.且無論CVB4在體內(nèi)或體外均可侵犯人胰島B細(xì)胞，導(dǎo)致其合成胰島素功能受損[5,6].因此，研究者正努力尋找一種有效地抗CVB4的藥物.

連花清瘟膠囊是從連翹、金銀花、炙麻黃、炒苦杏仁、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、魚腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草中提取有效成份制成的膠囊劑，內(nèi)容物為棕黃色至黃褐色顆粒，味微苦，氣微香.被稱為是一種超越“達(dá)菲”的抗流感藥物.該藥臨床可治療急性上呼吸道感染，未發(fā)現(xiàn)毒副作用[7]；流感發(fā)病早期使用可明顯減輕癥狀，效果顯著且優(yōu)于維C銀翹片[8].該藥還為一種廣譜抗病毒的中成藥對許多病毒有一定的抑制作用，但其抗柯薩奇病毒的作用卻尚未見報道，故本實驗擬研究中藥連花清瘟膠囊體外抗CVB4的作用機(jī)理，為利用其廣譜抗病毒活性和開發(fā)新的抗CVB藥物提供一定的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù).

1 實驗

1.1 原料、試劑及儀器

1.1.1 藥物

連花清瘟膠囊由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(0911363).精確稱取連花清瘟膠囊內(nèi)含物0.02 g，置于干凈小青瓶中，加入5 mL雙蒸水，配制成終濃度為4000 μg/mL.使用前將此貯存液于0.04～0.06 MPa下滅菌15 min，冷卻后密封置于4℃冰箱中冷藏備用.

1.1.2 細(xì)胞

Hep-2(鼻咽癌)細(xì)胞為武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒研究所保存.細(xì)胞生長液為含10 %新生牛血清的DMEM，細(xì)胞維持液為含2 %新生牛血清的DMEM，常規(guī)加入青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL.

1.1.3 病毒

CVB4于-80 ℃武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所保存，實驗前復(fù)蘇.病毒于Hep- 2細(xì)胞中活化增殖后, 采用Reed-Muench微量法滴定其滴度為10-4.713TCID50/mL,實驗用100 TCID50/mL.

1.1.4 試劑

DMEM為GIBCO公司生產(chǎn)和 MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)為Hyclone公司產(chǎn)品. MTT以不含血清的MEM培養(yǎng)基配制成5 g/L溶液，過濾除菌后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?二甲基亞砜(DMSO)由上海菲達(dá)有限公司提供.新生小牛血清購自三利公司.

1.1.5 主要儀器

Forma Scientific超凈工作臺，美國制造；TGL-16C型高速臺式離心機(jī)，上海安亨科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；OLYMPUS IMT-413型倒置顯微鏡，日本制造；DG3022-A型酶聯(lián)免疫檢測儀，第四軍醫(yī)大學(xué)、國營華東電子管廠聯(lián)合研制.

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物對細(xì)胞的毒性的測定

用胰酶將生長良好的Hep-2細(xì)胞分散成單個細(xì)胞懸液，按1×106個/mL濃度分種于96孔板，每孔0.1 mL. 置37 ℃，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 24 h后棄培養(yǎng)液上清，換含不同濃度的含藥維持液，每孔200 μL. 藥物的終濃度依次為125,250,500,1000,2000,4000,640,800,1600 μg/mL.每種濃度重復(fù)4孔，實驗同時設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照.繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，以MTT(四甲基偶氮唑鹽法)法檢測細(xì)胞存活率.并根據(jù)細(xì)胞存活率，找出藥物對細(xì)胞的最大無毒濃度范圍.

1.2.2 細(xì)胞活性測定(MTT染色法)

根據(jù)Mosmann建立的MTT法測定細(xì)胞活性.棄培養(yǎng)上清液，每孔加5 mg/mL MTT的不含血清的DMEM 50 μL，37 ℃, 5 % CO2孵育4～6 h, 黃色的MTT被活細(xì)胞的線粒體脫氫酶還原成藍(lán)色的甲簪結(jié)晶，小心吸出MTT, PBS洗3次，每孔加50 μL DMSO終止反應(yīng)，振蕩混勻, 在15 min內(nèi)甲簪結(jié)晶被溶解,在波長570 nm下測定吸光度OD值. OD值與活細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān).

1.2.3 藥物對CVB4生物合成的抑制作用的測定

于已長成單層的Hep-2細(xì)胞96孔板上，每孔接種50 μL的100 TCID50的CVB4病毒液，于37 ℃吸附90 min，棄病毒上清液.根據(jù)細(xì)胞毒性實驗的結(jié)果，在藥物無毒濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的含藥維持液每孔0.2 mL，藥物濃度依次為100,200,400,800,1600 μg/mL；同時設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照、陽性藥物病毒唑?qū)φ?每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),約在病毒對照CPE為 +++～++++ 時棄培養(yǎng)液上清液，用MTT法檢測病毒抑制率,并計算藥物對CVB4的病毒抑制率.

1.2.4 藥物抗病毒吸附實驗

分別將不同濃度的連花清瘟膠囊加入Hep-2單層細(xì)胞孔中, 37℃作用6 h,棄上清液,再加 100 TCID50/mL滴度的CVB4100 μL/孔, 37 ℃吸附90 min后,棄上清液,加細(xì)胞維持液,37 ℃、5 % CO2培養(yǎng),逐日觀察細(xì)胞病變. 實驗同時設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照.

1.2.5 藥物直接滅活病毒實驗

將100 TCID50/mL滴度的CVB4與不同濃度的連花清瘟膠囊4℃作用6 h.反應(yīng)體系為200 μL ，含100 μL的100 TCID50/mL滴度的CVB4和100 μL的藥物,并保證藥物的終濃度與藥效學(xué)實驗相同.然后將混合液接種于單層Hep-2細(xì)胞中,孵育1.5 h后，換用2 % DMEM培養(yǎng)液維持細(xì)胞生長，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng),逐日觀察CPE. 實驗同時設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照.

1.2.6 計算公式和分析方法

CPE記錄方法：“-”表示無CPE; “+” 表示有CPE，且“+” 、“++”、 “+++” 、“++++” 依次表示25 %、50 %、75 %、100 %的細(xì)胞出現(xiàn)CPE.

細(xì)胞存活率 =

(藥物組平均OD570/細(xì)胞對照組平均OD570)×100%,

病毒抑制率=

1)結(jié)合細(xì)胞毒性實驗和藥物抗病毒實驗的結(jié)果，用統(tǒng)計軟件SPSS11.5的Probit回歸法計算藥物半數(shù)毒性濃度TC50和半數(shù)有效濃度IC50,得到藥物治療指數(shù)(TI= TC50/ IC50).采用治療指數(shù)作為評價指標(biāo)衡量各藥物對病毒抑制的效力.

2)采用直線相關(guān)分析，觀察中藥連花清瘟膠囊不同劑量與細(xì)胞存活率、病毒抑制率等之間是否存在直線關(guān)系，并求出直線回歸方程和相關(guān)系數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物毒性的效果

中藥連花清瘟膠囊的不同濃度對細(xì)胞的毒性結(jié)果見表1.通過光鏡觀察, 連花清瘟膠囊對Hep-2細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)為：細(xì)胞變小、粘連、破碎、脫落、胞漿內(nèi)顆粒增加，折光性增強(qiáng).

由表1可知，連花清瘟膠囊的TC50>1000 μg/mL,說明其安全系數(shù)大. 當(dāng)藥物的TC50<500 μg/mL時，細(xì)胞存活率> 50 %；當(dāng)TC50<125 μg/mL時細(xì)胞存活率>80 %. 當(dāng)細(xì)胞經(jīng)較高濃度的藥物作用后，死亡細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞存活率降低. 經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與細(xì)胞存活率之間存在直線關(guān)系，P=0.001. 連花清瘟膠囊的直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=82.015-0.024x，r=-0.95.經(jīng)計算，連花清瘟膠囊對Hep-2細(xì)胞的TC50為1097.28 μg/mL.接種藥物前后Hep-2細(xì)胞形態(tài)變化見圖1.

表1 連花清瘟膠囊對Hep-2細(xì)胞的毒性作用

連花清瘟膠囊TC50=1000 μg/mL

b)正常細(xì)胞

2.2 藥物抗病毒生物合成的效果

給藥后24～48 h，鏡下觀察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)病毒對照孔出現(xiàn)明顯的CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、脫落、碎裂，胞漿內(nèi)顆粒增多，折光性增強(qiáng)(見圖2).

a )感染細(xì)胞

b)正常細(xì)胞

試驗孔與病毒對照孔有明顯的差別，試驗孔存活細(xì)胞多于病毒對照孔，用MTT法按公式計算連花清瘟膠囊對CVB4的抑制率，結(jié)果見表2.

由表2可知，當(dāng)藥物濃度為100～1600 μg/mL時，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，病毒抑制率升高.經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與病毒抑制率間有直線關(guān)系，P<0.01，其直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=14.155+0.023x，r= 0.883；當(dāng)藥物濃度>500 μg/mL時，對CVB4細(xì)胞病變抑制程度>50 %，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗病毒活性，說明連花清瘟膠囊可明顯抑制CVB4在Hep-2細(xì)胞內(nèi)的生物合成.

2.4 藥物抗病毒吸附的效果

給藥后24～48 h內(nèi)，鏡下觀察細(xì)胞病變，發(fā)現(xiàn)病毒對照孔出現(xiàn)明顯的CPE，而各給藥的不同濃度的試驗孔均有明顯多于病毒對照孔的存活細(xì)胞，用MTT法按公式計算連花清瘟膠囊對CVB4的抑制率，結(jié)果見表3.

表2 連花清瘟膠囊的抗CVB4生物合成作用

表3 連花清瘟膠囊的抗CVB4吸附細(xì)胞作用

由表3可知，當(dāng)藥物濃度100～1600 μg/mL時，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，病毒抑制率升高.經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與病毒抑制率間有直線關(guān)系，P<0.05，其直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y= 26.083+0.057x，r= 0.912；當(dāng)藥物濃度250 μg/mL時，對CVB4細(xì)胞病變抑制程度可達(dá)50 %，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗病毒活性，說明連花清瘟膠囊可明顯阻止病毒吸附細(xì)胞，從而預(yù)防CVB4對Hep-2細(xì)胞的感染.將藥物抗病毒生物合成與抗病毒吸附的IC50相比，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=7114.615，P<0.01，有顯著性差別；將兩者的TI相比，F(xiàn)=43.74，P=0.003，P<0.01，說明連花清瘟膠囊預(yù)防CVB4感染細(xì)胞作用優(yōu)于其抗CVB4在細(xì)胞內(nèi)的生物合成作用.

2.4 藥物直接滅活病毒的效果

按實驗方法將藥物與病毒混合6 h后再作用于細(xì)胞,逐日觀察細(xì)胞病變.發(fā)現(xiàn)各給藥的不同濃度的試驗孔均有明顯多于病毒對照孔的存活細(xì)胞，用MTT法按公式計算連花清瘟膠囊對CVB4的抑制率，結(jié)果見表4.

表4 連花清瘟膠囊的直接殺滅CVB4病毒作用

由表4可知，當(dāng)藥物濃度為6.25～100 μg/mL時，隨藥物濃度增加，其抗病毒活性增強(qiáng)，病毒抑制率升高.經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與病毒抑制率間有直線關(guān)系，P<0.05，其直線方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y= 27.182+0.055x，r= 0.921；當(dāng)藥物濃度為500 μg/mL時，對CVB4細(xì)胞病變抑制程度可達(dá)近65 %，表現(xiàn)較強(qiáng)的抗病毒活性，說明連花清瘟膠囊具有殺滅CVB4的作用.經(jīng)方差分析，藥物直接殺滅病毒作用.將其與抗病毒生物合成的IC50相比，F(xiàn)=4.234，P=0.109，P>0.05，無明顯差別；兩者TI 相比，F(xiàn)=0.015，P=0.908，P>0.05，無明顯差別.將直接殺滅作用與抗病毒吸附作用的IC50相比，F(xiàn)=6771.744，P<0.01，有顯著性差別; 兩者TI 相比，F(xiàn)=42.135，P=0.003，P<0.01，有明顯差別.說明藥物的直接殺滅CVB4病毒作用與其抗病毒生物合成作用相似，而弱于其抗病毒吸附細(xì)胞作用.

3 結(jié)論

中藥連花清瘟膠囊具有體外抗CVB4的作用及直接滅活CVB4作用，阻斷CVB4吸附細(xì)胞作用和抑制CVB4在細(xì)胞內(nèi)生物作用，其中抗CVB4吸附細(xì)胞即預(yù)防病毒感染作用最強(qiáng).

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