慕娟，問清江*，黨永，李葉昕，張磊，張爍

(1.陜西省微生物研究所，陜西西安710043;2.長安大學環(huán)境科學與工程學院，陜西西安710064)

堿性木聚糖酶在堿性條件下可以將自然資源豐富的半纖維素主要成分木聚糖降解為木糖或多聚木糖，使纖維素加工工藝中的木聚糖得以去除，不僅提高纖維素產(chǎn)品的品質(zhì)，而且克服了傳統(tǒng)化學方法對環(huán)境的污染。從纖維素加工企業(yè)(造紙廠、人造纖維廠)的廢水中選育出高產(chǎn)堿性木聚糖酶菌株20余株。研究發(fā)現(xiàn):雖然這些菌株均為短小芽胞桿菌，產(chǎn)生的堿性木聚糖酶性質(zhì)相同，但是不同的菌株營養(yǎng)需求有所不同。以前對短小芽胞桿菌M-26進行了研究［1-2］，通過對短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)堿性木聚糖酶發(fā)酵條件的研究發(fā)現(xiàn)，兩者在營養(yǎng)需求上有很大不同，后者最顯著的特點是最適氮源為無機氮源，而且在金屬離子方面也有所不同。因此本文對短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)堿性木聚糖酶的發(fā)酵條件進行研究，有利于堿性木聚糖酶產(chǎn)品開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Bacillus pumilus M-11(陜西省微生物研究所)。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)①種子培養(yǎng)基:蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉10，pH 8.0;②基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基:麩皮40，MgSO4·7H2O 0.1，K2HPO44，pH 8.0。

1.1.3 試劑樺木木聚糖(brich wood xylan)，Sigma公司產(chǎn)品;3，5-二硝基水楊酸(DNS)，化學純;其他試劑為市售分析純。

1.1.4 儀器GL-20M冷凍離心機(上海);752紫外分光光度計;722分光光度計;LGJ-冷凍干燥機(河南)。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線及最佳接種齡［3-7］采用比濁法測定菌體生物量，將M-11從斜面接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，于660 nm下測OD值，繪制菌株的生長曲線;選擇不同生長期的液體種子接種于基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液的酶活力，研究接種種齡對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.2 接種量對菌株產(chǎn)酶的影響將種子培養(yǎng)液，分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種發(fā)酵，37℃，振蕩培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液的酶活力，以確定最佳接種量。

1.2.3 初始pH對菌株產(chǎn)酶的影響發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，其他條件不變，研究發(fā)酵初始pH對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.2.4 裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響在300 mL的三角瓶分別裝入30、50、80、100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液的酶活力，研究裝液量對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.2.5 碳源對菌株產(chǎn)酶的影響保持基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中其他成分不變，分別以10 g/L的木糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、木聚糖、麩皮為碳源(麩皮添加量為40 g/L)，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液的酶活力，確定最佳碳源;麩皮以濃度4%、5%、6%、7%、8%分別添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)48 h，以確定最佳碳源濃度。

1.2.6 氮源對菌株產(chǎn)酶的影響保持基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基的其他成分不變，將硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏以1%的濃度分別加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液的酶活力，確定最佳氮源;保持基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基的其他成分不變，將氯化銨以0.8%、0.9%、1.0%、1.1%和1.2%的濃度單獨加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)48 h，確定最適氮源濃度。

1.2.7 無機鹽對菌株產(chǎn)酶的影響保持基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基中其他成分不變，以5 mmol/L的濃度將硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉、氯化鐵(2.5 mmol/L)分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液的酶活力，以0.01%的硫酸鎂為對照，確定無機鹽種類和濃度。1.2.8正交試驗以麩皮濃度、接種量、氮源濃度(NH4Cl)、無機鹽濃度(FeCl3、MgSO4、NaCl)進行6因素3水平的正交試驗，從而確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.9 堿性木聚糖酶活力測定［1，8］

2 結果與分析

2.1 短小芽胞桿菌M-11的培養(yǎng)條件

通過對短小芽胞桿菌M-11培養(yǎng)條件的初步研究，結果見圖1～5，根據(jù)M-11的生長曲線和接種齡對產(chǎn)酶活力的影響，可以得出M-11的最佳接種齡為16 h，接種量為1%，初始pH為8.0，300 mL搖瓶裝液量為50 mL。

圖1 短小芽胞桿菌M-11生長曲線Fig.1 The growth curve of Bacillus pumilus M-11

圖2 接種齡對產(chǎn)酶活力的影響Fig.2 The effect of vaccination age on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

圖3 接種量對產(chǎn)酶活力的影響Fig.3 The effect of inoculum amount on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

圖4 初始pH對產(chǎn)酶活力的影響Fig.4 The effect of initial cultural pH on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

圖5 裝液量對產(chǎn)酶活力的影響Fig.5 The effect of culture volume on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

2.2 碳源對短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)酶的影響

不同碳源對短小芽胞桿菌M-11菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響見表1，菌株M-11以麩皮、木聚糖作為碳源時能夠分泌木聚糖酶，但以木糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉作為碳源時，發(fā)酵液中未檢測到木聚糖酶的存在。說明菌株M-11產(chǎn)木聚糖酶屬于誘導酶，木糖可能對菌株M-11產(chǎn)酶有抑制作用。在確定了最佳碳源為麩皮的基礎之上，進行了麩皮濃度對菌株M-11產(chǎn)酶影響的研究，結果表明:麩皮的最適濃度為7%(圖6)時菌株產(chǎn)酶活力最高，且木聚糖酶活力隨著麩皮比例的增加而上升，這是因為麩皮既是碳源，又是氮源，它除了富含多糖、蛋白質(zhì)外，還含有維生素和礦物質(zhì)等對微生物生長和產(chǎn)酶起到促進作用的因子。

表1 碳源對產(chǎn)酶活力的影響Table 1 The effect of carbon source on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

圖6 麩皮濃度對產(chǎn)酶活力的影響Fig.6 The effect of bran concentration on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

2.3 氮源對短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)酶的影響

以硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏等氮源進行對菌株M-11發(fā)酵產(chǎn)酶的影響研究，從圖7中可以看出，各種氮源對菌株M-11發(fā)酵產(chǎn)酶的影響差異較大，無機氮均優(yōu)于有機氮，且無機氮中的氯化銨對菌體的生長及產(chǎn)酶有較大的促進作用。以氯化銨作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源進行了其濃度對菌株M-11產(chǎn)酶活力的影響(見圖8)，隨著氯化銨濃度的增加產(chǎn)酶活力逐漸增加，但到一定的濃度之后又出現(xiàn)降低的趨勢，最適的氯化銨濃度為1.0%。這一結果表明:氮源種類對微生物產(chǎn)酶有重要影響，氮源濃度對酶的合成和分泌也有很大影響，氮濃度過高或過低對菌體的生長和產(chǎn)酶都是不利的。

2.4 無機鹽對短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)酶的影響

以5 mmol/L的氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、氯化鈉，2.5 mmol/L氯化鐵為發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽進行對菌株M-11產(chǎn)酶活力的影響研究，對照為0.01%的硫酸鎂。無機鹽中氯化鐵、氯化鈉、產(chǎn)酶有促進作用，5 mmol/L的硫酸鎂略低于0.01%的硫酸鎂，通過進一步的濃度試驗得出，硫酸鎂的濃度定為0.01%，氯化鐵的濃度為2.5 mmol/L，氯化鈉的濃度為5 mmol/L。

圖7 氮源對產(chǎn)酶活力的影響Fig.7 The effect of nitrogen source on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

圖8 氯化銨濃度對產(chǎn)酶活力的影響Fig.8 The effect of ammonium chloride concentration on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

圖9 無機鹽對產(chǎn)酶活力的影響Fig.9 The effect of mineral salt on alkaline xylanase production of Bacillus pumilus M-11

2.5 短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)堿性木聚糖酶條件優(yōu)化

短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)堿性木聚糖酶條件優(yōu)化，在前面培養(yǎng)基組分(碳源、氮源和無機鹽)及培養(yǎng)條件單一選擇的基礎之上，按照表2進行麩皮、接種量、氯化銨、氯化鐵、硫酸鎂和氯化鈉進行6因素3水平的正交試驗，結果見表3。從結果級差分析可知，C＞D＞A＞E＞F＞B，其中影響最大的是氮源氯化銨，最好的結果為A1B2C2D3E3F1，由于該結果不在表中之列，所以進行驗證試驗。將表3中最高試驗號5(A2B2C2D3E3F1)、3(A1B3C3D3E3F3)和A1B2C2D3E3F1進行比較，結果(表4)表明:3(A1B3C3D3E3F3)為最佳，短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)堿性木聚糖酶發(fā)酵條件為麩皮5%、氯化銨1.2%、氯化鐵3.5 mmol/L、硫酸鎂0.03%、氯化鈉5 mmol/L、磷酸氫二鉀0.4%，pH調(diào)節(jié)至8.0;接種齡16 h，接種量3%;培養(yǎng)溫度37℃;300 mL搖瓶裝液量50 mL;搖床轉(zhuǎn)速220 r/min;發(fā)酵周期48 h。在該條件下，短小芽胞桿菌M-11產(chǎn)酶活力可達613.28 IU/mL。

表2 產(chǎn)酶條件因素水平Table 2 The condition of alkaline xylanase production factors-levels

表3 正交試驗級差分析/L18(36)Table 3 The rage analysis of orthogonal design/L18(36)

表4 正交實驗驗證結果Table 4 The result of orthogonal experiment

3 討論

芽胞桿菌產(chǎn)堿性木聚糖酶的研究已經(jīng)具有較長的時期，產(chǎn)酶發(fā)酵條件的研究也有較多報道，但營養(yǎng)需求方面與短小芽胞桿菌M-11有所不同，氮源多為有機氮源和無機氮源組合而成，后者對無機氮源的利用優(yōu)于有機氮源。菌株M-11對無機氮源的適用性也不同于以往報道中的菌株，前者的最適無機氮源為氯化銨，而后者多為硫酸銨。

短小芽胞桿菌M-11最高產(chǎn)酶活力為613 IU/mL，比前期研究的短小芽胞桿菌M-26的產(chǎn)酶活力(625 IU/mL)略低，但其在營養(yǎng)需求方面的優(yōu)勢明顯可見，對于堿性木聚糖酶的開發(fā)具有更好的經(jīng)濟性。無機鹽對菌株產(chǎn)酶活力的影響方面也有所不同，一般的產(chǎn)酶菌株的促產(chǎn)酶無機鹽離子中沒有Fe3+，而Fe3+對芽胞桿菌M-11的產(chǎn)酶促進作用遠遠優(yōu)于其他無機鹽離子。原因可能在于Fe3+有促進菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力，但是對于堿性木聚糖酶無促進作用，相反還有弱抑制作用。對于菌株M-11來說，促產(chǎn)酶作用大于抑制酶作用，因此Fe3+可作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽組分，可以通過濃度的控制來解決這一問題，濃度在3.5 mmol/L，既可以滿足產(chǎn)酶需求，又不會殘留于發(fā)酵液中影響堿性木聚糖酶的作用及酶產(chǎn)品的品質(zhì)，關于其中的機理性問題還有待于進一步的研究。

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