徐婷婷，高明，呂淑霞*，于曉丹，張忠澤，陳宏權(quán)

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866;2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽(yáng)110016;3.東北制藥總廠Vc公司，遼寧沈陽(yáng)110028)

維生素C又稱L-抗壞血酸(L-Ascorbic Acid)，作為人體必需的維生素及抗氧化類物質(zhì)，受到人們普遍關(guān)注，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域，需求量與日俱增［1］。上世紀(jì)70年代我國(guó)學(xué)者尹光琳發(fā)明了“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)Vc［2］，該方法工藝簡(jiǎn)單、成本低、“三廢”少，已成為我國(guó)Vc工業(yè)生產(chǎn)的主要方法［3］。其中第2步將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為Vc前體2-酮基-L-古龍酸，由產(chǎn)酸菌—氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)和伴生菌—巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)共同完成。產(chǎn)酸菌單獨(dú)生長(zhǎng)和傳代困難，對(duì)伴生菌依賴性較強(qiáng)。目前已知具有伴生能力的菌屬有芽胞桿菌、假單胞菌、歐文氏菌、微球菌、熒光桿菌、變形菌、腸桿菌和酵母菌［4］等，但由于伴生能力較差，促產(chǎn)酸不穩(wěn)定，菌株易污染等多方面因素，生產(chǎn)中常用的依然是巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)，菌種較單一。本文以短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)HJ-04作為伴生菌與產(chǎn)酸菌搭配，發(fā)現(xiàn)其能更好地促進(jìn)產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化［5］后新菌系的產(chǎn)酸量進(jìn)一步提高，產(chǎn)酸周期縮短，具有良好的科研價(jià)值及應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)B2980和氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)，由東北制藥總廠提供。短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)HJ-04由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2培養(yǎng)基(g/L)①種子培養(yǎng)基:山梨糖20，葡萄糖2，尿素1，玉米漿5，CaCO31，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃滅菌30 min;②發(fā)酵培養(yǎng)基:優(yōu)化前:山梨糖80(單獨(dú)滅菌)，尿素12，玉米漿10，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃滅菌30 min。優(yōu)化后:山梨糖94.95(單獨(dú)滅菌)，尿素11.99，玉米漿14.13，KH2PO41，MgSO40.2，CaCO35，用H2O定容到1 L;pH 6.7，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)①混合菌種子培養(yǎng):150 mL三角瓶裝液量20 mL，向混合菌斜面中加入少量無(wú)菌水，刮下菌苔并混勻。吸取1 mL菌液接種到種子培養(yǎng)基中，29℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h;②混合菌發(fā)酵培養(yǎng):150 mL三角瓶裝液量10 mL，吸取1 mL產(chǎn)酸菌種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，29℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 2-KGA含量的測(cè)定取2 mL發(fā)酵液于試管中，加入2 mL 7 mol/L H2SO4，100℃煮沸30 min。冷卻后以1%淀粉作指示劑，用0.05 mol/L I2溶液滴定至藍(lán)色為反應(yīng)終點(diǎn)。按以下公式計(jì)算2-KGA生成量。

其中，M為I2溶液濃度(0.05 mol/L×2);V為I2溶液消耗體積(mL);A為2-KGA轉(zhuǎn)化為Vc的轉(zhuǎn)化率(%)(以63.1%計(jì)算);B為所取發(fā)酵液體積(mL);0.907 2為Vc分子量/2-KGA分子量;0.088 06為1 mL I2溶液相當(dāng)于8.806 mg Vc［6］。

1.2.3 響應(yīng)面分析使用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析［7-8］。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)①單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì):其他因素不變，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)L-山梨糖、尿素、玉米漿、碳酸鈣分別設(shè)計(jì)5水平的單因素試驗(yàn)，接種后，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，每組重復(fù)3次，測(cè)定2-KGA含量，并計(jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率，分析各因素對(duì)混菌發(fā)酵產(chǎn)酸的影響;②Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì):除碳源、氮源外，混菌生長(zhǎng)產(chǎn)酸還需要多種無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因子，利用Plackett-Burman試驗(yàn)可有效篩選對(duì)產(chǎn)酸影響顯著的因素，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。根據(jù)文獻(xiàn)記載［9-10］，選擇L-山梨糖、尿素、玉米漿、KH2PO4、MgSO4、CaCO36個(gè)因素作為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)12組的Plackett-Burman試驗(yàn)，接種后，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定2-KGA含量，重復(fù)3次，分析數(shù)據(jù)篩選顯著影響因子，各因素水平選擇見表1;③響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì):篩選出顯著影響因子后，以L-山梨糖、尿素、玉米漿濃度為自變量，2-KGA產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)3因素3水平的17組試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以產(chǎn)酸量最大值對(duì)應(yīng)的各因素濃度作為自變量中心點(diǎn)，利用公式xi=(Xi-X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼，其中xi為自變量編碼值，Xi為自變量真實(shí)值，X0為中心點(diǎn)處自變量真實(shí)值，ΔX為自變量變化步長(zhǎng)，編碼水平見表2。發(fā)酵液接種后，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定2-KGA含量，重復(fù)3次，進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同伴生菌對(duì)產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的影響

以實(shí)驗(yàn)室篩選的短小芽胞桿菌HJ-04和工業(yè)生產(chǎn)用菌株巨大芽胞桿菌B2980作為伴生菌分別與氧化葡萄糖酸桿菌搭配，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KGA)量隨時(shí)間變化(圖1)。結(jié)果顯示，HJ-04與B2980相比能夠更好的促進(jìn)產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸，產(chǎn)酸量提高26%，產(chǎn)酸終點(diǎn)提前12 h，具有重要應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步提高2-KGA產(chǎn)量，對(duì)新組合菌系發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 不同伴生菌對(duì)產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的影響Fig.1 Effect of different strains on

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要碳源及產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的底物，增加L-山梨糖濃度可增大2-KGA產(chǎn)量，但轉(zhuǎn)化率相應(yīng)降低，發(fā)酵終點(diǎn)延后，發(fā)酵成本增加，且高濃度L-山梨糖抑制2-KGA的合成［11］(圖2)。

尿素作為培養(yǎng)基中的氮源及pH調(diào)節(jié)劑參與菌體的生長(zhǎng)及代謝，隨尿素濃度的增加產(chǎn)酸量呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，尿素濃度過(guò)高，明顯抑制產(chǎn)酸(圖3)。

圖2 L-山梨糖濃度對(duì)新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.2 Effect of L-sorbose concentration on

圖3 尿素濃度對(duì)新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effect of urea concentration on

圖4 玉米漿濃度對(duì)新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of corn steep liquor concentration on

玉米漿含有菌體生長(zhǎng)所需的氨基酸、微量元素和天然物質(zhì)，是產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸不可缺少的組分［12］。隨玉米漿濃度的增加產(chǎn)酸量上升，達(dá)到一定濃度后受其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)限制積累量不再提高(圖4)。

已知伴生菌適合在偏堿性環(huán)境下生長(zhǎng)，CaCO3的主要作用是中和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸，避免pH過(guò)低抑制伴生菌生長(zhǎng)進(jìn)而影響產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)與產(chǎn)酸，適量的碳酸鈣能夠促進(jìn)混合菌系發(fā)酵產(chǎn)酸(圖5)。

圖5 碳酸鈣濃度對(duì)新菌系產(chǎn)酸的影響Fig.5 Effect of CaCO3concentration on

2.3 顯著影響因子的篩選

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of Plackett-Burman

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，各因素正負(fù)效應(yīng)及顯著性評(píng)價(jià)見表4，數(shù)據(jù)表明:在所選水平中，L-山梨糖、尿素、玉米漿為正效應(yīng)因素，增大其濃度促進(jìn)產(chǎn)酸，KH2PO4、MgSO4、CaCO3為負(fù)效應(yīng)因素，濃度過(guò)高抑制產(chǎn)酸。依據(jù)顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)(P＜0.05)，L-山梨糖、尿素、玉米漿均為顯著影響因子，因此選擇此3因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表4 各因素效應(yīng)及顯著性Table 4 Stdized effects and p-value

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)3因素3水平17組的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，其中12組試驗(yàn)為析因點(diǎn)，自變量取值在x1、x2、x3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，其余5組試驗(yàn)為零點(diǎn)，自變量取中心點(diǎn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and result of Box-Behnken design

2.4.2 回歸方程的方差分析對(duì)Box-Behnken

試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到回歸方程:

轉(zhuǎn)化為真實(shí)值得到方程:Y=-369.621 25

其中Y為2-KGA產(chǎn)量預(yù)測(cè)響應(yīng)值，x1、x2、x3為L(zhǎng)-山梨糖、尿素、玉米漿編碼值，X1、X2、X3為L(zhǎng)-山梨糖、尿素、玉米漿真實(shí)值。

對(duì)回歸模型方程(1)進(jìn)行方差分析(表6)可知:二次回歸模型極顯著(P＜0.000 1)。失擬項(xiàng)F=2.44，P=0.204 8＞0.1，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明模型與試驗(yàn)不相符的概率較低，模型可信。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.978 9，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間有良好的擬合度，信噪比為16.192(＞4)，模型可用于預(yù)測(cè)。

分析模型一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)可知:一次項(xiàng)x1、x2、x3和二次項(xiàng)、、對(duì)產(chǎn)酸量影響均顯著(P＜0.05);交互項(xiàng)中，x1x3最為顯著，x1x2次之，x2x3不顯著，說(shuō)明L-山梨糖與玉米漿、L-山梨糖與尿素對(duì)產(chǎn)酸量均會(huì)產(chǎn)生交互影響，尿素與玉米漿交互作用較小。

2.4.3 響應(yīng)面交互作用及優(yōu)化固定3因素之一在中心點(diǎn)，根據(jù)方程(2)做另外2因素對(duì)2-KGA產(chǎn)量的響應(yīng)曲面圖(圖6～8)。由圖可見，各因素曲面坡度均較陡，說(shuō)明L-山梨糖、尿素、玉米漿對(duì)2-KGA產(chǎn)量影響顯著，且產(chǎn)酸量都呈先升后降趨勢(shì)，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。L-山梨糖與尿素對(duì)2-KGA產(chǎn)量的交互影響如圖6所示。尿素濃度較低時(shí)增加L-山梨糖濃度對(duì)2-KGA產(chǎn)量影響較小，產(chǎn)酸量較低，說(shuō)明尿素供應(yīng)不足嚴(yán)重抑制產(chǎn)酸，尿素濃度達(dá)到11 g/L以上，L-山梨糖方向曲面變陡，此時(shí)碳源及底物成為影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵因素，且隨L-山梨糖濃度增大，高濃度尿素對(duì)產(chǎn)酸的抑制作用減弱。固定尿素濃度在中心點(diǎn)，考察L-山梨糖與玉米漿的交互作用(圖7)可知:L-山梨糖與玉米漿均處于較低濃度時(shí)，對(duì)產(chǎn)酸抑制明顯，此時(shí)增加二者任一濃度都可有效提高2-KGA產(chǎn)量，推測(cè)二者含有混菌產(chǎn)酸所必須的類似營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);當(dāng)玉米漿濃度小于14 g/L時(shí)，增加L-山梨糖濃度可持續(xù)提高產(chǎn)酸量，玉米漿濃度達(dá)到14 g/L以上，高濃度L-山梨糖對(duì)產(chǎn)酸呈現(xiàn)抑制作用，即高濃度L-山梨糖與高濃度玉米漿共同抑制產(chǎn)酸。

尿素與玉米漿交互作用對(duì)2-KGA產(chǎn)量的影響見圖8。圖中曲面較規(guī)則，等高線中心近似圓形，交互作用不明顯。

曲面圖均有最高點(diǎn)，求導(dǎo)方程(2)可知響應(yīng)值存在極值點(diǎn)，此時(shí)L-山梨糖、尿素、玉米漿濃度分別為94.95、11.99、14.13 g/L，極值點(diǎn)處2-KGA預(yù)測(cè)產(chǎn)量為75.742 3 g/L。

2.5 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

采用響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)基(L-山梨糖94.95 g/L、尿素11.99 g/L、玉米漿14.13 g/L、KH2PO41 g、MgSO40.2 g、CaCO35 g)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，重復(fù)3次，測(cè)定2-KGA含量隨時(shí)間變化曲線(圖9)，48 h達(dá)產(chǎn)酸終點(diǎn)，2-KGA平均產(chǎn)量76.9 mg/mL，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。相比優(yōu)化前2-KGA產(chǎn)量提高12.31 mg/mL，產(chǎn)酸終點(diǎn)提前，產(chǎn)酸周期縮短約6 h，原料利用率提高，節(jié)約了發(fā)酵時(shí)間及成本。

圖9 優(yōu)化前后新菌系2-KGA產(chǎn)量隨時(shí)間變化曲線Fig.9 Time-course of 2-keto-L-gulonic acid production of new strains before and after optimization

3 討論

以短小芽胞桿菌HJ-04作為Vc二步發(fā)酵中的伴生菌，國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，豐富了伴生菌菌種資源。HJ-04促進(jìn)產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的能力明顯強(qiáng)于工業(yè)生產(chǎn)用菌株—巨大芽胞桿菌B2980，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后，新組合菌系產(chǎn)酸量進(jìn)一步提高，產(chǎn)酸周期縮短，具有廣闊應(yīng)用前景。

多種因素相互作用對(duì)混菌發(fā)酵產(chǎn)酸會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響，考察單因素對(duì)產(chǎn)酸的影響缺乏交互信息，響應(yīng)面法可精確考察各因素對(duì)響應(yīng)值的綜合作用。作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要碳源及產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸的底物，L-山梨糖濃度對(duì)2-KGA產(chǎn)量影響顯著;尿素作為培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)氮源及pH調(diào)節(jié)劑，供應(yīng)不足嚴(yán)重影響產(chǎn)酸;玉米漿含有菌體生長(zhǎng)所需的多種天然物質(zhì)，是產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸不可缺少的組分;CaCO3通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH影響產(chǎn)酸。L-山梨糖、尿素、玉米漿是影響產(chǎn)酸的顯著因素，對(duì)2-KGA合成有交互作用:增加L-山梨糖濃度可減弱高濃度尿素對(duì)產(chǎn)酸的抑制，高濃度L-山梨糖與高濃度玉米漿共同抑制產(chǎn)酸。響應(yīng)面優(yōu)化后確定L-山梨糖、尿素、玉米漿最佳濃度分別為94.95、11.99、14.13 g/L，48 h發(fā)酵終點(diǎn)2-KGA產(chǎn)量達(dá)到76.9 mg/mL，與預(yù)測(cè)吻合，模型可靠。

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